Name: Computationele analyse Tutorial voor chimeer klein niet-coderend RNA: Target RNA Sequencing Libraries (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Leer de SCRAP bio-informatica-pijplijn installeren en gebruiken voor analyse van chimerisch niet-coderend RNA en doelwit-RNA-interacties. Deze methode helpt onderzoekers bij het identificeren van hoogbetrouwbare RNA-interacties via Peak_Calling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken de leden van het Meffert-laboratorium voor nuttige discussies, waaronder BH Powell en WT Mills IV, voor hun kritische feedback over het beschrijven van de installatie en implementatie van de pijpleiding. Dit werk werd ondersteund door een Braude Foundation-prijs, het Maryland Stem Cell Research Fund Launch Program, de Blaustein Endowment for Pain Research and Education-prijs en NINDS RO1NS103974 en NIMH RO1MH129292 aan MKM.

OPMERKING: Het protocol begint met het downloaden en installeren van software die nodig is om chimere RNA-sequencingbibliotheken te analyseren met behulp van SCRAP.
1. Installatie
<ol><li>Voordat u SHROOT installeert, installeert u de afhankelijkheden Git en Miniconda op de machine die voor de analyses moet worden gebruikt. Git is waarschijnlijk al geïnstalleerd. Op het Mac OSX-platform, bijvoorbeeld, controleer dit met behulp van welke git om te zien of het " git " hulpprogramma aanwezig is en geïnstalleerd is in deze map. Controleer of Miniconda is geïnstalleerd met welke conda. Als er niets wordt geretourneerd, installeert u Miniconda. De installatie van Miniconda vereist 400 MB schijfruimte.<ol><li>Er zijn een paar methoden om Miniconda te installeren, en ze verschillen per platform. Raadpleeg het PLATFORM-SETUP markdown-bestand op de Meffert Lab GitHub-repository [https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP/blob/main/PLATFORM-SETUP.md] waar verdere instructies staan voor het installeren op Windows, MacOS en Ubuntu. Voor Linux-gebruikers heeft Linux zijn eigen standaard pakketbeheerder (apt). In het specifieke geval van dit onderzoek gebruikt u de opdracht brew install Miniconda om Miniconda te installeren met behulp van een bestaande pakketbeheerder, brew. OPMERKING: 'Homebrew', ook wel 'brew' genoemd, is een open-source softwarepakketbeheersysteem dat de installatie van software op het besturingssysteem van Apple, macOS, vereenvoudigt.</li>
		<li>Als conda voor de eerste keer wordt geïnstalleerd, voer dan conda init uit voor de specifieke shell die in gebruik is. In het voorbeeld hier is die shell die wordt gebruikt zsh. Sluit vervolgens de schaal en open deze opnieuw. Als conda met succes is geïnstalleerd, wordt de basisomgeving gezien die binnen de terminalsessie is geactiveerd.</li>
	</ol></li>
	<li>Download de SCRAP-broncode en installeer de afhankelijkheden.<ol><li>De voorkeursmethode voor het verkrijgen van SCRAP-bronnen is het gebruik van Git. Open dit door git clone https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP uit te voeren om de laatste kopie van de broncode te verkrijgen.</li>
		<li>Installeer mamba, een verbeterde pakketoplosser voor conda, en installeer alle afhankelijkheden voor SCRAP van SCRAP_environment.yml naar zijn eigen conda-omgeving met behulp van de volgende opdrachten: conda install -n base conda-forge::mamba mamba env create -f SCRAP/SCRAP_environment.yml -n SCRAP</li>
	</ol></li>
	<li>Voer vervolgens de referentie-installatie voor SCRAP uit. De argumenten die in de referentie-installatie worden gebruikt, zullen specifiek zijn voor het organisme waarvan de sncRNA-mRNA-interacties worden geanalyseerd. bash SCHROOT/bak/Reference_Installation.sh -r vol/pad/naar/SCHROOT/ -m heeft -g hg38 -s mens
	<ol><li>Geef de map van de SCRAP-bronmap op voor referentie-installatie. Installatiestappen worden vervolgens uitgevoerd met behulp van de bestanden in de fasta - en annotatiemappen . Maak een lijst van het volledige pad zonder steno. Eindig met een schuine streep.</li>
		<li>Raadpleeg de tabellen in README.md voor de juiste afkortingen van miRbase-soorten. De up-to-date referentiegenomen zijn te vinden op https://genome.ucsc.edu/ of https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/. In dit voorbeeld wordt hg38 gebruikt voor het GRCm38-genoom van de muis.</li>
		<li>De momenteel opgenomen soorten voor annotatie zijn mens, muis en worm. Bekijk de corresponderende species.annotation.bed-bestanden in de annotatiemap in de SCRAP-bronmap. Als het gebruik van een andere soort voor analyse gewenst is, geef dan een annotation.bed-bestand op dat hetzelfde naamgevingsschema volgt: species.annotation.bed.</li>
	</ol></li>
</ol>2. SCHROOT uitvoeren
<ol><li>Nu de afhankelijkheden en SCRAP zijn geïnstalleerd, voert u het script uit SCRAP.sh bash SCHROOT/bin/SCRAP.sh -d vol/pad/naar/CLASH_Human/ -a vol/pad/naar/CLASH_Human/CLASH_Human_Adapters.txt -p nee -f ja -r vol/pad/naar/SCHROOT/ -m heeft -g hg38
	<ol><li>Maak een lijst van het volledige pad naar de voorbeeldmappen zonder steno. Maak de voorbeeldmappen op met de mapnaam die exact overeenkomt met de voorbeeldnaam, zoals weergegeven in afbeelding 1.</li>
		<li>Houd er rekening mee dat het vermelde pad het pad is naar de map die alle voorbeeldmappen bevat, niet het pad naar een afzonderlijke voorbeeldmap of een voorbeeldbestand (raadpleeg de opdrachtregel in stap 2.1).</li>
		<li>Maak vervolgens een lijst van het volledige pad naar het adapterbestand. Zorg ervoor dat de voorbeeldnamen in het adapterbestand overeenkomen met de eerder genoemde mapnamen en bestandsnamen (zie de opdrachtregel in stap 2.1).</li>
		<li>Geef aan of de monsters paired-end zijn en of er al dan niet gefilterd zal worden op pre-miRNA's en/of tRNA's. Voeg desgewenst een filter toe voor rRNA-reiniging (zie de opdrachtregel in stap 2.1). OPMERKING: De gebruikers kunnen al dan niet besluiten om deze filters te gebruiken, afhankelijk van de steekproeftypen en experimentele doelen. Afhankelijk van het experimentele ontwerp kunnen pre-miRNA's, tRNA's en rRNA's de beschikbare sequencingdiepte gebruiken voor echte sncRNA:target RNA-chimaera's en gebruikers kunnen filters gebruiken om ze uit te sluiten. Gebruikers kunnen een dergelijke filtering in bepaalde omstandigheden echter vermijden (bijv. het in kaart brengen van sncRNA-doelen op het mitochondriale genoom, dat mitochondriale rRNA's bevat).</li>
		<li>Maak vervolgens een lijst van het volledige pad naar de referentiemap, de afkorting miRbase en de afkorting van het referentiegenoom (zie de opdrachtregel in stap 2.1). OPMERKING: Het kan enkele uren duren voordat het script is voltooid, afhankelijk van de grootte van de gegevensset en de CPU van de computer die wordt gebruikt.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Piek bellen en annotatie
<ol><li>Zodra SCRAP klaar is met draaien, controleert u of de uitvoer onder andere een SAMPLE.aligned.unique.bam-bestand bevat. Dit is een binair bestand met uitlijningen van doel-RNA's op het door de gebruiker verstrekte referentiegenoom.</li>
	<li>Voer nu piekgesprekken uit door Peak_Calling.sh uit te voeren. bash SCHROOT/bak/Peak_Calling.sh -d CLASH_Human/ -a CLASH_Human/CLASH_Human_Adapters.txt -c 3 -l 2 -f no -r SCRAP/ -m has -g hg38 OPMERKING: Piekaanroepen is een functie van SCRAP, die is ontworpen om onderzoekers in staat te stellen gemakkelijk de meest robuuste en reproduceerbare kleine niet-coderende RNA:doel-RNA-interacties binnen hun chimere RNA-bibliotheken te evalueren. Deze functie kan onderzoekers bijvoorbeeld helpen bij het identificeren van interacties die ze mogelijk willen selecteren voor verder onderzoek. In stap 3.2.2 hieronder wordt beschreven hoe de gebruiker de criteria instelt die hij wil gebruiken om de stringentie te definiëren waarmee een piek wordt aangeroepen - dit omvat het aantal unieke interacties, of sequencing-lezingen, die moeten hebben plaatsgevonden om de piek op te roepen, evenals het aantal bibliotheken waarin deze specifieke interactie moet hebben plaatsgevonden.<ol><li>Maak opnieuw een lijst van de volledige paden naar de map met de voorbeeldmappen en het adapterbestand (raadpleeg de opdrachtregel in stap 3.2).</li>
		<li>Stel vervolgens het minimum aantal sequentie-reads in dat nodig is om een piek op te roepen (zie de opdrachtregel in stap 3.2).</li>
		<li>Stel het minimum aantal afzonderlijke sequencingbibliotheken in dat een piek moet bevatten om te worden aangeroepen (raadpleeg de opdrachtregel in stap 3.2). OPMERKING: De keuze van de waarden voor zowel 3.2.2 als 3.2.3 hangt af van de aard van de gesequencede monsters en het aantal monsters of monstertypen. Hier zijn ten minste 3 chimere sequencing-lezingen in een monster vereist om een piek op te roepen, en de piek moet worden ondersteund door ten minste 2 monsters. Een onderzoeker die een gegevensset evalueert waarin veel replica's van sequencingbibliotheken voor een bepaalde aandoening voorkomen, kan bijvoorbeeld besluiten om de aanwezigheid van de reads in een groter aantal sequencingbibliotheken te vereisen.</li>
		<li>Geef aan of sncRNA's van dezelfde familie moeten bijdragen aan dezelfde piek. Omdat miRNA's van dezelfde familie bijvoorbeeld zaadsequenties delen, kunnen deze miRNA's gedeelde en overlappende sets gendoelen binden; Een gebruiker kan de volledige impact van een familie op deze doelen identificeren door hun collectieve pieken te beoordelen (zie de opdrachtregel in stap 3.2).</li>
		<li>Geef vervolgens het volledige pad naar de referentiemap, de afkorting miRBase en de afkorting van het referentiegenoom aan (zie de opdrachtregel in stap 3.2).</li>
	</ol></li>
	<li>Zodra de piekaanroep is voltooid, voert u de piekannotatie uit. bash SCHROOT/bak/Peak_Annotation.sh -p CLASH_Human/peaks.bed -r SCHROOT/ -s mens
	<ol><li>Maak een lijst van het volledige pad naar het resulterende bestand peaks.bed (of peaks.family.bed ) vanaf het aanroepen van pieken, het volledige pad naar de referentiemap en de gewenste soort voor annotatie.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Visualiseren van de data
OPMERKING: Alle stappen voor analyse met behulp van SCRAP zijn nu voltooid. Voor het visualiseren van de gegevens worden verschillende benaderingen aanbevolen:
<ol><li>Voeg alle .bam-bestanden (binair SAM-bestand) samen die u samen wilt visualiseren (samtools merge).</li>
	<li>Sorteer het resulterende samengevoegde .bam-bestand (samtools sort). De inhoud van het bestand wordt regel voor regel gesorteerd, zodat samtools kan indexeren.</li>
	<li>Indexeer het gesorteerde .bam-bestand (samtools-index). Er wordt een BAI-bestand (binary samtools format index) gegenereerd om visualisatie in de integratieve genomicsviewer (IGV) mogelijk te maken.</li>
	<li>Open ten slotte het resulterende gesorteerde .bam- en geïndexeerde .bai-bestand in IGV. OPMERKING: SncRNA: Doel-RNA-interacties die van belang zijn, kunnen op een aantal onderzoeksspecifieke manieren prioriteit krijgen voor follow-up. Een algemene eerste benadering is het beoordelen van de interacties waarvoor pieken worden ondersteund door de meest chimere sequencing-metingen. Interacties van belang kunnen ook worden gevisualiseerd met behulp van de DuplexFold-webserver uit het RNAstructure-pakket door de sequentie voor zowel het sncRNA als het doel-RNA van de gedetecteerde interactiein te voeren 11. Voor elke piek zijn het chromosoom (eerste kolom) en de genomische coördinaten (begin: 1e kolom einde: 2e kolom) te vinden in het peaks.bed.species.annotation.txt bestand dat is gegenereerd in piekannotatie. Voor miRNA's in het bijzonder, hoewel reproduceerbare en functionele interacties geen uitgebreide zaadgematchte binding kunnen hebben (bijv. interacties kunnen 3' compenserende binding gebruiken), kan de aanwezigheid van zaad-gematchte plaatsen in een verwant bindingsmotief van het doel-RNA niettemin worden beoordeeld als een validerend kenmerk van functioneel belangrijke gedetecteerde interacties 4,12. Aanvullende gegevensverwerking kan bestaan uit vergelijkingen van differentiële leesdekking tussen pieken in verschillende biologische omstandigheden en mogelijk beoordeling van clustering van gereguleerde genen in routes met behulp van een pathway-analysetool.</li>
</ol>

In vivo RNA: RNA-interacties met behulp van de SCRAP-bioinformaticapijplijn

<ol><li>Morris, K. V., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rise+of+regulatory+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The rise of regulatory RNA.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (6), 423-437 (2014).</li>
<li>Li, X., Jin, D. S., Eadara, S., Caterina, M. J., Meffert, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+by+noncoding+RNAs+of+local+translation%2C+injury+responses%2C+and+pain+in+the+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Pain+%28Cambridge%2C+Mass.%29%22%5BJournal%5D)">Regulation by noncoding RNAs of local translation, injury responses, and pain in the peripheral nervous system.</a> Neurobiology of Pain (Cambridge, Mass.). 13, 100119(2023).</li>
<li>Shi, J., Zhou, T., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+expanding+universe+of+small+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exploring the expanding universe of small RNAs.</a> Nature Cell Biology. 24 (4), 415-423 (2022).</li>
<li>Broughton, J. P., Lovci, M. T., Huang, J. L., Yeo, G. W., Pasquinelli, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pairing+beyond+the+seed+supports+microRNA+targeting+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Pairing beyond the seed supports microRNA targeting specificity.</a> Molecular Cell. 64 (2), 320-333 (2016).</li>
<li>Grosswendt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unambiguous+identification+of+miRNA%3Atarget+site+interactions+by+different+types+of+ligation+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Unambiguous identification of miRNA:target site interactions by different types of ligation reactions.</a> Molecular Cell. 54 (6), 1042-1054 (2014).</li>
<li>Mills, W. T., Eadara, S., Jaffe, A. E., Meffert, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCRAP%3A+a+bioinformatic+pipeline+for+the+analysis+of+small+chimeric+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">SCRAP: a bioinformatic pipeline for the analysis of small chimeric RNA-seq data.</a> RNA. 29 (1), 1-17 (2023).</li>
<li>Helwak, A., Kudla, G., Dudnakova, T., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+human+miRNA+interactome+by+CLASH+reveals+frequent+noncanonical+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping the human miRNA interactome by CLASH reveals frequent noncanonical binding.</a> Cell. 153 (3), 654-665 (2013).</li>
<li>Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA-200+family+coordinately+regulates+cell+adhesion+and+proliferation+in+hair+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).</li>
<li>Moore, M. J., Zhang, C., Gantman, E. C., Mele, A., Darnell, J. C., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+Argonaute+and+conventional+RNA-binding+protein+interactions+with+RNA+at+single-nucleotide+resolution+using+HITS-CLIP+and+CIMS+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis.</a> Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).</li>
<li>Bjerke, G. A., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+analysis+of+directly+captured+microRNA+targets+reveals+the+impact+of+microRNAs+on+mammalian+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Integrated analysis of directly captured microRNA targets reveals the impact of microRNAs on mammalian transcriptome.</a> RNA. 26 (3), 306-323 (2020).</li>
<li>Reuter, J. S., Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAstructure%3A+software+for+RNA+secondary+structure+prediction+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis.</a> BMC Bioinformatics. 11 (1), 129(2010).</li>
<li>Moore, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA-target+chimeras+reveal+miRNA+3%E2%80%B2-end+pairing+as+a+major+determinant+of+Argonaute+target+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">miRNA-target chimeras reveal miRNA 3′-end pairing as a major determinant of Argonaute target specificity.</a> Nature Communications. 6 (1), 8864(2015).</li>
<li>Travis, A. J., Moody, J., Helwak, A., Tollervey, D., Kudla, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyb%3A+a+bioinformatics+pipeline+for+the+analysis+of+CLASH+%28crosslinking%2C+ligation+and+sequencing+of+hybrids%29+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif.%29%22%5BJournal%5D)">Hyb: a bioinformatics pipeline for the analysis of CLASH (crosslinking, ligation and sequencing of hybrids) data.</a> Methods (San Diego, Calif.). 65 (3), 263-273 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol voor het gebruik van de SCRAP-pijplijn voor analyse van sncRNA:doel-RNA-interacties is ontworpen om onderzoekers te helpen bij het uitvoeren van computationele analyse. Van de voltooiing van de zelfstudie wordt verwacht dat onderzoekers met rekenervaring op instapniveau of hoger door de stappen worden geleid die nodig zijn voor de installatie en het gebruik van deze pijplijn en de toepassing ervan om gegevens te analyseren die zijn verkregen uit chimere RNA-sequencingbibliotheken. Stappen die cruciaal zijn v...

Kleine niet-coderende RNA's zijn sterk bestudeerd vanwege hun post-transcriptionele rol bij het coördineren van expressie van genenreeksen in diverse processen zoals differentiatie en ontwikkeling, signaalverwerking en ziekte 1,2,3. Het vermogen om nauwkeurig de doeltranscripten van genregulerende kleine niet-coderende RNA's (sncRNA's), inclusief microRNA's (miRNA's), te bepalen, is van belang voor studies van RNA-biologie op zowel basis- als translationeel niveau. Bio-informatica-algoritmen die gebruik maken van de verwachte complementariteit tussen de miRNA-zaadsequentie en zijn potentiële doelwitten zijn vaak gebruikt voor de voorspelling van miRNA:doel-RNA-interacties. Hoewel deze bio-informatica-algoritmen succesvol zijn geweest, kunnen ze ook zowel vals-positieve als vals-negatieve resultaten bevatten, zoals elders is besproken 4,5,6. Onlangs zijn er verschillende biochemische benaderingen ontworpen en geïmplementeerd die een ondubbelzinnige en semikwantitatieve bepaling van in vivo sncRNA:doel-RNA-interacties mogelijk maken door in vivo crosslinking en de daaruit voortvloeiende opname van een ligatiestap om het sncRNA fysiek aan zijn doelwit te hechten om een enkel chimeer RNA te vormen 4,5,7,8,9,10 . Latere voorbereiding van sequencingbibliotheken van de chimere RNA's maakt het mogelijk om de sncRNA:doel-RNA-interacties te beoordelen door computationele verwerking van de sequentiegegevens. Deze video biedt een zelfstudie voor het installeren en gebruiken van een computationele pijplijn genaamd kleine chimere RNA-analysepijplijn (SCRAP), die is ontworpen om robuuste en reproduceerbare analyse van sncRNA:doel-RNA-interacties uit chimere RNA-sequencingbibliothekenmogelijk te maken 6.
Een doel van deze tutorial is om onderzoekers te helpen bij het vermijden van overmatige afhankelijkheid van puur voorspellende bio-informatica-algoritmen door barrières te verlagen voor de analyse van gegevens die zijn gegenereerd door biochemische benaderingen die chimere moleculaire uitlezingen van sncRNA:doel-RNA-interacties bieden. Deze zelfstudie biedt praktische stappen en tips om beginnende computationele wetenschappers te begeleiden bij het gebruik van een pijplijn, SCRAP, ontwikkeld voor het analyseren van chimere RNA-sequencinggegevens, die kunnen worden gegenereerd door verschillende bestaande biochemische protocollen, waaronder crosslinking, ligatie en sequencing van hybriden (CLASH) en covalente ligatie van endogene Argonaute-gebonden RNA's - crosslinking en immunoprecipitatie (CLEAR-CLIP)7,9.
Het gebruik van SCRAP biedt verschillende voordelen voor de analyse van chimere RNA-sequencinggegevens, in vergelijking met andere computationele pijplijnen6. Een opvallend voordeel is de uitgebreide annotatie en de integratie van call-outs naar goed ondersteunde en routinematig bijgewerkte bio-informaticascripts in de pijplijn, in vergelijking met alternatieve pijplijnen die vaak afhankelijk zijn van aangepaste en/of niet-ondersteunde scripts voor stappen in de pijplijn. Deze functie geeft stabiliteit aan SCRAP, waardoor het voor onderzoekers meer de moeite waard is om vertrouwd te raken met de pijplijn en het gebruik ervan in hun workflow op te nemen. Van SCRAP is ook aangetoond dat het beter presteert dan alternatieve pijplijnen bij het aanroepen van pieken van sncRNA:doel-RNA-interacties en dat het platformonafhankelijke functionaliteit heeft, zoals beschreven in een eerdere publicatie6.
Aan het einde van deze zelfstudie zijn gebruikers in staat om (i) de platformvereisten voor SCRAP te kennen en SCRAP-pijplijnen te installeren, (ii) referentiegenomen te installeren en opdrachtregelparameters voor SCRAP in te stellen, en (iii) de criteria voor piekaanroepen te begrijpen en piekaanroepen en piekannotatie uit te voeren.
Deze video zal in praktisch detail beschrijven hoe onderzoekers die RNA-biologie bestuderen, de computationele pijplijn, SCRAP, kunnen installeren en optimaal kunnen gebruiken om sncRNA-interacties met doel-RNA's, zoals boodschapper-RNA's, te analyseren in chimere RNA-sequencinggegevens die zijn verkregen via een van de besproken biochemische benaderingen voor de voorbereiding van sequencing-bibliotheken.
SCRAP is een opdrachtregelprogramma. Over het algemeen moet de gebruiker, volgens de onderstaande gids, (i) SCRAP downloaden en installeren (https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP), (ii) referentiegenomen installeren en SHROOT uitvoeren, en (iii) piekaanroepen en annotatie uitvoeren.
Meer informatie over de rekenstappen in deze procedure is te vinden op https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP. Dit artikel biedt de opzet en achtergrondinformatie om onderzoekers met rekenvaardigheden op instapniveau in staat te stellen SCRAP te installeren, te optimaliseren en te gebruiken op chimere RNA-sequencingbibliotheekdatasets.

<table><tbody><tr><td>Genomes</td><td>UCSC Genome browser</td><td>N/A</td><td>https://genome.ucsc.edu/ of https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/</td></tr><tr><td>Linux</td><td>Linux</td><td>Ubuntu 20.04 of 22.04 LTS aanbevolen</td><td></td></tr><tr><td>Mac</td><td>Apple</td><td>Mac OSX (>11)</td><td></td></tr><tr><td>Platform instelling</td><td>GitHub</td><td>N/A</td><td>https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP/blob/main/PLATFORM-SETUP.md]</td></tr><tr><td>SCRAP pipeline</td><td>GitHub</td><td>N/A</td><td>https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP</td></tr><tr><td>Unix shell</td><td>Unix operating system</td><td>bash >=5.0</td><td></td></tr><tr><td>Unix shell</td><td>Unix operating system</td><td>zsh (5.9 aanbevolen)</td><td></td></tr><tr><td>Windows</td><td>Windows</td><td>WSL Ubuntu 20.04 of 22.04 LTS</td><td></td></tr></tbody></table>

computationele analyse tutorial voor chimeer klein niet-coderend rna: target rna sequencing libraries

Computational Analysis Tutorial for Chimeric Small Noncoding RNA: Target RNA Sequencing Libraries

Een beter begrip van de in vivo genregulerende interacties van kleine niet-coderende RNA's (sncRNA's), zoals microRNA's (miRNA's), met hun doel-RNA's is de afgelopen jaren bevorderd door biochemische benaderingen die gebruik maken van cross-linking gevolgd door ligatie om sncRNA:doel-RNA-interacties vast te leggen door de vorming van chimere RNA's en daaropvolgende sequencingbibliotheken. Hoewel datasets van chimere RNA-sequencing genoombrede en aanzienlijk minder dubbelzinnige input bieden dan miRNA-voorspellingssoftware, vereist het destilleren van deze gegevens tot zinvolle en bruikbare informatie aanvullende analyses en kan het onderzoekers zonder een computationele achtergrond afschrikken. Dit rapport biedt een tutorial om beginnende computationele biologen te ondersteunen bij het installeren en toepassen van een recente open-source softwaretool: Small Chimeric RNA Analysis Pipeline (SCRAP). Platformvereisten, updates en een uitleg van pijplijnstappen en manipulatie van belangrijke variabelen voor gebruikersinvoer worden verstrekt. Het verminderen van een barrière voor biologen om inzichten te verwerven uit chimere RNA-sequencingbenaderingen heeft het potentieel om op ontdekking gebaseerde onderzoeken naar regulerende sncRNA:doel-RNA-interacties in meerdere biologische contexten te starten.

Resultaten voor sncRNA:doel-RNA gedetecteerd door een gemodificeerde versie van SCRAP (SCRAP release 2.0, die modificaties voor rRNA-filtering implementeert) op eerder gepubliceerde sequencing-datasets die zijn opgesteld met behulp van CLEAR-CLIP9 , worden weergegeven in figuur 2 en tabel 1. Gebruikers kunnen de afname van de relatieve fractie miRNA-interacties met intronregio's waarderen die optreedt na de isolatie van interacties met hoge betrouwbaa...

Hier presenteren we een protocol dat de installatie en het gebruik van een bio-informaticapijplijn demonstreert om chimere RNA-sequencinggegevens te analyseren die worden gebruikt in de studie van in vivo RNA:RNA-interacties.

Computationele analyse Tutorial voor chimeer klein niet-coderend RNA: Target RNA Sequencing Libraries

An understanding of the in vivo gene regulatory interactions of small noncoding RNAs (sncRNAs), such as microRNAs (miRNAs), with their target RNAs has ...

Dit protocol omvat de installatie en praktische stappen voor het gebruik van een computationele pijplijn die is ontworpen om sequencinggegevens met hoge doorvoer te analyseren van chimere niet-coderende RNA-doel-RNA-interacties. De moleculaire strategie om chimere RNA's te vormen is een relatief recente ontwikkeling die voordelen heeft in vergelijking met eerdere biochromatische voorspellingstools bij het ondubbelzinnig begrijpen van het genoombrede niet-coderende RNA-doelwit-RNA-interactielandschap. Sequentiegegevens die worden gegenereerd door de sequencing van de chimere RNA's met hoge doorvoer kunnen een analyse-uitdaging vormen voor nieuwe gebruikers van deze strategie.We hebben een open source cross-platform computationele pijplijn opgezet die sterk geannoteerd is om beginnende gebruikers in staat te stellen gegevens te analyseren van hun chimere niet-coderende RNA-doel-RNA-sequencing-experimenten. In toekomstige experimenten is het Mefford-lab van plan om computationele analyse te gebruiken door middel van een dataset die is gegenereerd uit onze lopende onderzoeken naar posttranscriptionele regulatie in het zenuwstelsel van zoogdieren, en om een update-scrap op onze GitHub bij te houden.

computational-analysis-tutorial-for-chimeric-small-noncoding-rna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we een methode voor de bereiding van zowel de single lezen en gekoppeld end Illumina mRNA-Seq sequencing bibliotheken voor genexpressie analyse op basis van T7-RNA lineaire versterking. Dit protocol vereist slechts 10 nanogram van het starten van totaal RNA en genereert een uiterst consistente bibliotheken vertegenwoordigt hele transcripten.

Single Lees en Gepaarde End mRNA-Seq Illumina Bibliotheken van 10 nanogram Totaal RNA

Dit protocol geeft een volledige en gedetailleerde procedure voor RNA-seq, een krachtige volgende generatie DNA sequencing technologie, toepassing profiel transcriptomen in menselijke long microvasculaire endotheliale cellen met of zonder behandeling trombine. Dit protocol is generaliseerbaar verschillende cellen of weefsels die door verschillende reagentia of ziekten.

RNA-seq Analyse van transcriptomen in trombine-behandelde en Control Human Pulmonary microvasculaire endotheelcellen

We beschrijven een op getarget RNA-sequencing gebaseerde methode die de voorbereiding van geïndiceerde cDNA-bibliotheken, hybridisatie en captuur met aangepaste sondes en data-analyse om geselecteerde transcripten te onderzoeken op genexpressie, mutaties en genfusies omvat. Getarget RNAseq maakt een kosteneffectieve, snelle evaluatie van geselecteerde transcripten mogelijk op een desktop sequencer.

Gerichte RNA Sequencing Assay Gene Expression en Genomic Wijzigingen karakteriseren

Hier beschrijven we een protocol gericht op onderzoek naar de gevolgen van afwijkende splicing op resistentie in solide tumoren en hematologische maligniteiten. Om dit doel te bereiken, analyseerden we het transcriptoom profielen van de ouders en bestand in vitro modellen door middel van RNA-seq en vestigde een qRT-PCR-methode om kandidaatgenen te valideren.

Met behulp van RNA-sequencing te detecteren Novel Splice varianten Gerelateerd aan Drug Resistance in<em&gt; In Vitro</em&gt; Cancer Models

Dit protocol beschrijft het combinatorische gebruik van ChIP-seq, 4sU-seq en totaal RNA-seq ribosoom profilering voor cellijnen en primaire cellen. Hierdoor wijzigingen bijhouden in transcriptiefactor bindend, DOVO transcriptie, RNA-verwerking, omzet en vertaling na verloop van tijd, en de algemene gang van zaken in geactiveerd en/of snel veranderende cellen weer te geven.

Real-time analyse van transcriptiefactor bindend, transcriptie, vertaling en omzet globale u gebeurtenissen wilt weergeven tijdens de activatie van de cellulaire

Circulaire Rna's (Circrna's) zijn niet-Codeer Rna's die mogelijk rollen hebben in transcriptionele regulatie en die interacties tussen eiwitten bemiddel- Na beoordeling van verschillende parameters voor de bouw van circRNA sequencing Bibliotheken, een protocol werd gecompileerd met behulp van gestrande Total RNA Library voorbereiding met RNase R pre-behandeling en wordt hier gepresenteerd.

Identificatie van circulaire Rna's met RNA-sequencing

We presenteren een gedetailleerd klein RNA Library Reparatie protocol met minder bias dan standaardmethodes en een verhoogde gevoeligheid voor 2 '-O-methyl rna's. Dit protocol kan worden gevolgd met behulp van zelfgemaakte reagentia om kosten te besparen of kits te gebruiken voor het gemak.

Verbetering van kleine RNA-SEQ: minder bias en betere detectie van 2 '-O-methyl Rna's

Absolute kwantificering RNA-sequencing (AQRNA-seq) is een technologie die is ontwikkeld om het landschap van alle kleine RNA's in biologische mengsels te kwantificeren. Hier worden zowel de bibliotheekvoorbereidings- als de gegevensverwerkingsstappen van AQRNA-seq gedemonstreerd, waarbij veranderingen in de transfer-RNA (tRNA)-pool in Mycobacterium bovis BCG worden gekwantificeerd tijdens door uithongering veroorzaakte rustperiode.

AQRNA-seq voor het kwantificeren van kleine RNA's

Dit protocol maakt een eerste kwaliteitscontrole mogelijk voor RNA-seq-experimenten voor wet-lab biologen met beperkte bio-informatica-ervaring.

Rup (RNA-seq Usability Assessment Pipeline) - Kwaliteitscontrole voor bulk RNA-seq-experimenten in eukaryoten

We hebben uitgebreide, onpartijdige genoom-brede schermen van gen-drugs-en gen-omgeving interacties te begrijpen. Methoden voor het screenen van deze mutant collecties worden gepresenteerd.

Concurrerende Genomische Schermen van streepjescode Gist Bibliotheken

Leer de SCRAP bio-informatica-pijplijn installeren en gebruiken voor analyse van chimerisch niet-coderend RNA en doelwit-RNA-interacties. Deze methode helpt onderzoekers bij het identificeren van hoogbetrouwbare RNA-interacties via Peak_Calling.

Computationele analyse Tutorial voor chimeer klein niet-coderend RNA: Target RNA Sequencing Libraries

Meer video's verkennen