Name: Toepassing van levende mitochondriënkleuring bij het sorteren van cellen om hepatocyten te zuiveren die zijn afgeleid van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Leer hoe je hepatocyten zuivert uit door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen met levende mitochondriënkleuring en FACS. Deze methode bereikt 97% zuiverheid zonder genetische modificatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie subsidienummer [23390072].

In deze studie werd gebruik gemaakt van commercieel verkregen humane iPS-cellen (253G1-stam) (zie Materiaaltabel).
1. Onderhoud van menselijke iPS-cellen
<ol><li>Bewaar menselijke iPS-cellen in feedervrije omstandigheden in AK02-medium op kweekschalen gecoat met 0,25 μg/cm2 iMatrix-511 (zie Materiaaltabel).</li>
</ol>2. Hepatische differentiatie van humane iPS-cellen in 2D-culturen
OPMERKING: Raadpleeg Figuur 1A voor het dagelijkse schema van leverdifferentiatie. Gebruik tijdens het hele proces kweekplaten met 6 putjes en voeg 2 ml van het daarvoor bestemde was- of kweekmedium toe aan elk putje. Houd de celkweekconditie op 100% vochtigheid, 5% CO2 en 20% O2 bij 37 °C.
<ol><li>Smeer elk putje van een plaat met 6 putjes in met 1 ml basale membraanmatrix (1/25 verdund in PBS (-)) en incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur.</li>
	<li>Transporteer menselijke iPS-cellen op de gecoate schaal met een dichtheid van 20.000-30.000 cellen/cm² met behulp van AK02N-medium aangevuld met 10 μM ROCK-remmer (Y-27632) (zie materiaaltabel). Vervang het medium zonder Y-27632 de volgende dag en kweek nog 2 dagen.</li>
	<li>Was de cellen één keer met RPMI-1640 medium. Start endodermdifferentiatie door het medium te vervangen door RPMI-B27-Glu (RPMI-1640 + 2% B27 insuline + 1% dipeptide L-Alanyl-L-Glutamine) aangevuld met 3-6 μM CHIR-99021 en 100 ng/ml Activine A gedurende 24 uur (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Vervang het medium door RPMI-B27-Glu aangevuld met 50 ng/ml Activin A gedurende 24 uur.</li>
	<li>Om differentiatie van levervoorlopercellen te induceren, vervangt u het medium door RPMI-B27-Glu aangevuld met 1% dimethylsulfoxide (DMSO) gedurende 5 dagen.</li>
	<li>Om de rijping van hepatocyten te bevorderen, schakelt u over op het rijpingsmedium van hepatocyten: Leibovitz's L-15-medium met 10 μM hydrocortison 21-hemisuccinaat, 8,3% tryptosefosfaatbouillon, 100 nM dexamethason (DEX), 50 μg/ml natrium-L-ascorbaat, 0,58% insuline-transferrine-selenium (ITS), 8,3% foetaal runderserum (FBS), 2 mM Dipeptide L-Alanyl-L-Glutamine en 100 nM N-Hexanoic-Try-Ile-(6)-amino Hexaanic amide (Dihexa) (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Vervang het medium elke 2 dagen gedurende 20 dagen. Sorteer de cellen ongeveer 27 dagen na het starten van de differentiatie.</li>
</ol>3. Celpreparaat voor zuivering van humane iPS-cellen-afgeleide hepatocyten
<ol><li>Was hepatische gedifferentieerde cellen met 2 ml PBS (-) per putje.</li>
	<li>Voeg 1 ml enzymoplossing per putje toe, waaronder 0,1% collagenase, 0,083% trypsine, 10 μM ROCK-remmer (Y-27632), 20 nM ciclosporine A en 50 μg/ml natrium-L-ascorbaat in de adsbuffer (116 mM NaCl, 12,5 mM NaH2PO4, 20 mM HEPES, 5,4 mM KCl, 5,6 mM glucose en 0,8 mM MgSO4; pH 7,35) (zie Materiaaltabel). Maak de cellen los van de platen door ze ongeveer 2 uur horizontaal te draaien bij 37 °C.</li>
	<li>Nadat u hebt bevestigd dat de cellen onder een microscoop zijn losgemaakt en afgerond, verspreidt u ze in afzonderlijke cellen door voorzichtig te pipetteren en verzamelt u ze in een buis van 50 ml.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 18 °C om ze te pelleteren. Verwijder het supernatans met behulp van een aspirator.</li>
	<li>Kleuring van de mitochondriën van de cellen door ze te dispergeren in 5 ml hepatocytrijpingsmedium dat 100 nM TMRM (tetramethylrhodamine, methl-ester) bevat (zie Materiaaltabel). Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C en bescherm ze tegen licht door ze in aluminiumfolie te wikkelen.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 18 °C om ze te pelleteren. Verwijder het supernatant.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen met 1-5 ml koude Ads-buffer met 2% FBS.</li>
	<li>Tel het celgetal met behulp van een 0,4% Trypan blauwe oplossing en een plaatje met celtelling.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om ze te pelleteren. Verwijder het supernatant.</li>
	<li>Verdun een anti-ALCAM-antilichaam (primair antilichaam, zie materiaaltabel) in een verhouding van 1:50 in de Ads-buffer en voeg 100 μL van het verdunde antilichaam toe per 106 cellen. Kleur de cellen gedurende 50 minuten op ijs. Bereid cellen voor die niet zijn gekleurd met het primaire antilichaam als negatieve controle.</li>
	<li>Was de cellen twee keer met een koude adsbuffer die 2% FBS bevat.</li>
	<li>Verdun een Alexa Fluor 488 ezel anti-geit IgG (secundair antilichaam, zie Materiaaltabel) in een verhouding van 1:100 in de Ads-buffer en voeg 100 μL van het verdunde antilichaam toe per 106 cellen. Vlek de cellen gedurende 30 minuten op ijs. Kleurcellen die niet zijn gekleurd met het primaire antilichaam met behulp van het secundaire antilichaam.</li>
	<li>Was de cellen twee keer met een koude adsbuffer die 2% FBS bevat.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen in de advertentiebuffer en filtreer ze door een celzeef met klikdop (35 μm mesh) net voordat ze worden gesorteerd op FACS om grote celklonten en vuil te verwijderen.</li>
</ol>4. FACS-analyses en sortering van van humane iPS-cellen afgeleide hepatocyten
<ol><li>Stel de FACS-machine in voor het sorteren van cellen volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel). OPMERKING: Gebruik een mondstuk van 85 μm of 100 μm en een ND-filter van 2.0 voor hepatocyten. Gebruik het FITC-kanaal voor het detecteren van Alexa Flour 488 voor ALCAM en het PE-kanaal voor het detecteren van TMRM-fluorescentie voor mitochondriën.</li>
	<li>Pas de FSC (forward scatter) en SSC (side scatter) spanningen aan om de celpopulatie goed te visualiseren.</li>
	<li>Pas de voltages van de FITC- en PE-fluorescentiekanalen aan. Begin met niet-gelabelde cellen en centreer de celpopulatie onderaan elke kanaalplot. Zorg ervoor dat de gelabelde cellen op de juiste manier in de plot zijn geplaatst.</li>
	<li>Gebruik een veelgebruikte poortstrategie om doubletten te elimineren: Gate de belangrijkste FSC-A vs. SSC-A-populatie (Figuur 2A), gevolgd door FSC-H vs. -W, en dan SSC-H vs. -W (Figuur 2B,C).</li>
	<li>Gate de TMRMhi- en ALCAM+-populatie (P2 in figuur 2E) om hepatocyten te sorteren. Gate de TMRMhi en ALCAM-populatie (P1 in figuur 2E) om niet-hepatocyten te sorteren. Verzamel gesorteerde hepatocyten en niet-hepatocyten in verzamelbuisjes van 15 ml met hepatocytrijpingsmedium.</li>
	<li>Centrifugeer de verzamelbuis met de gesorteerde cellen bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 18 °C.</li>
	<li>Verwijder het supernatans en resuspendeer de cellen in het hepatocytrijpingsmedium.</li>
	<li>Zaai de cellen op met mitomycine C behandelde muizenembryonale fibroblasten (MEF's) of gelachtige basale membraanmatrix met hepatocytrijpingsmedium aangevuld met 10 μM Y-27632 en 20 nM ciclosporine A. Kweek de cellen gedurende 5 dagen in een CO2 -incubator van 37 °C.</li>
</ol>5. Immunocytochemie voor detectie van humane iPS-cellen-afgeleide hepatocyten
<ol><li>Was de gekweekte cellen gedurende 5 dagen na het sorteren met PBS (-).</li>
	<li>Fixeer de cellen met 4% paraformaldehyde gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Was de cellen met TBS-T-buffer (1x TBS met 1% Tween 20) twee keer om de paraformaldehyde te verwijderen.</li>
	<li>Incubeer de cellen met 0,1% Triton X-100 verdunde TBS-T-buffer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Was de cellen twee keer met TBS-T-buffer om Triton X-100 te verwijderen.</li>
	<li>Voeg in de handel verkrijgbare blokkeringsoplossing (zie Materiaaltabel) toe aan de cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Voeg primaire antilichamen toe tegen albumine (hepatocytmarker) en humaan nucleair antigeen (hNA, zie materiaaltabel), verdund 1:50 in blokkeringsoplossing.</li>
	<li>Incubeer de cellen een nacht bij 4 °C. Was de cellen twee keer met TBS-T buffer.</li>
	<li>Voeg secundaire antilichamen toe: Alexa Fluor 488 ezel anti-konijn IgG en Alexa Fluor 546 ezel anti-muis IgG, verdund 1:100 in blokkeringsoplossing (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Was de cellen twee keer met TBS-T buffer.</li>
	<li>Evalueer de zuiverheid van de hepatocyten door albumine-positieve en hNA-positieve cellen te tellen onder een fluorescentiemicroscoop. Bereken het percentage albumine-positieve cellen per hNA-positieve cel voor zowel de P1- als de P2-populatie.</li>
</ol>

Zuivering van humane iPSC-afgeleide hepatocyten door mitochondriale-ALCAM-sortering

<ol><li>Yamamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+potential+of+pluripotent+stem+cells+correlates+to+the+level+of+CHD7%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Differentiation potential of pluripotent stem cells correlates to the level of CHD7.</a> Scientific Reports. 8 (1), 241(2018).</li>
<li>Laco, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+inconsistencies+of+cardiac+differentiation+efficiency+induced+by+the+GSK3%CE%B2+inhibitor+CHIR99021+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Unraveling the inconsistencies of cardiac differentiation efficiency induced by the GSK3β inhibitor CHIR99021 in human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 10 (6), 1851-1866 (2018).</li>
<li>Anderson, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+serendipity+and+reproducibility%3A+Pluripotent+stem+cells+as+experimental+systems+for+intellectual+and+developmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Balancing serendipity and reproducibility: Pluripotent stem cells as experimental systems for intellectual and developmental disorders.</a> Stem Cell Reports. 16 (6), 1446-1457 (2021).</li>
<li>Chen, C. X. -Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+quality+control+workflow+to+evaluate+the+reproducibility+and+differentiation+potential+of+human+iPSCs+into+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Standardized quality control workflow to evaluate the reproducibility and differentiation potential of human iPSCs into neurons.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Duinsbergen, D., Salvatori, D., Eriksson, M., Mikkers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumors+originating+from+induced+pluripotent+stem+cells+and+methods+for+their+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tumors originating from induced pluripotent stem cells and methods for their prevention.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1176, 197-204 (2009).</li>
<li>Nori, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+safety+issues+of+iPSC-based+cell+therapy+in+a+spinal+cord+injury+model%3A+oncogenic+transformation+with+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-term safety issues of iPSC-based cell therapy in a spinal cord injury model: oncogenic transformation with epithelial-mesenchymal transition.</a> Stem Cell Reports. 4 (3), 360-373 (2015).</li>
<li>Hentze, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teratoma+formation+by+human+embryonic+stem+cells%3A+evaluation+of+essential+parameters+for+future+safety+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Teratoma formation by human embryonic stem cells: evaluation of essential parameters for future safety studies.</a> Stem Cell Research. 2 (3), 198-210 (2009).</li>
<li>Anderson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+enrichment+of+cardiomyocytes+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells.</a> Molecular Therapy. 15 (11), 2027-2036 (2007).</li>
<li>Hidaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chamber-specific+differentiation+of+Nkx2.5-positive+cardiac+precursor+cells+from+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Chamber-specific differentiation of Nkx2.5-positive cardiac precursor cells from murine embryonic stem cells.</a> The FASEB Journal. 17 (6), 740-742 (2003).</li>
<li>Gassanov, N., Er, F., Zagidullin, N., Hoppe, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin+induces+differentiation+of+ANP-EGFP+expressing+embryonic+stem+cells+towards+a+pacemaker+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Endothelin induces differentiation of ANP-EGFP expressing embryonic stem cells towards a pacemaker phenotype.</a> The FASEB Journal. 18 (14), 1710-1712 (2004).</li>
<li>Duan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+enrichment+of+hepatocyte-like+cells+from+human+embryonic+stem+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentiation and enrichment of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cells in vitro and in vivo.</a> Stem Cells. 25 (12), 3058-3068 (2007).</li>
<li>Takayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+high-functioning+human+iPS+cell-derived+hepatocyte-like+cells+for+pharmaceutical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Enrichment of high-functioning human iPS cell-derived hepatocyte-like cells for pharmaceutical research.</a> Biomaterials. 161, 24-32 (2018).</li>
<li>Hattori, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nongenetic+method+for+purifying+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature methods. 7, 61-66 (2009).</li>
<li>Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte-like+cells+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+can+be+enriched+by+a+combination+of+mitochondrial+content+and+activated+leukocyte+cell+adhesion+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22JMA+Journal%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule.</a> JMA Journal. 2 (2), 174-183 (2019).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., Enríquez, J., Pérez-Martos, A., Montoya, J., Fernández-Silva, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+differences+in+mitochondrial+activity+and+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific differences in mitochondrial activity and biogenesis.</a> Mitochondrion. 11, 207-213 (2010).</li>
<li>Swart, G. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+leukocyte+cell+adhesion+molecule+%28CD166%2FALCAM%29%3A+Developmental+and+mechanistic+aspects+of+cell+clustering+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Activated leukocyte cell adhesion molecule (CD166/ALCAM): Developmental and mechanistic aspects of cell clustering and cell migration.</a> European Journal of Cell Biology. 81 (6), 313-321 (2002).</li>
<li>Peters, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asialoglycoprotein+receptor+1+is+a+specific+cell-surface+marker+for+isolating+hepatocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Development. 143 (9), Cambridge, England. 1475-1481 (2016).</li>
<li>Kamiya, A., Inagaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor+cell+systems+in+liver+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+Research%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor cell systems in liver development and regeneration.</a> Hepatology Research. 45 (1), 29-37 (2015).</li>
<li>Yanagida, A., Ito, K., Chikada, H., Nakauchi, H., Kamiya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+In+vitro+expansion+system+for+generation+of+human+ips+cell-derived+hepatic+progenitor-like+cells+exhibiting+a+bipotent+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">An In vitro expansion system for generation of human ips cell-derived hepatic progenitor-like cells exhibiting a bipotent differentiation potential.</a> PLOS One. 8 (7), e67541(2013).</li>
<li>Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule-driven+hepatocyte+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (5), 939-952 (2015).</li>
<li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALCAM+%28CD166%29+is+a+surface+marker+for+early+murine+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%2C+Tissues%2C+Organs%22%5BJournal%5D)">ALCAM (CD166) is a surface marker for early murine cardiomyocytes.</a> Cells, Tissues, Organs. 184 (3-4), 172-180 (2006).</li>
<li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Vanwege hun functies in het metabolisme van voedingsstoffen en ontgifting bezitten hepatocyten een relatief groot aantal mitochondriën in vergelijking met andere celtypen15. ALCAM is een lid van de immunoglobuline-superfamilie en speelt een rol bij celadhesie en migratie. Het komt tot expressie in verschillende celtypen, waaronder lever-, epitheel-, lymfocytische, myeloïde, fibroblast- en neuronale cellen16. Door gebruik te maken van een combinatie van de op mitochondriën g...

Embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen (respectievelijk ES en iPS) worden beschouwd als veelbelovende celbronnen voor regeneratieve therapieën. De efficiëntie van het differentiëren van deze cellen in specifieke doelceltypen kan echter variëren, zelfs wanneer dezelfde cellijn, hetzelfde protocol en dezelfde experimentator 1,2,3,4 wordt gebruikt. Deze variabiliteit kan worden toegeschreven aan de hoge gevoeligheid van menselijke ES/iPS-cellen voor hun omgeving. Daarom is het momenteel moeilijk om consequent zuivere doelcellen te verkrijgen. Om zeer veilige regeneratieve geneeskunde te bereiken, is het van cruciaal belang om proliferatieve cellen en ongedifferentieerde stamcellen in therapeutische cellen te elimineren, en geavanceerde zuiveringstechnologie voor doelcellen is essentieel 5,6,7.
Een celsorteerder is een apparaat dat onmiddellijk individuele cellen analyseert en levende cellen van belang sorteert op basis van de fluorescerende signaalsterktes, wat een veelbelovende oplossing biedt. Dit kan worden bereikt door antilichaamkleuring van celtype-specifieke oppervlaktemarkers of door gebruik te maken van celtype-specifieke reporter-genexpressies. Met behulp van deze techniek zijn er verschillende rapporten over methoden voor het zuiveren van pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten 8,9,10 en hepatocyten11,12. Hattori et al. ontwikkelden een innovatieve mitochondriale zuiveringsmethode met behulp van een celsorteerder13. Door gebruik te maken van het feit dat cardiomyocyten een hoge energiebehoefte hebben door mitochondriale activiteit, kan het kleuren van de cellen met de levende mitochondriën-indicatieve kleurstof TMRM (tetramethylrhodaminemethylester) worden gebruikt om cardiomyocyten te labelen en sterk te zuiveren door FACS van menselijke ES-cel-afgeleide embryoïde lichamen die verschillende celtypen bevatten. De afwezigheid van tumorigeniciteit werd bevestigd door teratoomvormingstesten met de gezuiverde cardiomyocyten. Bovendien ontdekten Yamashita et al. onverwacht een methode om hepatocyten te zuiveren uit menselijke ES-cel-afgeleide embryoïde lichamen door fracties te isoleren met hoge mitochondriale activiteit en ALCAM-positieve expressie14. De grondgedachte voor deze methode is dat hepatocyten ook een relatief hoog aantal mitochondriën hebben vanwege hun hoge consumptie van ATP voor het metabolisme van voedingsstoffen en ontgifting15, en hepatocyten brengen ALCAM tot expressie, een lid van de immunoglobuline-superfamilie, die een rol speelt bij celadhesie en migratie16.
Eerdere sterk zuiverende methoden voor pluripotente stamcel-afgeleide hepatocyten vereisten genetische modificaties, en niet-genetische zuiveringsmethoden hadden een lage efficiëntie17. De mitochondriale niet-genetische methode heeft de verdienste om een hoge zuiverheid te bereiken. Wanneer levervoorlopercellen nodig zijn, kan worden gekozen voor CD133- en CD13- of Dlk1-gebaseerde methoden 18,19. Hoewel de nauwkeurigheid van de technologie voor het bewerken van het genoom is gevorderd, kan het potentiële risico van onvoorziene genomische veranderingen (bijv. carcinogenese) niet volledig worden geëlimineerd. Methoden gebaseerd op mitochondriale activiteit, zonder genetische modificatie te betrekken, kunnen vrij zijn van dergelijke risico's.
Als resultaat van onderzoek van verschillende mitochondriale indicatoren in neonatale cardiomyocyten van ratten, werd waargenomen dat TMRM binnen 24 uur volledig verdween, terwijl andere kleurstoffen ten minste 5 dagen bleven13. Bovendien is het belangrijk op te merken dat TMRM en JC-1 geen invloed hadden op de levensvatbaarheid van cellen wanneer ze werden beoordeeld met de 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT)-test, terwijl andere kleurstoffen verschillende effecten op de levensvatbaarheid van de cellen vertoonden13. TMRM demonstreert een hogere veiligheid.
Tot op heden zijn er verschillende tweedimensionale (2D) differentiatiemethoden ontwikkeld als efficiëntere benaderingen voor het induceren van differentiatie in vergelijking met driedimensionale (3D) embryoïde lichaamsvorming. Dit komt omdat stapsgewijze differentiatie-inducerende verbindingen of cytokines uniform kunnen worden toegediend aan cellen op een 2D-vlak, in plaats van in een 3D-ruimte. In deze studie werd de eerder gerapporteerde methode20 gewijzigd om differentiatie te induceren in humane iPS-cel-afgeleide hepatocyten. Hier worden de details beschreven van de procedures voor de up-to-date 2D-differentiatie en zuivering van hepatocyten afkomstig van menselijke iPS-cellen.

<table><tbody><tr><td>253G1 human iPS cell line</td><td>RIKEN BioResource Research Center</td><td>HPS0002</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>163-20145</td><td></td></tr><tr><td>Activin A Solution, Human, Recombinant</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>18585</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1</td><td>Chemicon</td><td>MAB1281</td><td>Antilichaam tegen humaan nucleair antigeen</td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50x), serum free</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Celsorteer</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-10182&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ciclosporin A</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>035-18961</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>034-22363</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Gelachtige basement membrane matrix</td></tr><tr><td>CultureSure Y-27632</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>036-24023</td><td>ROCK-remmer</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>047-18863</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>047-29353</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10036</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Biowest</td><td>51820-500</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Dipeptide L-Alanyl-L-Glutamine</td></tr><tr><td>Human/Mouse/Rat/Canine ALCAM/CD166 Antibody</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AF1172</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2270</td><td></td></tr><tr><td>iMatrix-511 silk</td><td>Nippi</td><td>892021</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoBlock</td><td>KAC</td><td>CTKN001</td><td>Blokkingsoplossing</td></tr><tr><td>ITS-G Supplement(&times;100)</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>090-06741</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>128-06075</td><td></td></tr><tr><td>N-Hexanoic-Try-Ile-(6)-amino Hexanoic amide (Dihexa)</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>H293745</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal Rabbit Anti-Human Albumin</td><td>Dako</td><td>A0001</td><td></td></tr><tr><td>Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate (Tween 20)</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>28353-85</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>189-02025</td><td></td></tr><tr><td>Sodium L-Ascorbate</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>03422-32</td><td></td></tr><tr><td>StemFit AK02N</td><td>REPROCELL</td><td>RCAK02N</td><td></td></tr><tr><td>TBS (10x)</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>12748-31</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T668</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>28229-25</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>20577-34</td><td></td></tr><tr><td>TRYPSIN 250</td><td>Difco</td><td>215240</td><td></td></tr><tr><td>Tryptose phosphate broth solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8159</td><td></td></tr></tbody></table>

toepassing van levende mitochondriënkleuring bij het sorteren van cellen om hepatocyten te zuiveren die zijn afgeleid van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Application of Live Mitochondria Staining in Cell-Sorting to Purify Hepatocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Menselijke embryonale stamcellen (ES) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) hebben potentiële toepassingen in celgebaseerde regeneratieve geneeskunde voor de behandeling van ernstig zieke organen vanwege hun onbeperkte proliferatie en pluripotente eigenschappen. Het differentiëren van menselijke ES/iPS-cellen in 100% zuivere doelceltypen is echter een uitdaging vanwege hun hoge gevoeligheid voor de omgeving. Tumorigenese na transplantatie wordt veroorzaakt door besmette, prolifererende en ongedifferentieerde cellen, waardoor hoogzuiveringstechnologie essentieel is voor de veilige realisatie van regeneratieve geneeskunde. Om het risico op tumorigenese te verminderen, is een hoogzuiveringstechnologie ontwikkeld voor humane iPS-cel-afgeleide hepatocyten. De methode maakt gebruik van FACS (fluorescentie-geactiveerde celsortering) met behulp van een combinatie van een hoog mitochondriaal gehalte en de celoppervlaktemarker ALCAM (geactiveerd leukocytenceladhesiemolecuul) zonder genetische modificatie. 97% ± 0,38% (n = 5) van de gezuiverde hepatocyten die deze methode gebruikten, vertoonden albumine-eiwitexpressie. Dit artikel is bedoeld om gedetailleerde procedures te bieden voor deze methode, zoals toegepast op de meest recente tweedimensionale differentiatiemethode voor menselijke iPS-cellen in hepatocyten.

De tijdlijn van de processen die menselijke iPS-cellen induceren om te differentiëren tot hepatocyten door middel van 2D-cultuur (Figuur 1A) en representatieve celkenmerken (Figuur 1B) worden getoond. Ongeveer op differentiatiedag 12 begonnen cellen veelhoekige celvormen en ronde kernen te vertonen, kenmerkend voor hepatocyten. Sommige hepatocyten vertoonden ook multinucleatie.
FACS-analyse werd uitgevoerd met behulp van de cellen op ...

Hepatocyten afgeleid van pluripotente stamcellen kunnen worden gezuiverd door middel van celsortering, met behulp van een combinatie van mitochondriale en geactiveerde leukocytenceladhesiemolecuul (ALCAM, ook bekend als CD166) kleuring.

Toepassing van levende mitochondriënkleuring bij het sorteren van cellen om hepatocyten te zuiveren die zijn afgeleid van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Human embryonic stem (ES) and induced pluripotent stem (iPS) cells have potential applications in cell-based regenerative medicine for treating severely ...

De reikwijdte van ons onderzoek is het zuiveren van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide hepatocyten, zonder genetische modificatie. We streven ernaar het probleem van het tumorigene risico aan te pakken dat gepaard gaat met de ongedifferentieerde cellen, onder degenen die gedifferentieerd zijn van menselijke iPS-cellen. Een van de huidige experimentele uitdagingen is een lage celzuiverheid, als gevolg van de mechanische opslag van het sorteren.We ontwikkelen een nieuwe zuiveringsmethode, die gebruik maakt van de unieke stofwisselingskenmerken van hepatocyten, voor grootschalige zuivering. Eén niet-celsorteermethode voor voorlopercellen in de lever kan geen zuivere hepatocyten verkrijgen. Een andere voor rijpe hepatocyten kan slechts een klein deel van de hepatocyten behandelen, vanwege de beperkte expressie van het markereiwit.Daarentegen kan onze aanpak hepatocyten verkrijgen op verschillende rijpingsniveaus met een hogere eva. Humane iPS-cel-afgeleide hepatocyten zijn extreem onrijp en vertonen na zuivering een meer verminderde macro-expressie van hepatocyten. Ons toekomstige doel is om de modulatie van hepatocyten te verbeteren met behulp van organoïdale technologie en de dagelijkse vooruitgang op het gebied van regeneratieve geneeskunde en het ontdekken van geneesmiddelen.

application-live-mitochondria-staining-cell-sorting-to-purify

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze studie toont de herprogrammering van somatische cellen naar pluripotentie in vivo zonder de vorming van teratomen. We gebruikten hydrodynamische injectie in de staartader van plasmide-DNA dat codeert voor de Yamanka-factoren om de in vivo herprogrammering van volwassen hepatocyten in cellen met verbeterde pluripotentie te induceren.

In vivo herprogrammeren van volwassen lichaamscellen te Pluripotentie door overexpressie van Yamanaka Factors

Hier beschrijven we een robuust protocol voor de afstamming van menselijke cardiomyocyten dat klein molecuul-gemoduleerde cardiogene differentiatie combineert met glucosedeprivatie-gemedieerde zuivering van cardiomyocyten, waardoor het mogelijk wordt om gezuiverde cardiomyocyten te produceren voor het modelleren van hart- en vaatziekten en voor geneesmiddelenonderzoek.

Afleiding van zeer gezuiverde Cardiomyocyten van Human geïnduceerde pluripotente stamcellen Met behulp van kleine moleculen gemoduleerd Differentiatie en Latere Glucose Verhongering

Er wordt een techniek beschreven om menselijke hepatocyten en niet-parenchymale levercellen van dezelfde donor te isoleren. De verschillende leverceltypen vormen de basis voor functionele levermodellen en weefselengineering. Deze nieuwe methode streeft ernaar om levercellen met een hoge opbrengst en levensvatbaarheid te isoleren.

Protocol voor isolatie van primaire menselijke hepatocyten en Overeenkomstige Major Populaties van niet-parenchymale Liver Cells

Het doel van dit protocol is te verkrijgen van hoge levensvatbaarheid en hoog rendement van hepatocyten en sinusoïdale endotheliale cellen van lever. Dit wordt bereikt door zoogdierlevercellen de lever met een type IV collagenase oplossing via de portal ader, gevolgd door differentiële centrifugeren hepatocyten en sinusoïdale endotheliale cellen te verkrijgen.

Zuivering van hepatocyten en sinusvormige endotheliale cellen van lever muis perfusie

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een platform voor het identificeren van kleine moleculen voor de behandeling van de leverziekte. Een stapsgewijze beschrijving wordt gepresenteerd detailing how to onderscheiden iPSCs in cellen met hepatocyte kenmerken in 96-wells-platen, en gebruiken van de cellen om te screenen op kleine moleculen met potentiële therapeutische activiteit.

Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide Hepatocyte-achtige cellen voor drugontdekking

Dit protocol beschrijft een semi-automatische aanpak voor de productie van de hepatocyte-achtige cellen van menselijke pluripotente stamcellen in de indeling van een 96 goed plaat. Dit proces is snelle en kostenefficiënte, waardoor dat de productie van kwaliteit verzekerd batches van hepatocyte-achtige cellen voor fundamenteel en toegepast menselijke onderzoek.

Semi-automatische productie van Hepatocyte als cellen uit pluripotente stamcellen

Dit protocol Details een monolayer, serum-vrije methode voor het efficiënt genereren van hepatocyte-achtige cellen van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) in 18 dagen. Dit omvat zes stappen als hpscs sequentieel differentiëren in tussenliggende celtypen zoals de primitieve streak, definitieve endoderm, posterieure foregut en lever Bud voor ouders voor het vormen van hepatocyte-achtige cellen.

Efficiënte differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in levercellen

Primaire hepatocyten zijn een waardevol hulpmiddel om leverrespons en metabolisme in vitro te bestuderen. Met behulp van in de handel verkrijgbare reagentia werd een verbeterd tijd- en arbeidsefficiënt protocol voor primaire hepatocytenisolatie bij muizen ontwikkeld.

Een verbeterd tijd- en arbeidsefficiënt protocol voor primaire hepatocytenisolatie bij muizen

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor differentiatie van menselijke embryonale stamcellen (hESC's) in functionele hepatocyt-achtige cellen (HCC's) door continu Activine A en CHIR99021 aan te vullen tijdens hESC-differentiatie tot definitief endoderm (DE).

Een efficiënte methode voor gerichte hepatocyt-achtige celinductie uit menselijke embryonale stamcellen

Deze studie rapporteert een nieuwe benadering om meerdere mitochondriale functionele parameters te meten op basis van flowcytometrie en dubbele kleuring met twee fluorescerende melders of antilichamen om veranderingen in mitochondriaal volume, mitochondriaal membraanpotentiaal, reactief zuurstofsoortniveau, mitochondriale ademhalingsketensamenstelling en mitochondriaal DNA te detecteren.

Flowcytometrische analyse van meerdere mitochondriale parameters in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen en hun neurale en gliaderivaten

Leer hoe je hepatocyten zuivert uit door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen met levende mitochondriënkleuring en FACS. Deze methode bereikt 97% zuiverheid zonder genetische modificatie.

Toepassing van levende mitochondriënkleuring bij het sorteren van cellen om hepatocyten te zuiveren die zijn afgeleid van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (Video) | JoVE Journal

Toepassing van levende mitochondriënkleuring bij het sorteren van cellen om hepatocyten te zuiveren die zijn afgeleid van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Meer video's verkennen