Name: Een thermoplasmonische benadering voor het onderzoeken van plasmamembraanherstel in levende cellen en modelmembranen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T13:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Verken de thermoplasmonische punctuurtechniek voor het bestuderen van plasmamembraanherstel in levende cellen en GUVs. Deze methode onthult de cruciale rol van annexine-eiwitten bij membraanreparatie na calciuminflux.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Jesper Nylandsted bedanken voor het leveren van recombinante annexine-eiwitten en plasmiden die coderen voor annexines. Dit werk werd financieel ondersteund door de Deense Raad voor Onafhankelijk Onderzoek, Natuurwetenschappen (DFF-4181-00196), door het Interdisciplinair Synergyprogramma 2018 van de Novo Nordisk Foundation (NNF18OC0034936), het Wetenschappelijk Comité Danish Cancer Society (R90-A5847-14-S2), de Lundbeck Foundation (R218-2016-534) en door het Lundbeck Foundation Center of Excellence (Biomembranes in Nanomedicine).

Lasergeïnduceerde thermoplasmonische punctie voor de studie van plasmamembraanherstel

De auteurs hebben niets te onthullen.

De studie benadrukt de thermoplasmonische benadering als een veelbelovende techniek voor het onderzoeken van eiwitreacties in levende cellen en modelmembranen na membraanverstoring. Deze methode levert niet alleen uitgebreide informatie op over eiwitrekrutering, maar ook over de biofysische functie van eiwitten die betrokken zijn bij de dynamiek van eiwitten en membranen. Bijgevolg vergemakkelijkt het de identificatie van moleculaire componenten die verantwoordelijk zijn voor oppervlakteherstel en bevordert het het begrip van de complexe maar vitale machinerie van plasmamembraanreparatie. Hoewel er verschillende methoden bestaan voor het induceren van membraanverstoring, zoals mechanische, chemische en optische technieken, hebben deze methoden te lijden aan beperkingen, zoals niet-specifiek zijn voor cellen, het veroorzaken van meerdere verwondingen aan het celmembraan of het veroorzaken van aanzienlijke schade aan het membraan en het ablateren van intern cellulair materiaal langs het laserpad bij gebruik van krachtige gepulseerde lasers. Hoewel de integratie van confocale microscopie en een optisch pincet de meest uitgebreide informatie biedt, kunnen ook alternatieve beeldvormingsmodaliteiten worden gebruikt. Bijvoorbeeld, aangezien de beeldvorming van het plasmonische nanodeeltje wordt bereikt met behulp van reflectiemicroscopie, een ingebouwde beeldvormingsmodus in Leica confocale microscopen, kunnen aanvullende beeldvormingstechnieken, zoals donkerveldmicroscopie65,66, andere verstrooiingsmethoden zoals iSCAT67,68, of fluorescerende etikettering van het nanodeeltje, worden gebruikt voor AuNP-visualisatie, hoewel dit de toepasbaarheid van de methode zou kunnen beperken.
De gepresenteerde methode is bovendien in staat om nanoscopisch kleine gaatjes in modelmembranen te induceren, waardoor de synergie-effecten tussen verschillende annexines kunnen worden onderzocht. Dit wordt bereikt door verschillend gelabelde recombinante annexines in te kapselen, bijvoorbeeld RFP en GFP, respectievelijk, gevolgd door thermoplasmonische punctie. Dit modelsysteem geeft inzicht in de interactie tussen annexines en membranen in de buurt van vrije randen, zoals te zien is in figuur 2D. In tegenstelling tot in cellen blijven de gaten die aan GUV's worden toegebracht echter uitzetten, gevolgd door destabilisatie van het blaasje. Het in beeld brengen van de evolutie van het gat met behulp van confocale microscopie kan een uitdaging zijn vanwege de snelle uitbreiding van de gatdiameter, maar kan worden bereikt door in de loop van de tijd verschillende z-stapels vast te leggen. Een alternatieve methode zou zijn om een draaiende schijf confocaal te gebruiken voor snellere beeldvorming. Bovendien levert de thermoplasmonische benadering doorgaans een beperkt aantal optimale resultaten per uur op wanneer deze wordt toegepast op afzonderlijke cellen of GUV-experimenten, meestal twee tot drie, bij monstertemperaturen tussen 20 °C en 30 °C. Om de meest nauwkeurige waarneming van de dynamiek van eiwitten en membranen te verkrijgen, wordt aanbevolen om de cellen in een HEPES-bevattende buffer te houden en het monster elk uur te vervangen. Als alternatief kan het experimentele venster worden verlengd door de experimenten uit te voeren in een celincubatiekamer, d.w.z. bij een constante temperatuur van 37 °C met 5% CO2 . Bovendien zou het combineren van deze benadering met andere beeldvormingstechnieken, zoals stochastische optische reconstructiemicroscopie (STORM), een dieper begrip kunnen opleveren van de biofysische functie en interactie van belangrijke eiwitten die betrokken zijn bij membraanherstel op het niveau van één molecuul. Dit zou gedetailleerde informatie kunnen opleveren over de plaats van de verwonding, inclusief de wondgeometrie en locatie van annexine-eiwitten, en andere belangrijke spelers kunnen identificeren die betrokken zijn bij het repareren van het membraanoppervlak.
Om maximale effectiviteit en precisie te bereiken bij het induceren van membraanletsel, is het absoluut noodzakelijk om voorafgaand aan elk experiment de locatie van de laserfocus te verifiëren en ervoor te zorgen dat de axiale positie van de laserfocus samenvalt met de confocale focus. Deze uitlijning optimaliseert de intensiteit tijdens AuNP-beeldvorming, wat leidt tot een maximale lokale temperatuurstijging en daaruit voortvloeiend membraanletsel bij een lager laservermogen. Dit proces wordt handmatig uitgevoerd en is daarom gevoelig voor variabiliteit in de efficiëntie van membraanbreuken, aangezien de focus handmatig wordt vertaald naar een positie die samenvalt met de locatie van het deeltje. In microscopen die geen reflectiemodus hebben, zoals in sommige commerciële systemen, kan co-lokalisatie van de laserfocus en het deeltje een uitdaging zijn. In dergelijke gevallen kunnen alternatieve beeldvormingsmodi (bijv. helder veld) worden gebruikt en kan een langzame rasterscan worden uitgevoerd rond de verwachte deeltjespositie. Opgemerkt moet worden dat een laag laservermogen waarschijnlijk alleen membraanpermeabilisatie induceert, terwijl een hoog laservermogen temperaturen rond de NP kan genereren die het kookpunt van water overschrijden, zelfs als het glasoppervlak een koelend effect heeft. Geschat wordt dat de vorming van nanobellen rond de NP's plaatsvindt tussen 200 °C en 300 °C25,48, waarbij de explosieve hitte kan leiden tot verplaatsing van deeltjes van de laserfocus of deeltjesfragmentatie. Bovendien vormt de vorming van nano- of microbellen tijdens verhitting een uitdaging voor deze methode. Aangezien luchtinterfaces membranen ontnat maken en eiwitdestabilisatie kunnen veroorzaken, wat ongewenst is, is het absoluut noodzakelijk om de verwarming te beperken bij het onderzoeken van membraanreparatie. Met name gouden nanoschelpen verdragen geen hoge temperaturen en zullen onder deze omstandigheden degraderen, zoals aangetoond door microscopie met hoge resolutie58.
Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol voor het gebruik van thermoplasmonics om sterk gelokaliseerde puncties in membranen uit te voeren, dat van toepassing is op zowel cellen als modelmembranen. Om de mate van verhitting verder te verminderen, kunnen kleinere nanodeeltjes die resoneren met NIR-licht worden gebruikt, waardoor intracellulaire puncties in endosomen, het endoplasmatisch reticulum en de nucleaire envelop mogelijk worden. Dergelijke nanodeeltjes, met inbegrip van staafjes en nanomatroesjka's48, kunnen worden gebruikt om het herstel van de nucleaire envelop te onderzoeken door zich te richten op endocytose gouden nanodeeltjes die gemakkelijk aan het celoppervlak worden opgenomen en naar de kern69 worden getransporteerd. Over het algemeen maakt deze techniek de identificatie en het onderzoek mogelijk van de belangrijkste moleculaire componenten die betrokken zijn bij PMR, waardoor hun biofysische functie en rol wordt opgehelderd met behoud van de levensvatbaarheid van de cellen.

Het celmembraan, dat zowel als fysieke barrière als als signaalplatform dient, is van vitaal belang voor het overleven vancellen1. Gedurende de gehele celcyclus wordt het plasmamembraan (PM) blootgesteld aan schade, zoals mechanische 2,3,4,5 en chemische6 stress-geïnduceerde verwondingen. Om de integriteit van het membraan te behouden en de overleving van de cel te garanderen, heeft de cel robuuste mechanismen voor plasmamembraanreparatie (PMR) ontwikkeld. Deze mechanismen zijn afhankelijk van verschillende strategieën, zoals reorganisatie van het cytoskelet, membraanfusie en membraanvervangingsstrategieën 7,8,9,10,11, die allemaal afhankelijk zijn van de rekrutering van specifieke eiwitten. Met name leden van de annexine-eiwitfamilie zijn geïdentificeerd als sleuteleiwitten die geassocieerd zijn met de processen van PMR 1,9,12,13,14,15,16. Na PM-letsel ervaart de cel een instroom van calciumionen (Ca2+), wat een onmiddellijke bedreiging vormt voor het voortbestaan van de cel17. Als reactie op de instroom van Ca2+ binden annexine-eiwitten, die zich voornamelijk in het cytosol bevinden, zich aan het binnenste blaadje van het beschadigde plasmamembraan als onderdeel van de PMR-strategieën18. Annexine A2 (ANXA2) was een van de eerste leden van de annexinefamilie die in verband werd gebracht met PMR bij dysferline-deficiënte spierdystrofie en er werd gesuggereerd dat het herstel bemiddelde door intracellulaire blaasjes te fuseren met de PM in de buurt van de plaats van de verwonding 5,19,20,21. Vervolgens zijn verschillende functies toegeschreven aan annexins22, en hun rol in PMR heeft de afgelopen 20 jaar steeds meer aandacht gekregen. De exacte rol van annexinen in PMR wordt echter nog niet volledig begrepen 15,18,21,22.
Dit artikel stelt een methode voor om eiwit-membraaninteractie en membraandynamica op een gecontroleerde en sterk gelokaliseerde manier te onderzoeken, met behulp van een combinatie van confocale microscopie, optisch pincet en gouden nanodeeltjes (AuNP's). Deze methode maakt de kwantitatieve studie mogelijk van eiwit-, lipide- en kleine molecuulinteracties als reactie op membraanbeschadiging en Ca2+ instroom. Ondanks de complexiteit en veelheid aan componenten die betrokken zijn bij het proces van membraanreparatie, zijn vereenvoudigde membraansystemen die het plasmamembraan nabootsen gebruikt om een dieper mechanistisch begrip te krijgen van de membraandynamica en de reactie van annexine-eiwitten op membraanverstoring16. Gigantische unilamellaire lipideblaasjes (GUV's) werden gekozen als het modelmembraansysteem met een gespecificeerde lipidesamenstelling. De GUV's werden gegenereerd met behulp van de gel-ondersteunde hydratatiemethode, met name polyvinylalcoholgelhydratatie, zoals beschreven door Weinberger et al.23, die een efficiënte inkapseling van annexines in GUV's mogelijk maakte.
Het gebruik van nabij-infrarood (NIR) laserbestraling op metalen nanodeeltjes (NP's) induceert een aanzienlijke opwarming van de NP, waardoor het een effectieve methode is om een lokale warmtebron tot stand te brengen die wordt geëxploiteerd in biomedische toepassingen24. De methode werd aanvankelijk gebruikt om de temperatuur rond een enkele AuNP direct te meten in zowel 2D- als 3D-biomimetische tests. In deze assays 25,26 werden de plasmonische nanodeeltjes bestraald op een ondersteunde lipide dubbellaag of optisch gevangen in de buurt van GUV's die een lokale thermische faseovergang ondergingen bij lokale verhitting, waardoor kwantificering en controle van het exacte temperatuurprofiel rond het deeltje mogelijk werd. Dit referentietemperatuurprofiel is gebruikt bij het onderzoeken of manipuleren van biologische monsters. Verdere vooruitgang in de methode heeft de inductie van nanoscopische poriën in membranenvergemakkelijkt 27, waardoor blaasjes- en celfusie mogelijk is28,29. Andere studies hebben het gedrag van perifere membraaneiwitten in GUV's29 en transmembraaneiwitten30 onderzocht door nieuwe hybride blaasjes te creëren, terwijl celspecifieke medicijnafgifte ook is onderzocht om cellulaire reacties of genexpressie te controleren en te bestuderen 28,29,31,32,33. Onlangs is de methode gebruikt om eiwitreacties op membraanbeschadiging te onderzoeken 32,34,35.
Er bestaan verschillende methoden om het plasmamembraan te verstoren om cellulaire reacties en membraanherstel te onderzoeken. Deze omvatten micronaaldpuncties, het schudden van microbeads en celschrapen, die allemaal het celmembraan mechanisch kunnen verstoren 14,36,37. Chemisch geïnduceerde schade kan worden bereikt door wasmiddelen 5,38 of bacteriële toxines39,40 toe te voegen die de lipidedubbellaag destabiliseren en membraanporiën over het plasmamembraan genereren. Bovendien zijn optisch geïnduceerde verwondingen door continue golf en gepulseerde lasers gebruikt om PMR-componenten te bestuderen, zoals annexine-eiwitten 5,14,21,41, in combinatie met plasmonische nanodeeltjes 42,43,44,45. Ondanks de efficiëntie van krachtige gepulseerde lasers, kunnen ze aanzienlijke verwondingen en schade aan het inwendige van de cel veroorzaken langs het straalpad. Bovendien moeten de gedetailleerde veranderingen die optreden in de biologische materie bij gepulseerde laserbestraling en of het een goed gedefinieerde porie creëert, nog verder worden onderzocht. In dit artikel wordt een alternatieve methode gepresenteerd, waarbij gebruik wordt gemaakt van thermoplasmonica om op een gecontroleerde manier nanoscopische gaatjes in de PM te induceren34,35 zonder significante schade aan de interne structuren te veroorzaken. Dit wordt bereikt door plasmonische NP's bloot te stellen aan een zeer gefocuste NIR-laser, wat resulteert in een extreem gelokaliseerde temperatuurstijging die gemakkelijk temperaturen van meer dan 200 °C kan bereiken, wat kan leiden tot kleine nanoscopische explosies 25,46,47. Dit proces kan worden gecontroleerd door de laserintensiteit en de grootte, vorm en samenstelling van de NP's48 aan te passen. Door deze techniek te gebruiken, kunnen onderzoekers de rol van eiwitten in PM-reparatie in levende cellen onderzoeken, wat zou kunnen helpen bij het beantwoorden van enkele van de onbeantwoorde vragen over de betrokkenheid van annexine-eiwitten bij membraanherstel zonder de levensvatbaarheid van de cel in gevaar te brengen.
De optische vangst van plasmonische nanodeeltjes is goed vastgesteld door eerdere studies 25,49,50,51,52; Aanvullende inzichten met betrekking tot de thermoplasmonische eigenschappen van de nanodeeltjes 53,54,55 kunnen echter worden verkregen in de aanvullende materialen (Aanvullend Dossier 1). De thermoplasmonische methode kan worden gebruikt om nanoscopisch kleine gaatjes in de PM te maken met het oog op het bestuderen van de cellulaire respons- en reparatiemechanismen. Om precies te zijn, de punctie kan worden bereikt door de optische verwarming van AuNP's in de nabijheid van het membraan, zoals weergegeven in figuren 1A en B. Deze gelokaliseerde punctie zorgt voor een instroom van Ca2+, die werd geverifieerd door een calciumsensor, waardoor de PMR-machinerie werd geactiveerd. Voor experimenten met levende cellen werden AuNP's met een diameter van 200 nm geïmmobiliseerd op het oppervlak onder de cel om de rol van ANXA2 in PMR te volgen via confocale microscopie. De NIR-laser (Figuur 1A,B), met een golflengte van 1064 nm, bestraalt de AuNP en maakt gebruik van zijn plasmonische eigenschappen (Figuur 1C), wat resulteert in substantiële lokale verwarming (Figuur 1D) in het biologische transparantievenster49 terwijl de cel zelf minimale schade wordt toegebracht. Het gebied met hoge temperaturen rond de AuNP neemt snel af met 30-40% op een afstand die overeenkomt met de straal van de NP, zoals weergegeven in figuur 1E, waardoor een extreem beperkt letsel in alle drie de dimensies mogelijk is.
Aanvullend dossier 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65776/Supplementary%20File%201_updated.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65776/65776fig01.jpg"> Figuur 1: Schematische schets van de experimentele methode. (A) ANXA-getransfecteerde cellen bevinden zich bovenop geïmmobiliseerde gouden nanodeeltjes (AuNP's) op het oppervlak, of (B) gigantische unilamellaire blaasjes (GUV's) met ingekapselde ANXA zijn gesuspendeerd in een medium dat AuNP's bevat. (C) Een enkele AuNP wordt bestraald door de optische NIR-val, waarbij de interactie tussen het inkomende elektromagnetische veld en de geleidingselektronen leidt tot de collectieve oscillatie van elektronen binnen de NP. (D) Dit proces resulteert in een zeer beperkte, maar significante temperatuurstijging. Om de temperatuur aan het NP-oppervlak te schatten, wordt de Mie-theorie gebruikt en wordt een (E) temperatuurprofiel berekend voor een AuNP met een diameter van 200 nm en laserintensiteit I = 6,36 x 108 W/cm2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65776/65776fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Om het thermische effect op het celmembraan te minimaliseren, worden de AuNP's slechts ~1 seconde bestraald. Dit veroorzaakt een voorbijgaande en lokale uitbarsting van verhitting, waardoor de schade aan eiwitten die doorgaans meer tijd nodig hebben om zich te ontvouwen, wordt verminderd. Bij het doorboren van het membraan worden annexine-eiwitten in een fractie van een seconde gerekruteerd en binnen enkele seconden wordt een annexineringachtige steiger gevormd rond de plaats van verwonding (Figuur 2). Deze benadering is ook toegepast om de betrokkenheid van ANXA5 in zowel levende cellen als modelmembranen16 te onderzoeken in een poging licht te werpen op het volledige schema van de reparatieprocessen. Hoewel de primaire focus lag op de correlerende rekrutering van verschillende annexine-eiwitten, moeten de biofysische aspecten van het reparatiemechanisme nog worden opgehelderd.
Om de voorgestelde methode volledig te implementeren, zijn drie belangrijke componenten nodig: confocale microscopie, optisch pincet en metalen nanodeeltjes. Optische pincetten worden gebruikt om AuNP's op te vangen en hun constructie kan worden bereikt door de procedure te volgen die is beschreven door Neuman et al.49. Als het bouwen van een optisch pincet echter te uitdagend blijkt te zijn, kan een strak gefocusseerde NIR-laser worden gebruikt om AuNP's te bestralen die onder de cellen zijn geïmmobiliseerd. Hoewel voor dit protocol sferische AuNP's werden gekozen, kon een verscheidenheid aan plasmonische deeltjes met afstembare absorptiespectra ook worden gebruikt om een sterk gelokaliseerde temperatuurgradiënt binnen het NIR-gebied48 te bereiken.
Fluorescentiebeeldvorming is noodzakelijk voor het observeren van de rol van de fluorescerend gelabelde eiwitten, en daarom kan totale interne reflectiemicroscopie (TIRF)56 worden beschouwd als een alternatief voor confocale beeldvorming. Deze techniek maakt echter alleen beeldvorming van het oppervlak mogelijk en zou niet compatibel zijn met de experimenten met modelmembraanblaasjes. Bijgevolg zijn zowel het optische pincet als de confocale microscoop essentieel voor de nauwkeurige lokalisatie van het nanodeeltje en gedetailleerd onderzoek van het lokale gebied rond de celbeschadiging. Om het nanodeeltje effectief te bestralen met een diffractiebeperkte laserfocus, is het noodzakelijk om het nanodeeltje te visualiseren. Dit kan optimaal worden bereikt door reflectiemicroscopie, een standaard beeldvormingsfunctie van Leica confocale microscopen. Als reflectie- of verstrooiingsbeeldvorming echter niet beschikbaar is, kunnen alternatieve methoden, zoals de minder efficiënte fluorescerende AuNP-etikettering, worden overwogen.
Samenvattend heeft de zeer controleerbare en gelokaliseerde thermoplasmonische methode die in deze studie wordt gepresenteerd, het potentieel om te dienen als een uitstekend platform voor het onderzoeken van de moleculaire componenten die betrokken zijn bij cellulaire reacties en PM-herstelmechanismen in levende cellen. Naast het bestuderen van de eiwitrespons op PM-schade, kan deze benadering ook worden gebruikt voor het lokaal doorboren van blaasjes, waardoor een onderzoek van de eiwitrespons in zowel eiwit-eiwit- als eiwit-membraandynamiek mogelijk wordt. Bovendien maakt deze methode een kwantitatieve analyse mogelijk van de interacties tussen eiwitten, lipiden en kleine moleculen wanneer membranen worden verstoord. Gezamenlijk hebben deze vorderingen het potentieel om licht te werpen op enkele van de onopgeloste vragen met betrekking tot de ingewikkelde en complexe plasmamembraanreparatiemachines.

<table><tbody><tr><td>1064 nm trapping laser</td><td>Spectra Physics</td><td>N/A</td><td>Spectra Physics J201-BL-106C, Nd: YVO4 NIR laser</td></tr><tr><td>160 nm Gold Nanoshells</td><td>NanoComposix</td><td>NCXGSIR150</td><td></td></tr><tr><td>200 nm Gold Nanoparticles</td><td>BBI Solutions</td><td>EM.GC200/7</td><td></td></tr><tr><td>35 mm glass surface MatTex microwell</td><td>MATTEK</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Amber-glass vials</td><td>Supelco Sigma Aldrich</td><td>243438</td><td></td></tr><tr><td>Annexin A2 plasmids</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Ontvangen van onze medewerker bij het Deense Cancer Research Center</td></tr><tr><td>Annexin A4 recombinant-protein&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N-terminal GFP tagged ANXA4 ontvangen van onze medewerker bij het Deense Cancer Research Center</td></tr><tr><td>Annexin A5 recombinant-protein&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N-terminal GFP tagged ANXA5 ontvangen van onze medewerker bij het Deense Cancer Research Center</td></tr><tr><td>beta-casein</td><td>Sigma Life Science</td><td>C6905-1G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Suprlco (sigma Aldrich)</td><td>10035-04-8</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5702</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR Chemicals</td><td>67-66-3</td><td></td></tr><tr><td>Culture dish (Nunclon Delta Surface)</td><td>Thermo scientific</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>DID cell-labelling Solution</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>7757</td><td></td></tr><tr><td>Distilled water</td><td>Gibco</td><td>15230-089</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td>Opgelost in chloroform&nbsp;</td></tr><tr><td>DOPS</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840035C</td><td>Dissolved in chloroform</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eage's Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>FIJI ImageJ distribution</td><td>ImageJ2</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>GCaMP6s-CAAX</td><td></td><td>N/A</td><td>Ontvangen van onze medewerker bij het Deense Cancer Research Center</td></tr><tr><td>Gibco Fetal Bovine Serum</td><td>Fisher Scientific</td><td>11573397</td><td>10% van het kweekmedium</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>PROLABO</td><td>24 374.297</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton syringes</td><td>Hamilton Company</td><td>N/A</td><td>50 en 500 microliters</td></tr><tr><td>Harrick Plasma Cleaner PDG-002</td><td>Harrick Plasma</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T cells</td><td></td><td>N/A</td><td>Ontvangen van onze medewerker bij het Deense Cancer Research Center</td></tr><tr><td>Leica Acousto-Optical Beam Splitter (AOBS)</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Leica PL APO 63x water immersion objective, NA = 1.2</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP5 confocal scanning microscope</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>15338030</td><td></td></tr><tr><td>MatLab</td><td>The Mathworks, Inc., Natick, Massachusetts, United States</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Chemicals</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduced-Serum Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-992</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>1% van het kweekmedium</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Piezoelectric stage (PI 731.20)</td><td>&nbsp;Physik Instrumente (Germany)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920-100ML</td><td>0,01-0,1% voor coating</td></tr><tr><td>Polyvinyl alcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>363065-25G</td><td></td></tr><tr><td>round glass slide 25 mm &Oslash;</td><td>VWR</td><td>631-1584</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator Brandson 2800</td><td>Brandson</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>sucrose</td><td>Sigma Life Science</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>T25 tissue culture flask</td><td>Falcon</td><td>353108</td><td>Blauwe Ventielkaap</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1285901</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>11590626</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;VWR Mixer mini vortex 230V EU</td><td>VWR</td><td>&nbsp;12620-84</td><td>&nbsp;ECN: 444-2790, SN: 150713022</td></tr></tbody></table>

een thermoplasmonische benadering voor het onderzoeken van plasmamembraanherstel in levende cellen en modelmembranen

A Thermoplasmonic Approach for Investigating Plasma Membrane Repair in Living Cells and Model Membranes

Het celmembraan is cruciaal voor het overleven van de cel, en het waarborgen van de integriteit ervan is essentieel omdat de cel gedurende zijn hele levenscyclus verwondingen oploopt. Om schade aan het membraan te voorkomen, hebben cellen efficiënte plasmamembraanreparatiemechanismen ontwikkeld. Deze reparatiemechanismen kunnen worden bestudeerd door confocale microscopie en thermoplasmonics op nanoschaal te combineren om de rol van sleuteleiwitten, zoals bijlagen, die betrokken zijn bij oppervlakteherstel in levende cellen en membraanmodelsystemen, te identificeren en te onderzoeken.
De punctuurmethode maakt gebruik van een laser om zeer plaatselijke verwarming te induceren bij bestraling van nanodeeltjes. Het gebruik van nabij-infrarood licht minimaliseert de fototoxiciteit in het biologische monster, terwijl het grootste deel van de absorptie plaatsvindt in het nabij-infrarood resonante plasmonische nanodeeltje. Deze thermoplasmonische methode is gebruikt voor potentieel fotothermisch en biofysisch onderzoek om het begrip van intracellulaire mechanismen en cellulaire reacties te vergroten door middel van blaasjes- en celfusiestudies. De aanpak is complementair gebleken aan bestaande methoden voor membraanverstoring, zoals mechanisch, chemisch of optisch geïnduceerd letsel, en biedt een hoge mate van controle door het toebrengen van extreem gelokaliseerde verwondingen. De omvang van de verwonding is beperkt tot de nabijheid van het bolvormige nanodeeltje en er treedt geen nadelige schade op langs het straalpad in tegenstelling tot gepulseerde lasers die verschillende golflengten gebruiken. Ondanks bepaalde beperkingen, zoals de vorming van nanobellen, biedt de thermoplasmonische methode een uniek hulpmiddel voor het onderzoeken van cellulaire reacties bij plasmamembraanherstel in een bijna oorspronkelijke omgeving zonder de levensvatbaarheid van de cel in gevaar te brengen.
Wanneer de punctiemethode wordt geïntegreerd met confocale microscopie, kan deze een mechanistisch inzicht verschaffen in de membraandynamica in modelmembraansystemen, evenals kwantitatieve informatie over eiwitreacties op membraanschade, inclusief eiwitrekrutering en hun biofysische functie. Over het algemeen kan de toepassing van deze methode op gereduceerde modelsystemen ons begrip van de ingewikkelde plasmamembraanreparatiemachines in levende cellen vergroten.

In de huidige studie wordt de thermoplasmonische methode gebruikt om de annexine-eiwitrespons op verstoring van het plasmamembraan te onderzoeken; Elk eiwit dat kan worden gerekruteerd na membraanbeschadiging kan echter worden onderzocht met behulp van deze test, aangezien het betreffende eiwit fluorescerend is geëtiketteerd. Eiwitrekrutering en -functie worden gecontroleerd door confocale beeldvorming in zowel menselijke embryonale niercellen (HEK293T) als gigantische unilamellaire blaasjes (GUV's). Ter verduidelijking illustreert figuur 2 de experimentele omstandigheden waarin een gefocuste NIR-laserstraal van 1064 nm wordt gebruikt om een enkele AuNP te bestralen (figuur 2A), wat resulteert in membraanbeschadiging en een instroom van Ca2+ in de cel, waardoor de PMR-machinerie wordt geactiveerd. Vervolgens worden annexines snel gerekruteerd naar de plaats van de verwonding, waar ze zich binden aan de negatief geladen fosfolipiden aan de wondomtrek en binnen enkele seconden een ringachtige structuur vormen (Figuur 2B, i-iv). De modelmembraanexperimenten, met behulp van GUV's, toonden aan dat membraanpuncties snel opnieuw werden verzegeld in afwezigheid van ANXA, zoals weergegeven in figuur 2C. In aanwezigheid van ANXA werd echter een snelle accumulatie van ANXA waargenomen op de plaats van de verwonding na een membraanpunctie (figuur 2D). Met name ANXA bleef de blootgestelde randen rollen, wat uiteindelijk leidde tot het barsten van de GUV. Aangenomen wordt dat dit rolmechanisme voortkomt uit het vermogen van ANXA om kromming te induceren en lipidemembranen te buigen20.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65776/65776fig02.jpg"> Figuur 2: Annexinen (ANXA's) respons op thermoplasmonisch geïnduceerde membraanverstoring. Aanvankelijk fungeert (A) het plasmamembraan als een barrière tussen de extracellulaire omgeving met hoge niveaus van Ca2+-ionen en de intracellulaire omgeving met ingekapselde ANXA's. Bij bestraling met een nabij-infrarood (NIR) laser genereert de AuNP aanzienlijke warmte, waardoor het membraan scheurt en er een instroom van Ca2+-ionen ontstaat. Bijgevolg wordt de plasmamembraanreparatiemachine (PMR) geactiveerd, waarbij ANXA's worden gerekruteerd naar de plaats van verwonding, waar ze zich binden aan negatief geladen fosfolipiden. (B-D) Confocale microscopiebeelden van een cel die ANXA2 bevat en een GUV die ANXA4 bevat, demonstreren dit proces. (i) Voorafgaand aan de doorstraling tonen de beelden een intacte cel, of GUV, waarbij de bestralingsplaatsen worden aangeduid met de witte pijlen. (ii) Bij bestraling van nanodeeltjes (B) worden ANXA's snel gerekruteerd naar de plaats van de verwonding en vormen ze een ringachtige structuur rond de membraanwond (B [ii-iv]). Paneel (C) toont een met membraan bevlekte GUV zonder ANXA, die bij punctie snel opnieuw afdicht zonder waarneembare membraanremodellering. Aan de andere kant toont paneel (D) een GUV die recombinant ANXA4 bevat, dat al aan het membraan is gebonden vóór (i) bestraling als gevolg van Ca2+ lekkage over het membraan. (ii) Bij het prikken bindt ANXA4 zich aan de vrije randen, waardoor de GUV instort als het membraan van de rand wegrolt. De schaalbalken meten 10 μm voor figuur (B), 2 μm voor B (i), 10 μm voor (C) en 15 μm voor (D). Deze figuur is gereproduceerd uit Moreno-Pescador et. al16 met toestemming van de Royal Society of Chemistry. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65776/65776fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
De analyse van volledige ANXA-ringachtige structuren (Figuur 2B en aanvullende Figuur 1) geeft nuttige inzichten in de wondgrootte en morfologie. De straal van de ANXA-ringstructuur kan worden bepaald in tijd en ruimte, zoals beschreven in hoofdstuk 5. Moreno et al.16 analyseerden meer dan 135 plasmamembraanletsels in levende cellen, waarbij de analyse van ANXA5-ringstructuren wordt weergegeven in figuur 3. De straal werd bepaald door de afstand van het midden van de ring tot de buitenstraal van de curve te meten op basis van de volledige breedte-half-maximum van het ingeklapte intensiteitsprofiel (Figuur 3A). De bevindingen illustreerden een heterogene verdeling van ANXA5-ringmaten (Figuur 3B), die constant bleef in de tijd (Figuur 3D, G, H) en ruimte (Figuur 3C, E, F). Deze resultaten suggereren een accumulatie van ANXA5 rond de verwondingsplaatsen, wat wijst op een alternatieve ANXA5-gemedieerde PMR-strategie in levende cellen voor de veronderstelde trechterachtige binnenwaartse ontluiking van het beschadigde membraan5.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65776/65776fig03.jpg"> Figuur 3: Analyse van ANXA5-ringstructuren rond een verwondingsplaats in levende cellen. (A) De schematische weergave illustreert de analytische benadering, die is gebaseerd op het maximum over de volledige breedte en de helft van het ANXA-intensiteitslijnprofiel. (B) Het histogram illustreert 135 gemeten ANXA5-ringstralen. (C) Fluorescentie-intensiteitslijnprofielen over een ANXA5-GFP-ring voor elke z-sectie van de z-stack. (D) De confocale beelden illustreren de tijdsevolutie van een wond, waarbij ANXA5-GFP zich ophoopt aan de wondomtrek onmiddellijk na het letsel, gevolgd door wondstabilisatie. De tijdframes met het label 1-6 werden vastgelegd met intervallen van 0,66 s per frame. De schaalbalk is 2 μm. (E) De stralen van de wonden werden bepaald als functie van de wonddiepte op basis van de methode gepresenteerd in paneel A. (F) De helling van de wond werd geanalyseerd als ANXA5-ringstralen als functie van de z-hoogte op basis van de gegevens die werden geëxtraheerd uit paneel E. (G) De lijnprofielen van de fluorescentie-intensiteit werden gemeten over de ANXA5-GFP-ring van paneel D, waarbij elk tijdsinterval 1-6 wordt aangeduid als schijf 1-6. Ten slotte (H) wordt de tijdsevolutie van de ANXA5-GFP-ringstralen voorgesteld als een functie van de tijd berekend op basis van de gegevens in paneel G. Deze figuur is gereproduceerd uit Moreno-Pescador et. al16 met toestemming van de Royal Society of Chemistry. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65776/65776fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
In vergelijking met de ringachtige structuren die worden gevormd door alleen de PM te verstoren (aanvullende figuur 1), kunnen verwondingen in de nabijheid van de kern (aanvullende figuur 2A) de evolutie en geometrie van de wond beïnvloeden. Af en toe was slechts een fractie van de ANXA-ringen zichtbaar (aanvullende figuur 2B,C), die ook kan worden geanalyseerd met behulp van de interne MATLAB-analyseworkflow (zie sectie 5), hoewel aanvullende gegevens verloren kunnen gaan. Doorgaans bevinden ANXA-ringformaties die worden waargenomen in niet-hechtende cellen (aanvullende figuur 2C) zich dicht bij zowel de kern als de periferie van de cel. Als gevolg hiervan kan een meer langgerekte ringstructuur worden waargenomen, wat suboptimaal is voor de gepresenteerde data-analyse. Bovendien bleken niet-aanhangende cellen vatbaarder te zijn voor celdood na PM-letsel. Bovendien is het belangrijk op te merken dat bij het overwegen van verwondingen als gevolg van de bestraling van AuNP-aggregaten deze verwondingen ernstiger en minder beheersbaar kunnen zijn. Dit komt door de aanzienlijke toename van plasmonische verhitting, die een groot deel van de cel kan beschadigen. Als gevolg hiervan zijn dergelijke verwondingen niet opgenomen in de ANXA5-ringanalyse.
Bovendien geven de voorlopige bevindingen aan dat de verstoring van het plasmamembraan met behulp van thermoplasmonics resulteert in verhoogde intracellulaire Ca2+- niveaus. Dit werd zelfs waargenomen bij bestraling met lage intensiteit van enkelvoudige AuNP's, wat wijst op PM-permeabilisatie35, zoals weergegeven in figuur 4. De instroom van Ca2+ werd waargenomen in cellen die een membraangebonden calciumsonde, GCaMP6s-CAAX, tot expressie brengen, die een conformatieverandering ondergaat bij de instroom van Ca2+ , en dus kan een toename van de intensiteit worden waargenomen64. De calciumintensiteit werd gekwantificeerd voor de gehele voetafdruk van de cel in de loop van de tijd. Om achtergrondruis te elimineren, werd het achtergrondniveau Ca2+ afgetrokken voorafgaand aan membraanverstoring en herstel na het membraan. De maximale intensiteit werd bepaald door de gemiddelde Ca2+ intensiteit in de cel te normaliseren, wat resulteerde in een intensiteitscurve die een snelle initiële toename van de Ca2+ intensiteit vertoonde, gevolgd door een langzamere afname, zoals weergegeven in figuur 4B.
De cel bereikte een maximale calciumintensiteit van ~ 6,6 s, wat consistent is met de bevindingen van Klenow et al.64, die suggereerden dat de tijd van de calciumintensiteitspiek (t = tc) overeenkomt met de tijd die nodig is voor het sluiten van de wond. Hoewel verder onderzoek nodig is om het onderliggende mechanisme van membraanherstel en wondgenezing vast te stellen, toonden de voorlopige bevindingen echter aan dat dit Ca2+- proces uitsluitend werd waargenomen in de beschadigde cel en niet in de niet-beschadigde cel die als positieve controle werd gebruikt. Dit bevestigt dat de cel Ca2+- instroom ervoer bij verstoring van het thermoplasmonische membraan, waarbij het overtollige intracellulaire calcium actief wordt weggepompt na succesvolle PMR, aangezien het intracellulaire calciumniveau niet langer concurreert met de Ca2+- instroom, waardoor uiteindelijk celhomeostatse64 wordt bereikt.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65776/65776fig04.jpg"> Figuur 4: Calciuminstroom treedt op als het plasmamembraan van een HEK293T cel wordt gescheurd door thermoplasmonica. Een reeks confocale beelden toont twee cellen (de cel van belang en een niet-gewonde cel die als positieve controle wordt gebruikt) die de membraangebonden calciumsonde, GCaMP6s-CAAX, tot expressie brengen. De schaalbalk meet 10 μm. (A) Voorafgaand aan de bestraling, om 00:00 s, wordt de voetafdruk van de twee cellen gevisualiseerd door de grijze stippellijn en de bestralingsplaats wordt aangegeven door de gele cirkel. Bij laserbestraling wordt een snelle instroom van Ca2+ waargenomen, die de maximale intensiteit bereikt bij ~ 6,6 s, aangegeven door de oranje stippellijn, een tijdstip waarvan wordt aangenomen dat het overeenkomt met het tijdstip van wondsluiting64. (B) Het calciumintensiteitsprofiel verkregen uit de GCaMP6s-CAAX-sonde in de gewonde cel (blauwe lijn) werd vergeleken met de Ca2+ -intensiteit in een naburige niet-beschadigde cel (grijze stippellijn), waarbij een duidelijke Ca2+ -instroom uitsluitend bij PM-verstoring werd getoond. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65776/65776fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

De thermoplasmonische punctiemethode integreert confocale microscopie, optische pincetten en gouden nanodeeltjes om eiwitreacties te bestuderen tijdens plasmamembraanherstel in cellen en gigantische unilamellaire blaasjes. De techniek maakt een snelle en gelokaliseerde membraanpunctie mogelijk, waardoor de belangrijkste eiwitten en hun functionele rol in de ingewikkelde plasmamembraanreparatiemachines kunnen worden geïdentificeerd.

Een thermoplasmonische benadering voor het onderzoeken van plasmamembraanherstel in levende cellen en modelmembranen

The cell membrane is crucial for cell survival, and ensuring its integrity is essential as the cell experiences injuries throughout its entire life cycle. ...

Ons onderzoek is gericht op onderzoek naar plasmamembraanherstelmechanismen, zowel in levende cellen, maar ook in biomimetische systemen, de zogenaamde gigantische unilamellaire blaasjes. We zijn vooral geïnteresseerd in het begrijpen van de rol van eiwitten zoals annexines en het vergemakkelijken van oppervlakteherstel. Deze ingewikkelde processen worden onderzocht met behulp van onze innovatieve thermoplasmonische punctietechniek.Momenteel wordt celherstel onderzocht met behulp van pulslasers, gecombineerd met moleculaire biologie, om eiwitten te identificeren die worden gerekruteerd naar de plaats van verwonding. Het nadeel van deze aanpak is dat het moeilijk is om de omvang van de schade veroorzaakt door het gebruik van pulslasers te beheersen. Op dit moment brengen onze experimenten een paar uitdagingen met zich mee.We werken aan het verfijnen van de uitlijning van onze laserfocus met een nanodeeltje, wat cruciaal is voor precisie, en hoewel het een beetje lastig kan zijn, werken we ook actief aan het minimaliseren van de vorming van nanobellen tijdens het verwarmingsproces. Ons onderzoek toonde aan dat annexine-eiwitten snel reageren op calciuminstroom, een sleutelrol spelen bij membraanherstel en divers gedrag van individuele annexines onthullen. Om de betrokken mechanismen beter te begrijpen, hebben we biomimetische systemen gebruikt, waardoor we precies kunnen meten hoe annexines de membraanbuiging in de buurt van een membraangat beïnvloeden.Ons protocol voldoet aan de behoefte aan nauwkeurige gelokaliseerde membraanletsels in gezonde cellen. Het biedt waardevol inzicht in de herstelmechanismen van levende celmembranen. Bovendien maakte het de studie mogelijk van de biofysische rol van membraaneiwitten die in biomimetische membranen worden gerekruteerd naar het ringvormige gebied nabij het bovenste hoofd.

a-thermoplasmonic-approach-for-investigating-plasma-membrane-repair

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates an assay to study the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells. The cells are exposed to a bacterial pore-forming toxin, which forms pores in the cell membrane. In the presence of extracellular calcium ions, the pore causes calcium influx, inducing membrane-resealing events. The resealing efficiency is assessed using DNA-binding propidium iodide dye, which only enters cells without a resealed membrane.

An In Vitro Fluorescence-Based Assay to Measure Plasma Membrane Resealing Efficiency

Beeldvorming van levende cellen blootgesteld aan de lipofiele kleurstof FM1-43 maakt nauwkeurige bepaling van de kinetiek waarmee poriënvormende toxines worden verwijderd uit de plasmamembraan. Dit is een gevoelige test die kan worden gebruikt om vereisten voor Ca 2 +, sphingomyelinase en andere factoren plasmamembraan reparatie beoordelen.

Wonen Imaging Assay voor het beoordelen van de Rollen van Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; En sphingomyelinase in de Reparatie van Pore-vormende Toxine Wonden

Het genezingsproces beschadigde cellen omvat handel specifieke eiwitten en subcellulaire compartimenten aan de plaats van celmembraan schade. Dit protocol beschrijft assays deze processen volgen.

Imaging celmembraan letsel en Subcellulaire processen die betrokken zijn in reparatie

-Polarisatie gebaseerde Total Internal Reflection Fluorescentie microscopie (pTIRFM) maakt real-time detectie van celmembraan dynamiek. Dit artikel beschrijft de uitvoering van pTIRFM voor de studie van membraan remodeling tijdens gereguleerde exocytose. De techniek is generaliseerbaar naar andere celbiologische processen die veranderingen in de membraan vorm direct of indirect te betrekken.

Imaging Plasma Membraan Vervormingen Met pTIRFM

Cell membrane verwonding via twee-foton laser is een veelgebruikte methode voor de beoordeling van de membraan opnieuw verzegelen vermogen en kan worden toegepast op meerdere celtypes. Hier beschrijven we een protocol voor in vitro live-imaging membraan daarvan in dysferlinopathy patiënten cellen na twee-foton laser van het baarmoederslijmvlies.

Cell Membrane Repair Assay met behulp van een Laser van het twee-foton microscoop

Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer fluorescentie gebaseerde bepaling dat de maatregelen van het plasma-membraan opnieuw verzegelen efficiëntie door fluorimetrische en imaging analyses in levende cellen. Deze test kan worden gebruikt voor het screenen van drugs of doelgenen die regelen plasmamembraan opnieuw verzegelen in zoogdiercellen.

High-throughput meting van plasmamembraan opnieuw verzegelen efficiëntie bij zoogdiercellen

Dit protocol beschrijft een microfluïdisch co-cultuur model voor gelijktijdige en gelokaliseerde cultuur van epitheliale cellen en bacteriën. Dit model kan gebruikt worden voor het onderzoeken van de rol van verschillende oplosbare moleculaire signalen op pathogenese en het scherm van de effectiviteit van de vermeende probiotische bacteriestammen.

Microfluïdische Co-cultuur van epitheliale cellen en bacteriën voor het onderzoeken van Oplosbaar Signal-gemedieerde interacties

Hierin beschreven een robot benadering high-throughput kristallisatie van membraaneiwitten in lipidische mesofasen voor gebruik in structuurbepaling met macromoleculaire X-ray kristallografie. Drie robots staat de behandeling van de viskeuze en kleverige eiwit beladen mesofase een integraal onderdeel van de methode worden geïntroduceerd.

Gebruik van een robot voor High-throughput Kristallisatie van membraaneiwitten in lipide mesofasen

Interacties tussen eiwitten zijn fundamenteel voor alle cellulaire processen. Met Bioluminescentie Resonance Energy Transfer, kan de interactie tussen twee eiwitten worden gecontroleerd in levende cellen en in real time. Bovendien kunnen de effecten van potentieel pathogene mutaties worden beoordeeld.

Onderzoeken eiwit-eiwit interacties in levende cellen met behulp van bioluminescentie resonantie energieoverbrenging

Single fluoroforen kunnen worden gelokaliseerd met nanometer precisie met behulp van FIONA. Hier een overzicht van de FIONA techniek is gemeld, en hoe FIONA experimenten uit te voeren wordt beschreven.

Fluorescentie Imaging met One-nanometer nauwkeurigheid (FIONA)

Verken de thermoplasmonische punctuurtechniek voor het bestuderen van plasmamembraanherstel in levende cellen en GUVs. Deze methode onthult de cruciale rol van annexine-eiwitten bij membraanreparatie na calciuminflux.

Een thermoplasmonische benadering voor het onderzoeken van plasmamembraanherstel in levende cellen en modelmembranen

Meer video's verkennen