Name: Beeldvorming flowcytometrie om microbiële autoaggregatie te bestuderen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 19 s
Description: Leer beeldvorming flowcytometrie om microbiële autoaggregatie te bestuderen met Lactobacillaceae. Deze methode analyseert het effect van voedingskoolhydraten op aggregatiegedrag en biedt inzicht in microbele dynamica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Israeli Science Foundation (Grant 119/16) en IMoh grant (3-15656) aan IKG. R.S. ondersteund door de Kreitman fellowship.

Het .ast-bestand, met het sjabloon voor Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) als voorbeeld, wordt geleverd in aanvullend coderingsbestand 1.
1. Voorbereiding van de media
<ol><li>Bereid Lactobacill MRS-bouillon volgens de instructies van de fabrikant (55 g in 1 L gedeïoniseerd water) en Lactobacill MRS-agarplaten met 1,5% (w/v) agar (zie Materiaaltabel). Na sterilisatie in de autoclaaf is het medium direct klaar voor gebruik of kan het bij 4 °C worden bewaard.</li>
	<li>Bereid 50% (15 g in 1 L gedeïoniseerd water) tryptische sojabouillon (TSB) (zie materiaaltabel), TSB aangevuld met 1% (w/v) D-(+)-glucose en 1% (w/v) D-(+)-raffinose, autoclaaf om het medium te steriliseren. Het verdient de voorkeur om het bij 4 °C te bewaren om besmetting te voorkomen.</li>
	<li>Voor een gebufferd medium met glucose, bereid TSB aangevuld met 1% (w/v) D-(+)-glucose, 5 mM kaliumfosfaat monobasisch samen met kaliumdibasisch en 100 mM MOPS (3-(N-morfolino) propaansulfonzuur, zie Materiaaltabel) pH 7. Vervolgens autoclaaf om het medium te steriliseren.</li>
</ol>2. Bereiding van de monsters
OPMERKING: Deze stap omvat de evaluatie van cellulaire aggregatie als reactie op fermenteerbare of niet-fermenteerbare suiker uit onze voeding. Een schematische weergave van het monstervoorbereidingsproces is weergegeven in figuur 1.
<ol><li>Strijk de Lactobacillaceae-stam uit een bevroren glycerolbouillon (50% glycerol) op een Lactobacilli MRS-bouillonplaat (1,5% agar). OPMERKING: In het hier gepresenteerde voorbeeldexperiment werden probiotische stammen Lactobacillus acidophilus (ATCC 4356), Lacticaseibacillus casei (ATCC 393), Lacticaseibacillus casei subsp. paracasei (ATCC BAA-52), Lactiplantibacillus plantarum (ATCC 8014) en Lacticaseibacillus rhamnosus GG (ATCC 53103) (LGG) gebruikt. Om deze methodologie uit te breiden naar extra probiotische leden van de firmicutes-stam, werd Bacillus coagulans (ATCC 10545) geselecteerd.</li>
	<li>Laat de cellen 's nachts groeien bij 37 °C onder statische omstandigheden.</li>
	<li>Inoculeer 5 ml Lactobacill MRS-bouillon met een enkele kolonie en laat deze 's nachts groeien bij 37 °C onder statische omstandigheden.</li>
	<li>Verdun de celcultuur uit de vorige stap (1:100) in 3 ml 50% Tryptische sojabouillon (TSB), TSB aangevuld met 1% (w/v) D-(+)-glucose, of TSB aangevuld met 1% (w/v) D-(+)-raffinose.</li>
	<li>'s Nachts uitbroeden bij 37 °C onder statische omstandigheden.</li>
	<li>Bereid het monster voor door de cellen gelijkmatig in het medium te mengen en draai de celkweekbuis vanaf stap 2.5 voorzichtig rond. Keer de reageerbuis voorzichtig om totdat het mengen volledig is voltooid. Breng 200-300 μL over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. OPMERKING: Het is essentieel om het monster niet te sonificeren om te voorkomen dat de aggregaten breken. Tijdens de gegevensverzameling van stap 3.4 tot 3.10 kunnen er gevallen zijn waarin de monsters te geconcentreerd zijn. Als wordt waargenomen dat het monster zeer langzaam of helemaal niet loopt, kan men het monster verdunnen met het juiste verse medium.</li>
</ol>3. Data-acquisitie
<ol><li>Stel de beeldvormende flowcytometer in volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Stel de 785 nm laser in op 5 mW voor donkerveldmeting (gelijk aan zijverstrooiing in conventionele flowcytometrie, afgekort als SSC). Gebruik een 60x-lens met een numerieke apertuur (N.A) van 0.9, selecteer hoge gevoeligheid en stel de snelheid in op laag.</li>
	<li>Voordat u gegevens verzamelt, moet u ervoor zorgen dat de kalibratieparels stabiel zijn in het SSC-kanaal. Klik op de afspeelknop in het vak "fluidics" en controleer de kwaliteit van de kralenafbeeldingen. De afbeeldingen van de kralen moeten er scherp en helder uitzien.</li>
	<li>Druk op de laadknop en plaats een buisje met een monster (uit stap 2.6) in de houder.</li>
	<li>Maak een nieuw spreidingsdiagram in het vak "werkruimte". Klik op Nieuw spreidingsdiagram en selecteer het gebied in het helderveldkanaal dat overeenkomt met de intensiteit van het SSC-kanaal. Sluit de kalibratieparels uit die samen met het monster in het instrument lopen. OPMERKING: Kralen kunnen worden uitgesloten door een monster met alleen buffer te laden en de kralen op het gebied vs. SSC-perceel. Teken vervolgens een poort rond de kralenpopulatie met behulp van de knop Polygoongebied maken .</li>
	<li>Voer in het vak "Acquisitie-instellingen" de naam van het monster in, geef de locatie op voor de gegevensopslag, kies de populatie (alle cellen zonder kralen) waaruit u wilt opnemen en stel het aantal gebeurtenissen in dat moet worden verzameld. Doorgaans zijn 10.000-20.000 evenementen voldoende.</li>
	<li>Klik op de knop Opnemen in het vak "Acquisitie" en het acquisitieproces wordt automatisch beëindigd zodra het opgegeven aantal evenementen is bereikt.</li>
	<li>Klik op de Return-knop om de buis te lossen en verwijder de buis uit de houder wanneer daarom wordt gevraagd in een klein venster.</li>
	<li>Herhaal stap 3.5-3.9 voor elk monster.</li>
	<li>Sla de sjabloon op om de uniformiteit van de gegevensverzameling te behouden voor volgende herhalingen.</li>
</ol>4. Analyse van de gegevens
<ol><li>Meet het percentage (%) autoaggregatie van de populatie.<ol><li>Analyseer de gegevens die zijn verkregen op de beeldvormende flowcytometer met behulp van IDEAS-software (zie Materiaaltabel).</li>
		<li>Maak een gegevensanalysebestand (.daf) van het onbewerkte bestand (.rif) door het (.rif) bestand in de analysesoftware te laden. Klik op de knop Bestand en open het gewenste bestand (.rif). Klik in het geopende venster op acquisitieanalyse gebruiken en klik vervolgens op OK.</li>
		<li>Maak een histogram van gradiënt RMS (een meting van beeldcontrast en focus) in het helderveldkanaal om gerichte gebeurtenissen te identificeren. Klik in het analysegebied op de knop Nieuw histogram . Kies in het venster "Nieuw histogram" de populatie uit de acquisitie die u wilt analyseren en selecteer in de "x-asfunctie" Gradient RMS van het helderveldkanaal.<ol><li>Plaats een poort door op de knop Lijngebied maken in het analysegebied te klikken om niet-gerichte gebeurtenissen uit te sluiten (Figuur 2A). OPMERKING: Normaal gesproken moet het lijngebied "Gefocust" 80%-90% van de gebeurtenissen met de hoogste gradiënt RMS-score bevatten, maar voor elke experimentele opstelling moeten specifieke drempels voor "in-focus"-cellen worden bepaald.</li>
		</ol></li>
		<li>Maak een spreidingsdiagram van het gebied (μm2) versus de hoogte-breedteverhouding (breedte gedeeld door de lengte van een best passende ellips) van het helderveldkanaal. Druk op de knop Nieuw spreidingsdiagram in het analysegebied. Kies in het venster "Nieuw spreidingsdiagram" de Gerichte populatie uit stap 4.1.3.<ol><li>Selecteer Gebied van het helderveldkanaal voor de x-as functie en Hoogte-breedteverhouding van het helderveldkanaal voor de y-as. Dit spreidingsdiagram maakt het mogelijk om de gefocuste populatie te gebruiken om singlets en kleine aggregaatgebeurtenissen te onderscheiden van grotere microbiële aggregaten en ketens.</li>
		</ol></li>
		<li>Teken in dit spreidingsdiagram een poort met behulp van de knop Rechthoekgebied maken (of Polygoongebied maken) op basis van de gebiedswaarde voor de populatie van aggregatiegebeurtenissen en een andere poort voor de populatie van enkelingen en kleine aggregaten (Figuur 2B). OPMERKING: In bepaalde achtergronden kan het een uitdaging zijn om kleine aggregaten van enkelingen te scheiden, zodat ze in dezelfde poort kunnen worden gecombineerd. Hetzelfde geldt voor grotere aggregaten en ketens (figuur 3).</li>
		<li>Bekijk en evalueer handmatig afbeeldingen van gebeurtenissen binnen elke poort om de betrouwbaarheid van de poortstrategie te verifiëren. Pas indien nodig de oppervlaktewaarde voor de poort aan. Voer dit uit door de beoordeelde populatie te selecteren in het vervolgkeuzemenu 'Populaties'. OPMERKING: De gating heeft geen specifieke gebiedswaarde, omdat deze kan variëren afhankelijk van de kenmerken van de bacteriën die worden geanalyseerd.</li>
		<li>Sla de data-analyse op als sjabloon. Klik op het tabblad Bestand , selecteer Opslaan als Sjabloon.ast en open het volgende voorbeeldbestand (.rif) onder dezelfde sjabloon om het gegevensanalysebestand (.daf) te maken (met ondersteuning voor .ast-bestand als voorbeeld voor LGG).</li>
		<li>Maak een tabel met statistieken om de belangrijkste gebeurtenissen op te sommen voor verdere analyse. Klik op het tabblad Rapporten en klik vervolgens op Statistiekenrapport definiëren.</li>
		<li>Klik in het nieuwe venster op Kolommen toevoegen. Voeg het aantal singlets/aggregaten en %gated statistieken toe. Kies onder 'statistieken' de optie %gated/count en kies onder de geselecteerde populatie singlets/aggregaten. Klik op Statistieken toevoegen om de statistiek aan de lijst toe te voegen en op te slaan als sjabloon.</li>
		<li>Klik op Genereer statistisch rapport en kies het statistieksjabloon en de (.daf) bestanden voor analyse.</li>
	</ol></li>
	<li>Meet de grootteverdeling van de aggregaten.<ol><li>Om de gemiddelde grootte van de aggregatiegebeurtenissen te analyseren, tekent u een histogram van de oppervlakte (μm2) van de populatie van aggregatiegebeurtenissen uit stap 4.1.5 (Figuur 2C).</li>
		<li>Sla de data-analyse op als sjabloon. Klik op het tabblad Bestand , selecteer Opslaan als sjabloon en open het volgende voorbeeldbestand (.rif) onder dezelfde sjabloon voor het gegevensanalysebestand (.daf).</li>
		<li>Herhaal de stappen 4.1.7-4.19. Voor de grootte van de aggregaten kiest u gemiddelde onder statistieken en selecteert u aggregaten onder de geselecteerde populatie. Selecteer onder objecten de optie Gebied van het helderveldkanaal. Klik op Statistieken toevoegen om de statistiek aan de lijst toe te voegen en op te slaan als sjabloon.</li>
		<li>Herhaal stap 4.1.9 om een statistisch rapport te genereren.</li>
	</ol></li>
</ol>

Kwantitatieve analyse van microbiële autoaggregatie met behulp van beeldvormende flowcytometrie

<ol><li>Trunk, T., Khalil, H. S., Leo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+autoaggregation%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial autoaggregation.</a> AIMS Microbiology. 4 (1), 140-164 (2018).</li>
<li>Ishikawa, M., Nakatani, H., Hori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AtaA%2C+a+new+member+of+the+trimeric+autotransporter+adhesins+from+Acinetobacter+sp.+Tol+5+mediating+high+adhesiveness+to+various+abiotic+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">AtaA, a new member of the trimeric autotransporter adhesins from Acinetobacter sp. Tol 5 mediating high adhesiveness to various abiotic surfaces.</a> PLoS One. 7, e48830(2012).</li>
<li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+low-molecular-weight+component+protein%2C+Flp%2C+in+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+fimbriae%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of low-molecular-weight component protein, Flp, in Actinobacillus actinomycetemcomitans fimbriae.</a> Medical Microbiology and Immunology. 42 (4), 253-258 (1998).</li>
<li>Boddey, J. A., Flegg, C. P., Day, C. J., Beacham, I. R., Peak, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-regulated+microcolony+formation+by+Burkholderia+pseudomallei+requires+pilA+and+enhances+association+with+cultured+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Temperature-regulated microcolony formation by Burkholderia pseudomallei requires pilA and enhances association with cultured human cells.</a> Infection and Immunity. 74 (9), 5374-5381 (2006).</li>
<li>Suissa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-dependent+differences+in+the+functional+responses+of+Lactobacillaceae+strains+to+fermentable+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Context-dependent differences in the functional responses of Lactobacillaceae strains to fermentable sugars.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 949932(2022).</li>
<li>Isenring, J., Geirnaert, A., Lacroix, C., Stevens, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bistable+auto-aggregation+phenotype+in+Lactiplantibacillus+plantarum+emerges+after+cultivation+in+in+vitro+colonic+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bistable auto-aggregation phenotype in Lactiplantibacillus plantarum emerges after cultivation in in vitro colonic microbiota.</a> BMC Microbiology. 21, 268(2021).</li>
<li>Kos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+and+aggregation+ability+of+probiotic+strain+Lactobacillus+acidophilus+M92%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92.</a> Journal of Applied Microbiology. 94 (6), 981-987 (2003).</li>
<li>Zommiti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assessment+of+the+probiotic+properties+and+bacteriocinogenic+potential+of+Pediococcus+pentosaceus+MZF16+isolated+from+artisanal+tunisian+meat+%26%2334%3BDried+Ossban%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">In vitro assessment of the probiotic properties and bacteriocinogenic potential of Pediococcus pentosaceus MZF16 isolated from artisanal tunisian meat &#34;Dried Ossban&#34;.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2607(2018).</li>
<li>Suissa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+rewiring+of+the+probiotic+bacterium+rhamnosus%3C%2Fem%3E+GG+contributes+to+cell-wall+remodeling+and+antimicrobials+production%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Metabolic rewiring of the probiotic bacterium rhamnosus GG contributes to cell-wall remodeling and antimicrobials production.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Connell, J. L., Kim, J., Shear, J. B., Bard, A. J., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+quorum+sensing+in+3D-printed+bacterial+aggregates+using+scanning+electrochemical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of quorum sensing in 3D-printed bacterial aggregates using scanning electrochemical microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18255-18260 (2014).</li>
<li>Misawa, N., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+characterization+of+autoagglutination+activity+by+Campylobacter+jejuni%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Detection and characterization of autoagglutination activity by Campylobacter jejuni.</a> Infection and Immunity. 68 (11), 6168-6175 (2000).</li>
<li>Sherlock, O., Schembri, M. A., Reisner, A., Klemm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+roles+for+the+AIDA+adhesin+from+diarrheagenic+Escherichia+coli%3A+cell+aggregation+and+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Novel roles for the AIDA adhesin from diarrheagenic Escherichia coli: cell aggregation and biofilm formation.</a> Journal of Bacteriology. 186 (23), 8058-8065 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Imaging flow cytometry.</a> Nature Reviews Methods Primers. 2, 87(2022).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+characteristics+of+lactic+acid+bacteria+and+the+expanding+applications+in+food+industry%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Metabolism characteristics of lactic acid bacteria and the expanding applications in food industry.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 612285(2021).</li>
<li>Turroni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dialogue+between+the+human+gut+microbiota+and+the+host%3A+a+Lactobacillus+and+Bifidobacterium+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Molecular dialogue between the human gut microbiota and the host: a Lactobacillus and Bifidobacterium perspective.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 183-203 (2014).</li>
<li>Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W. Jr, Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageStream+System%3A+a+key+step+to+a+new+era+in+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Histochemica+et+Cytobiologica%22%5BJournal%5D)">The ImageStream System: a key step to a new era in imaging.</a> Folia Histochemica et Cytobiologica. 45, 279-290 (2007).</li>
<li>Dashkova, V., Malashenkov, D., Poulton, N., Vorobjev, I., Barteneva, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+flow+cytometry+for+phytoplankton+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging flow cytometry for phytoplankton analysis.</a> Methods. 112, 188-200 (2017).</li>
<li>Maan, H., Gilhar, O., Porat, Z., Kolodkin-Gal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+subtilis+colonization+of+arabidopsis+thaliana+roots+induces+multiple+biosynthetic+clusters+for+antibiotic+production%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacillus subtilis colonization of arabidopsis thaliana roots induces multiple biosynthetic clusters for antibiotic production.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 722778(2021).</li>
<li>Maan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+flow+cytometry+reveals+a+dual+role+for+exopolysaccharides+in+biofilms%3A+To+promote+self-adhesion+while+repelling+non-self-community+members%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Imaging flow cytometry reveals a dual role for exopolysaccharides in biofilms: To promote self-adhesion while repelling non-self-community members.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 15-25 (2022).</li>
<li>Konieczny, M., Rhein, P., Czaczyk, K., Bialas, W., Juzwa, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+flow+cytometry+to+study+biofilm-associated+microbial+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Imaging flow cytometry to study biofilm-associated microbial aggregates.</a> Molecules. 26 (23), 7096(2021).</li>
<li>Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attached+biofilms+and+suspended+aggregates+are+distinct+microbial+lifestyles+emanating+from+differing+hydraulics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics.</a> Nature Microbiology. 1, 16178(2016).</li>
</ol>

Flowcytometrie is een veelgebruikte methode voor het kwantificeren van fluorescentie-intensiteiten in eukaryote cellen, maar het levert mogelijk geen nauwkeurige metingen op voor bacteriële cellen vanwege hun grotere omvang of kleine aggregaten. Deze factoren kunnen een aanzienlijke invloed hebben op de precieze kwantificering van autoaggregatie en het basale niveau van aggregaatvorming in verschillende omstandigheden. Om dit aan te pakken, werd beeldvormende flowcytometrie (IFC) gebruikt om een betere resolutie te krijg...

Bacteriële autoaggregatie wordt beschouwd als een primaire stap in de vorming van biofilm. In dit proces (soms ook autoagglutinatie of flocculatie genoemd) vormen bacteriën van hetzelfde type meercellige klonten die zich uiteindelijk op de bodem van kweekbuisjes nestelen of zich hechten aan hun doelweefsel of oppervlak1.
Autoaggregatie is een veel waargenomen fenomeen en is tot nu toe aangetoond bij Gram-negatieve pathogenen zoals de opportunistische ziekteverwekker Acinetobacter baumannii2, de tandpathogeen Aggregobacter actinomycetemcomitans3 en de opkomende ziekteverwekker Burkholderia pseudomallei4. Autoaggregatie is ook beschreven in verschillende probiotische Gram-positieve stammen 5,6,7,8. In Lactobacillus (L.) acidophilus werd autoaggregatie gedeeltelijk gemedieerd door S-laageiwitten en gecorreleerd met een adhesie aan xylaan7. Evenzo vonden we een correlatie tussen glucose-afhankelijke autoaggregatie en inductie van de adhesieve eigenschappen (zoals beoordeeld door hechting aan mucine) van de probiotische soorten Lacticaseibacillus rhamnosus GG, Lacticaseibacillus casei, L. acidophilus, Lacticaseibacillus paracasei en Lactiplantibacillus plantarum5. De verhoogde autoaggregatie weerspiegelde hoogstwaarschijnlijk veranderingen in de expressie van cellulaire adhesinen als reactie op glucose en zijn katabolieten9. Hoewel de moleculaire mechanismen van autoaggregatie nog moeten worden bepaald, is aangetoond dat dit proces het fenotype van de geaggregeerde bacteriën verandert en hen een verhoogde tolerantie voor omgevingsstressoren1 geeft, evenals een verhoogde gevoeligheid voor quorum sensing-moleculen10.
Er zijn verschillende benaderingen gebruikt om autoaggregatie te meten; Een experimentele benadering is om culturen een bepaalde tijd statisch in smalle kweekbuizen te laten staan. Controleculturen blijven troebel, terwijl autoaggregatieculturen zich op de bodem van de buis zullen nestelen. Een meer kwantitatieve benadering meet autoaggregatie door sedimentatie of bezinkingstest11.
Flowcytometrie wordt de laatste jaren ook steeds vaker gebruikt om bacteriële autoaggregatie te onderzoeken. Deze methode is geschikt voor het analyseren van deeltjes met een grootte tussen ongeveer 0,5 en 1000 μm. De enkele bacterie of gevormde aggregaten worden in vloeistof gesuspendeerd, in een stroom gevoerd en kunnen één voor één worden gedetecteerd11. Door voorwaarts verstrooid licht op te nemen, kan de relatieve grootte van de cel of het aggregaat worden gemeten. Het is relatief snel en eenvoudig, maar kan verschillende parameters niet detecteren, zoals de aggregaatgrootte of het gemiddelde aantal cellen in aggregaten. Daarom kan deze aanpak microscopisch worden aangevuld, waardoor meer parameters kunnen worden gecontroleerd12. Traditionele microscopie is echter tijdrovend en beperkt daardoor het aantal geteste monsters en de statistische kracht van de analyse. Over het algemeen biedt beeldvormende flowcytometrie verschillende functies in vergelijking met traditionele flowcytometrie, zoals gelijktijdige analyse van celmorfologie en fenotype, het uitvoeren van beeldgebaseerde analyse, het detecteren van zeldzame gebeurtenissen en het valideren van flowcytometriegegevens13. Deze voordelen verbeteren de mogelijkheden van flowcytometrie en vergemakkelijken een gedetailleerder onderzoek van celpopulaties.
Deze studie biedt een waardevol protocol voor beeldvorming van flowcytometrie om autoaggregatie in melkzuurbacteriën (LAB) te monitoren. Deze Gram-positieve staafjes zijn facultatieve anaëroben en behoren tot de LAB-groep. Deze efficiënte glucosefermentoren genereren melkzuur als hun belangrijkste eindproduct van het koolhydraatmetabolisme14. Deze bacteriën zijn nuttige kernleden van het microbioom en komen van nature voor in het maagdarmkanaal (GIT) van mens en dier, evenals in het urogenitale kanaal van vrouwen15. Daarom is de exacte karakterisering van hun autoaggregatie-eigenschappen van groot biotechnologisch en klinisch belang.
Onze eerdere bevindingen gaven aan dat het basale niveau van autoaggregatie verschilt tussen verschillende probiotische stammen. Deze heterogeniteit wordt beïnvloed door de verschillende koolhydraten die als koolstofbron worden gebruikt5. Om deze fundamentele eigenschap van probiotische bacteriën te overwinnen, werden de effecten van koolhydraten uit de voeding gecontroleerd op autoaggregatie op het niveau van één cel met behulp van IFC. Deze op IFC gebaseerde aanpak combineert de kracht en snelheid van traditionele flowcytometers met de resolutie van de microscoop. Daarom maakt het complexe morfometrische metingen met hoge snelheid mogelijk op een fenotypisch gedefinieerde manier 16,17. Deze aanpak kan worden uitgebreid naar andere probiotische en pathogene bacteriën, gecombineerd met fluorescerende reporters om genexpressie te monitoren, en fluorescerend gelabelde stammen om de aanwezigheid en overvloed van specifieke bacteriesoorten in heterogene aggregaten te monitoren.

<table><tbody><tr><td>14 mL culture tubes</td><td>Falcon</td><td>352051</td><td></td></tr><tr><td>15 mL centrifuge tube</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Baeton,Dickinson and Company</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Typtic Soy Broth</td><td>Baeton,Dickinson and Company</td><td>211825</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Raffinose pentahydrate</td><td>Sigma</td><td>83400-25G</td><td></td></tr><tr><td>Difco Lactobacilli MRS broth</td><td>Baeton,Dickinson and Company</td><td>288130</td><td></td></tr><tr><td>EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf)</td><td>FL medical</td><td>23053</td><td></td></tr><tr><td>IDEAS Software</td><td>Amnis/EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>&nbsp;Details beschikbaar op: https://www.merckmillipore.com/INTL/nl/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&amp;bd=1</td></tr><tr><td>ImageStream X Mark II</td><td>Amnis/EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>&nbsp;Details beschikbaar op: https://www.merckmillipore.com/INTL/nl/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>MOPS, 3-(N-morpholino)propaansulfonzuur</td><td>Fisher bioreagents</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat dibasisch</td><td>Fisher Scientific, 174,18 g/mol</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat monobasisch</td><td>Sigma, 136,09 g/mol</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

beeldvorming flowcytometrie om microbiële autoaggregatie te bestuderen

Imaging Flow Cytometry to Study Microbial Autoaggregation

Nuttige en probiotische bacteriën spelen een essentiële rol in hun gastheren en bieden verschillende gezondheidsvoordelen, waaronder immuniteit tegen infectieziekten. De familie Lactobacillaceae bestaat uit Gram-positieve bacteriën met bevestigde probiotische eigenschappen. Deze studie maakt gebruik van Lactobacillaceae-soorten als model om de effectiviteit van single-cell high throughput-analyse aan te tonen bij het bestuderen van cellulaire aggregatie. De focus ligt op het analyseren van de reactie van deze nuttige soorten op enkelvoudige koolhydraten uit de voeding.
De studie laat zien hoe Imaging Flow Cytometry (IFC) de fundamentele verschillen in de assemblage van probiotische bacteriën in de aan- en afwezigheid van koolhydraten kan overwinnen. IFC combineert de kracht en snelheid van conventionele flowcytometrie met de ruimtelijke resolutie van microscopie, waardoor complexe morfometrische metingen met hoge snelheid op een fenotypisch gedefinieerde manier mogelijk zijn in een bibliotheek van gunstige bacteriestammen en omstandigheden. Dit protocol geeft inzicht in de autoaggregatie van Lactobacillaceae-soorten en werpt licht op hun reactie op koolhydraten in de voeding, en draagt bij aan het begrijpen van de mechanismen achter de gunstige effecten van deze probiotische bacteriën.

De resultaten tonen aan dat deze methode gemakkelijk de verschillen in autoaggregatie als reactie op voedingssuikers in LAB-bacteriën kan meten. Door individuen te scheiden van aggregaten, maakt de methode het mogelijk om het percentage van de populatie van de aggregatiegebeurtenissen uit alle gebeurtenissen te berekenen als reactie op fermenteerbare of niet-fermenteerbare suikers uit het dieet. Bovendien was het mogelijk om te meten of er verschillen zijn in de gemiddelde grootte van de populatie van het aggregaat tusse...

Dit protocol beschrijft een kwantitatieve benadering om microbiële autoaggregatie te meten met behulp van beeldvormende flowcytometrie.

Beeldvorming flowcytometrie om microbiële autoaggregatie te bestuderen

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The ...

Deze studie gebruikte Lactobacillus-soorten als model om de effectiviteit van beeldvormende flowcytometrieanalyse aan te tonen bij het bestuderen van microbiële autoaggregatie. De focus ligt op het analyseren van de reactie van autoaggregatie van Lactobacillus-soorten op enkelvoudige koolhydraten uit de voeding. De meest gebruikte methoden voor het meten van autoaggregatie zijn spectrale fotometrie, waarbij microbiële suspensies, troebelheid of optische dichtheid worden gemeten, en traditionele microscopietechnieken, zoals helder veld, fasecontrast en fluorescerende microscopie.Als we het hebben over hight-throughput imaging, is een grote experimentele uitdaging segmentatie van één gebeurtenis. In dit protocol is het een enkel aggregaat. Beeldvormende flowcytometrie pakt deze uitdaging elegant aan en geeft onderzoekers een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van autoaggregatie.

imaging-flow-cytometry-to-study-microbial-autoaggregation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In dit artikel beschrijven we een methode gebruik te maken van multi-spectraal imaging flowcytometrie om de internalisering van polyanhydride nanodeeltjes of bacteriën door RAW 264.7 cellen te kwantificeren.

Het analyseren van cellulaire internalisatie van nanodeeltjes en bacteriën door Multi-spectrale Imaging flowcytometrie

Source: Barbero, A. M., et al. Fluorescence Assays for the Study of Mycobacterium tuberculosis Interaction with the Immune Receptor SLAMF1. J. Vis. Exp. (2025)This video demonstrates the procedure for labeling host immune receptors that bind bacterial surface antigens, enabling their detection through flow cytometry.

Analysis of Macrophage Receptor Interactions with Pathogenic Bacteria Using Flow Cytometry

We methode om het effect van PSMs en andere toxines uitgescheiden door...

Studeren Interacties van<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Met Neutrofielen door flowcytometrie en Time Lapse Microscopie

Deze methode toont een techniek voor het beoordelen van de functie van granulocyten door gelijktijdig de fagocytose van bacteriën en oxidatieve burst te meten. Beeldgebaseerde flowcytometrie maakte het mogelijk om drie verschillende subsets van geactiveerde granulocyten te identificeren die allemaal verschilden in hun relatieve functionele capaciteit.

Image-based flowcytometrie Techniek om Veranderingen in Granulocyt Functie Evalueer In Vitro

Stroom cytometry in combinatie met visuele clustering biedt een easy-to-use en snelle methode voor het bestuderen van aquatische biofilms. Het kan worden gebruikt voor de karakterisering van de biofilm, de detectie van veranderingen in de structuur van de Gemeenschap van de biofilm, en detectie van abiotische deeltjes ingebed in de biofilm.

Karakterisering van aquatische Biofilms met stroom Cytometry

Flow cytometrische analyse heeft waardevol voor het onderzoeken van zuivere culturen en controle van de microbiële Gemeenschap dynamiek bewezen. Wij presenteren drie uitgebreide werkstromen, van monsterneming tot data-analyse, voor zuivere culturen en complexe gemeenschappen in duidelijke medium zoals in uitdagende matrices, respectievelijk.

Wezenlijke Microbiome Dynamics – Stroom Cytometry gebaseerd werkstromen van reinculturen aan natuurlijke gemeenschappen

Baanbrekende krommen (BBC's) zijn efficiënte instrumenten om het transport van bacteriën in poreuze media te bestuderen. Hier introduceren we tools op basis van vloeibare apparaten in combinatie met microscopie en flow cytometrische tellingen om BTC's te verkrijgen.

Het combineren van fluidic devices met microscopie en flow cytometrie om microbiële transporten te bestuderen in poreuze media over ruimtelijke schalen

Het doel van dit protocol is het kwantificeren van binding van de eukaryotische pathogene menselijke norovirus aan bacteriën. Na het uitvoeren van een eerste virus-bacterie gehechtheid test, flow cytometrie wordt gebruikt om viraal gebonden bacteriën te detecteren binnen de bevolking.

Kwantificeren van menselijke Norovirus Virus-achtige deeltjes binding aan commensale bacteriën met behulp van Flow Cytometrie

Isolatie van cellen uit ontlede implantaten en hun karakterisering door middel van flowcytometrie kan aanzienlijk bijdragen aan het begrijpen van het patroon van immuunrespons tegen implantaten. Dit artikel beschrijft een nauwkeurige methode voor de isolatie van cellen uit ontlede implantaten en hun kleuring voor flowcytometrische analyse.

Flowcytometrie met hoge dimensionaliteit voor analyse van de immuunfunctie van ontlede implantaatweefsels

Synthetisch cystic fibrosis sputum medium (SCFM2) kan worden gebruikt in combinatie met zowel confocale laserscanmicroscopie als fluorescentie-geactiveerde celsortering om bacteriële aggregaten met hoge resolutie te observeren. Dit artikel beschrijft methoden om geaggregeerde populaties te beoordelen tijdens antimicrobiële behandeling als een platform voor toekomstige studies.

Tools voor de real-time beoordeling van een Pseudomonas aeruginosa-infectiemodel

Leer beeldvorming flowcytometrie om microbiële autoaggregatie te bestuderen met Lactobacillaceae. Deze methode analyseert het effect van voedingskoolhydraten op aggregatiegedrag en biedt inzicht in microbele dynamica.

Beeldvorming flowcytometrie om microbiële autoaggregatie te bestuderen

Meer video's verkennen