Name: Complementaire benaderingen om mitofagieflux in pancreas-β-cellen te ondervragen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-15T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Ontdek twee complementaire methoden om mitofagieflux in pancreas-β-cellen te analyseren met behulp van flowcytometrie en fluorescentie. Deze technieken bieden kwantitatieve inzichten voor diabetesonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

E.L-D. erkent de steun van de NIH (T32-AI007413 en T32-AG000114). SAS erkent steun van de JDRF (COE-2019-861), de NIH (R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), het Department of Veterans Affairs (I01 BX004444), de familie Brehm en de familie Anthony.

De dierstudies die in dit protocol worden gepresenteerd, zijn beoordeeld en goedgekeurd door de University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee. Voor deze studie werden mannelijke C57BL/6J-muizen van twintig weken oud, die ofwel een 15 weken durend normaal vetdieet (RFD) of een vetrijk dieet (HFD) volgden, gebruikt.
1. Beoordeling van mitofagie via de op kleurstof gebaseerde MtPhagy-benadering (methode 1)
<ol><li>Bereiding en behandeling van muiseilandjes<ol><li>Voer eilandjeskweek en blootstelling aan valinomycine uit volgens de onderstaande stappen.<ol><li>Isoleer eilandjes van muizen met een normaal vetdieet (RFD) of een vetrijk dieet (HFD, 60 kcal% vet19), volgens de eerder beschreven methoden 2,10.</li>
			<li>Kweekeilandjesmonsters 's nachts bij 37 °C in RPMI-medium aangevuld met 100 eenheden/ml antimycoticum-antibioticum, 50 eenheden/ml penicilline-streptomycine, 1 mM natriumpyruvaat, 10 mM HEPES en 10% foetaal runderserum (FBS) (zie materiaaltabel). Dit medium wordt aangeduid als "eilandjesmedium".</li>
			<li>Pluk met een pipet 100 eilandjes per conditie in petrischaaltjes van 6 cm in 2 ml eilandjesmedium. OPMERKING: Voorwaarden die voor dit protocol worden gebruikt: (1) Ongekleurde controle: ongekleurde RFD-eilandjes; (2) Alleen DAPI-controle: RFD-eilandjes gekleurd met DAPI; (3) Controle alleen op Fluozin-3-AM: RFD-eilandjes gekleurd met Fluozin-3-AM; (4) MtPhagy alleen controle: RFD-eilandjes gekleurd met MtPhagy; (5) Controle alleen TMRE: RFD-eilandjes gekleurd met TMRE; (6) RFD onbehandeld: RFD-eilandjes gekleurd met MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM en DAPI; (7) aan valinomycine blootgestelde RFD-eilandjes: RFD-eilandjes die zijn blootgesteld aan valinomycine en gekleurd zijn met MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM en DAPI; (8) HFD onbehandeld: HFD-eilandjes gekleurd met MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM en DAPI; (9) Aan valinomycine blootgestelde HFD-eilandjes: HFD-eilandjes die zijn blootgesteld aan valinomycine en gekleurd zijn met MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM en DAPI.</li>
			<li>Voor de omstandigheden (7) en (9) (zie OPMERKING hierboven) die zijn blootgesteld aan valinomycine, voeg gedurende 3 uur 2 μl valinomycinebouillon van 250 nΜ (zie materiaaltabel) toe aan eilandjes in de petrischaal om mitofagie op te wekken.</li>
		</ol></li>
		<li>Voer dissociatie van één cel uit.<ol><li>Na 3 uur blootstelling aan valinomycine, kies 100 eilandjes van elke aandoening in afzonderlijke microcentrifugebuisjes met behulp van een pipet.</li>
			<li>Centrifugeer de eilandjes gedurende 1 minuut bij 10 °C op 350 x g en gooi het supernatans met een pipet weg.</li>
			<li>Was monsters 2x met 1 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), met centrifugestappen (350 x g/1 min, 10 °C) tussen elke wasbeurt. Gooi het supernatans na elke wasbeurt weg met een pipet.</li>
			<li>Om eilandjes in afzonderlijke cellen te dissociëren, voegt u 500 μL 0,05% trypsine (voorverwarmd tot 37 °C) toe aan de microcentrifugebuis van één monster om oververtering van eilandjes te voorkomen. Pipetteer herhaaldelijk op en neer totdat de eilandjes zichtbaar verspreid zijn.</li>
			<li>Voeg onmiddellijk 1 ml voorverwarmd eilandje medium toe om trypsine te neutraliseren. Herhaal trypsinisatie en neutralisatie voor elk monster, één voor één.</li>
			<li>Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten bij 10 °C op 500 x g . Verwijder het supernatans met een pipet en zorg ervoor dat u de pellet niet verstoort. OPMERKING: Pellet zal delicaat zijn voor monsters die zijn blootgesteld aan valinomycine.</li>
			<li>Was monsters 2x met RPMI medium, geen fenolrood, aangevuld met 100 eenheden/ml antimycoticum-antibioticum, 50 eenheden/ml penicilline-streptomycine, 1 mM natriumpyruvaat, 10 mM HEPES en 10% runderserumalbumine (BSA). Dit medium wordt "eilandjesstroommedium" genoemd. Centrifugeer stappen (350 x g/1 min, 10 °C) tussen elke wasbeurt. Gooi het supernatans na elke wasbeurt weg met een pipet.</li>
		</ol></li>
		<li>Kleurcellen met MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM en DAPI ter voorbereiding op flowcytometrie.<ol><li>Resuspendeer eilandjesmonsters in 500 μL eilandjesstroommedium.</li>
			<li>Voeg 0,25 μl 100 μM MtPhagy-voorraad (zie materiaaltabel) toe aan buizen die MtPhagy-kleurstof ontvangen (voorwaarden 4, 6, 7, 8 en 9, OPMERKING bij stap 1.1.1).</li>
			<li>Voeg 0,25 μL 100 μM TMRE-materiaal (zie materiaaltabel) toe aan buizen die TMRE-kleurstof ontvangen (voorwaarden 5, 6, 7, 8 en 9).</li>
			<li>Voeg 0,25 μL van 1 mM Fluozin-3-AM voorraad (zie Materiaaltabel) toe aan tubes die Fluozin-3-AM kleurstof ontvangen (voorwaarden 3, 6, 7, 8 en 9).</li>
			<li>Vortex buizen op lage snelheid gedurende 5 s om te mengen.</li>
			<li>Wikkel microcentrifugebuisjes in aluminiumfolie ter bescherming tegen licht en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C. Halverwege de incubatie, vortex buizen op lage snelheid gedurende 5-10 s om te mengen.</li>
			<li>Centrifugeer de monsters na incubatie gedurende 1 minuut bij 10 °C bij 350 x g . Gooi het supernatans weg met een pipet.</li>
			<li>Resuspendeer monsters in een eilandjesstroommedium van 500 μl. Voeg 0,2 μg/ml DAPI (zie Materiaaltabel) toe aan de voorwaarden 2, 6, 7, 8 en 9.</li>
			<li>Centrifugeer de monsters op 350 x g gedurende 1 minuut bij 10 °C. Gooi het supernatans weg met behulp van een pipet en resuspendeer het in 500 μl eilandjesstroommedium.</li>
			<li>Leg de monsters op ijs.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Flowcytometrie<ol><li>Start het instrument in werking (zie Tabel met materialen). OPMERKING: Elke flowcytometer met de juiste filters zal werken. In dit onderzoek werden de volgende filters gebruikt: (1) VL1 voor DAPI: Excitatie/Emissie - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) BL1 voor Fluozin-3-AM: excitatie/emissie - 488 nm/530 nm (30 nm); (3) BL2 voor MtPhagy-kleurstof: excitatie/emissie - 488 nm/590 nm (40 nm); (4) YL1 voor TMRE: excitatie/emissie - 561 nm/585 nm (16 nm).</li>
		<li>Pas de spanningen aan voor voorwaartse (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC) om ervoor te zorgen dat celpopulaties zich in het midden van het spreidingsdiagram bevinden. Voor dit protocol werden spanningen gebruikt van 120 V voor FSC en 260 V voor SSC om ervoor te zorgen dat cellen gelijkmatig binnen de FSC-A vs. SSC-A-perceel (figuur 1A).</li>
		<li>Als u niet-afzonderlijke cellen wilt uitsluiten, voegt u een rechthoekige poort toe op FSC-H vs. FSC-W gevolgd door SSC-H vs. SSC-W (Figuur 1B,C).</li>
		<li>Pas de spanningen en compensatie voor DAPI aan om te filteren op levende β-cellen. Stel fluorescentiepoorten in voor elke gebruikte fluorofoor op basis van het ongekleurde RFD-monster (figuren 1D-F). NOTITIE: Voltages gebruikt voor elk kanaal: (1) VL1: 320-360 V; (2) BL1: 300-340 V; (3) BL2: 260-300 V; (4) YL1: 300-340 V.</li>
		<li>Zodra de poorten zijn vastgesteld, verzamelt u 10.000 gebeurtenissen per monster. OPMERKING: Met behulp van deze poortbenadering werden mitofagieniveaus onder basale omstandigheden en bij inductie van valinomycine beoordeeld in zowel RFD- als HFD-eilandjes (Figuur 2).</li>
		<li>Sla gegevens op als FCS-bestanden voor analyse.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Beoordeling van mitofagie met behulp van de genetisch gecodeerde mt-Keima-reporter (methode 2)
<ol><li>Bereiding van muiseilandjes en eencellige dissociatie<ol><li>Voer eilandjeskweek en blootstelling aan valinomycine uit volgens de onderstaande stappen.<ol><li>Isoleer pancreaseilandjes van wildtype (WT) en mt-Keima/+ (mt-Keima) muizen6. Bij deze methode werden 20 weken oude mannelijke WT- of mt-Keima/+ gevoede RFD-muizen gebruikt.</li>
			<li>Kweekeilandjesmonsters 's nachts bij 37 °C in eilandjesmedium.</li>
			<li>Pluk met een pipet 100 eilandjes per conditie in petrischaaltjes van 6 cm met 2 ml eilandjesmedium. OPMERKING: Voorwaarden die voor dit protocol worden gebruikt: (1) Ongekleurde controle: Ongekleurde WT-eilandjes; (2) Alleen DAPI-controle: WT-eilandjes gekleurd met DAPI; (3) Fluozin-3-AM alleen controle: WT-eilandjes gekleurd met Fluozin-3-AM; (4) mt-Keima, uitsluitend controle: niet-bevlekte mt-Keima/+ eilandjes; (5) Onbehandeld: mt-Keima/+ eilandjes gekleurd met Fluozin-3-AM en DAPI; (6) Valinomycine: mt-Keima/+ eilandjes die zijn blootgesteld aan valinomycine en gekleurd zijn met Fluozin-3-AM en DAPI.</li>
			<li>Voeg voor aandoening (6) bij blootstelling aan valinomycine gedurende 3 uur 2 μl valinomycinebouillon van 250 nM toe aan eilandjes in petrischaal om mitofagie op te wekken.</li>
		</ol></li>
		<li>Voer eencellige dissociatie uit.<ol><li>Voer de stappen voor het dissociëren van afzonderlijke cellen uit, zoals beschreven in stap 1.1.2.</li>
		</ol></li>
		<li>Cellen kleuren met Fluozin-3-AM en DAPI.<ol><li>Resuspendeer eilandjesmonsters in 500 μL eilandjesstroommedium.</li>
			<li>Voeg 0,25 μL van 1 mM Fluozin-3-AM bouillon toe aan tubes die Fluozin-3-AM kleurstof ontvangen (voorwaarden 3, 5 en 6).</li>
			<li>Incubeer cellen bij 37 °C en ga over tot DAPI-behandeling, zoals beschreven in de stappen 1.1.3.5-1.3.10.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Flowcytometrie<ol><li>Start het instrument op. Elke flowcytometer met de juiste filters zal werken. OPMERKING: In dit onderzoek zijn de volgende filters gebruikt: (1) VL1 voor DAPI: Excitatie/Emissie - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) BL1 voor Fluozin-3-AM: excitatie/emissie - 488 nm/530 nm (30 nm); (3) VL3 voor mt-Keima neutraal: excitatie/emissie - 405 nm/603 nm (48 nm); (4) YL2 voor mt-Keima-zuur: excitatie/emissie - 561 nm/620 nm (15 nm).</li>
		<li>Pas FSC- en SSC-spanningen aan en sluit niet-afzonderlijke cellen uit, zoals beschreven in de stappen 1.2.2-1.2.3 (figuren 3A-C).</li>
		<li>Pas de spanningen en compensatie voor DAPI, Fluozin-3-AM en mt-Keima aan met behulp van ongekleurde en enkelvoudige positieve controles (voorwaarden 1-4) om ervoor te zorgen dat fluorescentiepositieve celpopulaties te onderscheiden zijn van ongekleurde cellen. Zodra de juiste compensatie op elk kanaal is toegepast, stelt u de DAPI-negatieve poort en de Fluozin-3-AM-positieve poort in om te filteren op levende β-cellen (figuren 3D-E).</li>
		<li>Stel een driehoeksschema op met behulp van het mt-Keima-positieve monster (voorwaarde 4) om zure en neutrale celpopulaties te identificeren (Figuur 3F). NOTITIE: Voltages die doorgaans voor elk kanaal worden gebruikt: (1) VL1: 320-340 V; (2) BL2: 260-280 V; (3) VL3: 280-300 V; (4) YL2: 280-300 V.</li>
		<li>Zodra de poorten zijn vastgesteld, verzamelt u 10.000 gebeurtenissen per monster. Poortschema's voor de voorwaarden 5 en 6 worden geïllustreerd in figuur 3A-G.</li>
		<li>Sla gegevens op als FCS-bestanden voor analyse.</li>
	</ol></li>
</ol>

Kwantitatieve analyse van mitofagie in β-cellen van de pancreas van muizen

<ol><li>Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+regulation+of+%CE%B2-cell+function%3A+maintaining+the+momentum+for+insulin+release%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial regulation of β-cell function: maintaining the momentum for insulin release.</a> Molecular Aspects of Medicine. 42, 91-104 (2015).</li>
<li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diabetes+susceptibility+gene+Clec16a+regulates+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy.</a> Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).</li>
<li>Pearson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clec16a%2C+Nrdp1%2C+and+USP8+form+a+ubiquitin-dependent+tripartite+complex+that+regulates+%CE%B2-cell+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Clec16a, Nrdp1, and USP8 form a ubiquitin-dependent tripartite complex that regulates β-cell mitophagy.</a> Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).</li>
<li>Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+by+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation by mitophagy.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 53, 147-150 (2014).</li>
<li>Berezhnov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+pH+modulates+autophagy+and+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).</li>
<li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+in+vivo+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Measuring in vivo mitophagy.</a> Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).</li>
<li>McWilliams, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mito-QC+illuminates+mitophagy+and+mitochondrial+architecture+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 214 (3), 333-345 (2016).</li>
<li>Aoyagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+beta+cell-specific+mitophagy+reporter+mouse+shows+that+metabolic+stress+leads+to+accumulation+of+dysfunctional+mitochondria+despite+increased+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">A new beta cell-specific mitophagy reporter mouse shows that metabolic stress leads to accumulation of dysfunctional mitochondria despite increased mitophagy.</a> Diabetologia. 66 (1), 147-162 (2023).</li>
<li>Ma, X., Ding, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+imaging+based-assay+to+monitor+mitophagy+in+cultured+hepatocytes+and+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Research%22%5BJournal%5D)">A fluorescence imaging based-assay to monitor mitophagy in cultured hepatocytes and mouse liver.</a> Liver Research. 5 (1), 16-20 (2021).</li>
<li>Sidarala, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+protects+%CE%B2+cells+from+inflammatory+damage+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Mitophagy protects β cells from inflammatory damage in diabetes.</a> JCI Insight. 5 (24), 141138(2020).</li>
<li>Gingerich, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intrinsically+disordered+protein+region+encoded+by+the+human+disease+gene+CLEC16A+regulates+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">An intrinsically disordered protein region encoded by the human disease gene CLEC16A regulates mitophagy.</a> Autophagy. 19 (2), 525-543 (2023).</li>
<li>Sun, N., Malide, D., Liu, J., Rovira, I. I., Combs, C. A., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-based+imaging+method+to+measure+in+vitro+and+in+vivo+mitophagy+using+mt-Keima%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima.</a> Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).</li>
<li>Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zinc+indicator+FluoZin-3+is+not+perturbed+significantly+by+physiological+levels+of+calcium+or+magnesium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium.</a> Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).</li>
<li>Da Silva Xavier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54(2018).</li>
<li>Thapa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+%CE%B2-cell+function+using+a+zinc-responsive+MRI+contrast+agent+may+identify+first+responder+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Imaging β-cell function using a zinc-responsive MRI contrast agent may identify first responder islets.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 809867(2022).</li>
<li>Iwashita, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+mitochondrial+autophagy+with+a+novel+fluorescent+small+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of mitochondrial autophagy with a novel fluorescent small molecule.</a> ACS Chemical Biology. 12 (10), 2546-2551 (2017).</li>
<li>Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mitochondrial+transmembrane+potential+by+TMRE+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), 087361(2016).</li>
<li>Klein, B., Wörndl, K., Lütz-Meindl, U., Kerschbaum, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perturbation+of+intracellular+K%28%2B%29+homeostasis+with+valinomycin+promotes+cell+death+by+mitochondrial+swelling+and+autophagic+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Perturbation of intracellular K(+) homeostasis with valinomycin promotes cell death by mitochondrial swelling and autophagic processes.</a> Apoptosis. 16 (11), 1101-1117 (2011).</li>
<li>Ji, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors+TLR2+and+TLR4+block+the+replication+of+pancreatic+%CE%B2+cells+in+diet-induced+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors TLR2 and TLR4 block the replication of pancreatic β cells in diet-induced obesity.</a> Nature Immunology. 20 (6), 677-686 (2019).</li>
<li>Sauvat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+cellular+viability+by+automated+microscopy+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Quantification of cellular viability by automated microscopy and flow cytometry.</a> Oncotarget. 6 (11), 9467-9475 (2015).</li>
<li>Liu, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mt-Keima+detects+PINK1-PRKN+mitophagy+in+vivo+with+greater+sensitivity+than+mito-QC%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Mt-Keima detects PINK1-PRKN mitophagy in vivo with greater sensitivity than mito-QC.</a> Autophagy. 17 (11), 3753-3762 (2021).</li>
<li>Mauro-Lizcano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+method+to+assess+mitophagy+flux+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">New method to assess mitophagy flux by flow cytometry.</a> Autophagy. 11 (5), 833-843 (2015).</li>
</ol>

SAS heeft subsidie ontvangen van Ono Pharmaceutical Co., Ltd. en is consultant voor Novo Nordisk.

Dit protocol beschreef twee complementaire methoden om mitofagieflux in gedissocieerde primaire muiseilandjes te kwantificeren. Met behulp van de mt-Keima-methode werd een toename van mitofagie gekwantificeerd als een verhoogde verhouding van zure (561 nm)/neutrale (405 nm) cellen, terwijl in de MtPhagy-methode een verhoogde mitofagieflux werd gekwantificeerd als een toename van de FluozinhogeMtPhagyhogeTMRElage celpopulatie. Deze methoden maken snelle, kwantitatieve en β-celspecifieke be...

Pancreas-β-cellen produceren en scheiden insuline af om aan de metabole eisen te voldoen, en β-celdisfunctie is verantwoordelijk voor hyperglykemie en het ontstaan van diabetes bij zowel type 1- als type 2-diabetes. β-cellen koppelen het glucosemetabolisme aan insulinesecretie via mitochondriale energetica en metabole output, die afhankelijk zijn van een reserve van functionele mitochondriale massa 1,2,3. Om een optimale functie van β cellen te behouden, vertrouwen β-cellen op mitochondriale kwaliteitscontrolemechanismen om verouderde of beschadigde mitochondriën te verwijderen en functionele mitochondrialemassa te behouden. Selectieve mitochondriale autofagie, ook bekend als mitofagie, is een belangrijk onderdeel van de mitochondriale kwaliteitscontroleroute.
Beoordelingen van mitofagie in levende cellen zijn vaak afhankelijk van veranderingen in de mitochondriale pH die optreden tijdens mitofagie. Mitochondriën hebben een licht alkalische pH en gezonde mitochondriën bevinden zich normaal gesproken in het pH-neutrale cytosol. Tijdens mitofagie worden beschadigde of disfunctionele mitochondriën selectief opgenomen in autofagosomen en uiteindelijk opgeruimd in zure lysosomen5. Verschillende in vivo transgene mitofagie-reportermuismodellen, zoals mt-Keima6, mitoQC7 en CMMR8, evenals transfecteerbare mitofagie-sondes, zoals de Cox8-EGFP-mCherry-plasmide9, maken gebruik van deze pH-verandering om kwantitatieve beoordelingen van mitofagie te geven. Het gebruik van transgene muizen die de mt-Keima pH-gevoelige dual-excitatie ratiometrische sonde tot expressie brengen, is geoptimaliseerd voor mitofagiebeoordelingen in eilandjes en β-cellen via flowcytometrie10,11. De verhouding tussen zure en neutrale mt-Keima-golflengte-emissies (de verhouding tussen zure 561 nm en neutrale 480 nm excitatie) kan worden gebruikt om mitofagie 6,12 robuust te kwantificeren.
Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde benadering om mitofagieflux te beoordelen in primaire eilandjes en β-cellen geïsoleerd uit mt-Keima transgene muizen 10,11. Hoewel mt-Keima een zeer gevoelige sonde is, vereist het ofwel gecompliceerde fokprogramma's voor dieren of de transfectie van cellen, wat vaak een uitdaging kan zijn wanneer het werkt in combinatie met andere genetische modellen of met primaire menselijke eilandjes. Bovendien kan het gebruik van meerdere fluorescentielasers en -detectoren om neutrale en zure celpopulaties te identificeren, het combinatorische gebruik van andere fluorescerende reporters beperken.
Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, beschrijft dit protocol ook een aanvullende, op kleurstof gebaseerde methode met één fluorescerend kanaal voor robuuste detectie van mitofagie in β-cellen van geïsoleerde muiseilandjes. Deze benadering, ook wel de MtPhagy-methode genoemd, maakt gebruik van een combinatie van drie celdoorlatende kleurstoffen om β-cellen te selecteren, de celpopulaties te kwantificeren die actief mitofagie ondergaan en tegelijkertijd het mitochondriale membraanpotentieel (MMP of Δψm) te beoordelen.
De eerste van deze kleurstoffen is Fluozin-3-AM, een celdoorlatende Zn2+ indicator met een Ex/Em 494/516 nm13. Muizeneilandjes bestaan uit een heterogene populatie van functioneel verschillende cellen, waaronder α-, β-, δ- en PP-cellen. β-cellen omvatten ongeveer 80% van de cellen in het muiseilandje en kunnen worden onderscheiden van andere eilandjesceltypen door hun hoge Zn2+-concentratie in insulinekorrels14,15, waardoor β-cellen kunnen worden geïdentificeerd als de Fluozin-3-AMhoge populatie. De MtPhagy-kleurstof, een pH-gevoelige kleurstof die via een chemische binding op mitochondriën wordt geïmmobiliseerd en zwakke fluorescentie afgeeft, wordt ook in dit protocol gebruikt16. Bij mitofagie-inductie worden beschadigde mitochondriën opgenomen in het zure lysosoom en verhoogt de MtPhagy-kleurstof de fluorescentie-intensiteit in de omgeving met een lage pH (Ex/Em 561/570-700 nm).
Daarnaast wordt tetramethylrhodamine, ethylester (TMRE), gebruikt om MMP te beoordelen. TMRE is een celdoorlatende positief geladen kleurstof (Ex/Em 552/575 nm) die wordt afgezonderd door gezonde mitochondriën vanwege de relatieve negatieve lading die wordt ondersteund door hun membraanpotentiaal17. Beschadigde of ongezonde mitochondriën verdrijven hun membraanpotentieel, wat resulteert in een verminderd vermogen om TMRE te sekwestreren. Door deze kleurstoffen samen te gebruiken, kunnen β-cellen die mitofagie ondergaan, worden geïdentificeerd als de FluozinhogeMtPhagyhogeTMRElage populatie via flowcytometrie. Aangezien mitofagie een dynamisch in plaats van statisch proces is, is dit protocol geoptimaliseerd om mitofagieflux te beoordelen met behulp van valinomycine, een K+-ionofoor die mitofagie induceert na dissipatie van MMP18. Vergelijking van mitofagie in de aan- en afwezigheid van valinomycine maakt het mogelijk om de mitofagieflux in verschillende steekproefgroepen te beoordelen.
Het op kleurstoffen gebaseerde karakter van de huidige aanpak maakt het mogelijk om het te extrapoleren naar menselijke eilandjes en andere moeilijk te transfecten celtypen en omzeilt de noodzaak van gecompliceerde fokprogramma's voor dieren, in tegenstelling tot het mt-Keima-protocol. Het overkoepelende doel van dit protocol is om mitofagie in β-cellen op het niveau van één cel te kwantificeren via twee onafhankelijke op flowcytometrie gebaseerde methoden. Alles bij elkaar beschrijft dit protocol twee krachtige en complementaire methoden die zowel precisie als flexibiliteit mogelijk maken in de kwantitatieve studie van mitochondriale kwaliteitscontrole.

<table><tbody><tr><td>Antibiotic-Antimycotic</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT Flow Cytometer</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A24858</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>317275</td><td></td></tr><tr><td>Fatty Acid Free heat shock BSA powder</td><td>Equitech</td><td>BAH66</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gemini Bio</td><td>900-108</td><td></td></tr><tr><td>Fluozin-3AM&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific&nbsp;</td><td>F24195</td><td>100 &mu;g Fluozin-3AM poeder gereconstitueerd in 51 &mu;L DMSO en 51 &mu;L Pluronic F-127 om 1 mM stock te bereiken.&nbsp;</td></tr><tr><td>Gibco&nbsp;RPMI 1640 Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-875-093</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>MtPhagy dye</td><td>Dojindo</td><td>MT02-10</td><td>5 &mu;g MtPhagy poeder gereconstitueerd met 50 &mu;L DMSO om 100 &mu;M stock te bereiken.&nbsp;</td></tr><tr><td>MtPhagy dye</td><td>Dojindo</td><td>MT02-10</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>1x Oplossing gebruikt in procotol door verdunning 1:10 in ddH2O</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline, 10x</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-20</td><td>1x Oplossing gebruikt in procotol door verdunning 1:10 in ddH2O</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td>5 &mu;g MtPhagy poeder gereconstitueerd met 50 &mu;L DMSO om 100 &mu;M stock te bereiken.&nbsp;</td></tr><tr><td>TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate]</td><td>Anaspec</td><td>AS-88061</td><td>TMRE poeder gereconstitueerd in DMSO om 100 &mu;M stock te bereiken.</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Valinomycin</td><td>Sigma</td><td>V0627</td><td>Valinomycin poeder gereconstitueerd in DMSO om 250 nM stock te bereiken.</td></tr></tbody></table>

complementaire benaderingen om mitofagieflux in pancreas-β-cellen te ondervragen

Complementary Approaches to Interrogate Mitophagy Flux in Pancreatic &#946;-Cells

Mitofagie is een kwaliteitscontrolemechanisme dat nodig is om een optimale mitochondriale functie te behouden. Disfunctionele β-cel mitofagie resulteert in onvoldoende insulineafgifte. Geavanceerde kwantitatieve beoordelingen van mitofagie vereisen vaak het gebruik van genetische verslaggevers. Het mt-Keima-muismodel, dat een mitochondriën-gerichte pH-gevoelige dual-excitatie ratiometrische sonde uitdrukt voor het kwantificeren van mitofagie via flowcytometrie, is geoptimaliseerd in β-cellen. De verhouding tussen zure en neutrale mt-Keima-golflengte-emissies kan worden gebruikt om mitofagie robuust te kwantificeren. Het gebruik van genetische mitofagieverslaggevers kan echter een uitdaging zijn bij het werken met complexe genetische muismodellen of moeilijk te transfecteren cellen, zoals primaire menselijke eilandjes. Dit protocol beschrijft een nieuwe complementaire, op kleurstof gebaseerde methode om β-celmitofagie in primaire eilandjes te kwantificeren met behulp van MtPhagy. MtPhagy is een pH-gevoelige, celdoorlatende kleurstof die zich ophoopt in de mitochondriën en de fluorescentie-intensiteit verhoogt wanneer mitochondriën zich in omgevingen met een lage pH bevinden, zoals lysosomen tijdens mitofagie. Door de MtPhagy-kleurstof te combineren met Fluozin-3-AM, een Zn2+ -indicator die selecteert voor β-cellen, en Tetramethylrhodamine, ethylester (TMRE) om het mitochondriale membraanpotentieel te beoordelen, kan mitofagieflux specifiek in β-cellen worden gekwantificeerd via flowcytometrie. Deze twee benaderingen zijn zeer complementair en zorgen voor flexibiliteit en precisie bij het beoordelen van de mitochondriale kwaliteitscontrole in tal van β-celmodellen.

Beoordeling van mitofagie via de op kleurstof gebaseerde MtPhagy-benadering Deze op kleurstof gebaseerde benadering is geoptimaliseerd om mitofagieflux in primaire β-cellen van muizen te analyseren zonder dat er een genetische reporter nodig is, met behulp van Fluozin-3-AM, TMRE en MtPhagy en DAPI om dode cellen uit te sluiten. Door deze kleurstoffen te combineren met valinomycine om mitofagie te induceren, schetst dit protocol een op kleurstoffen gebaseerde methode om selectief de mitofagieflux te me...

Dit protocol schetst twee methoden voor de kwantitatieve analyse van mitofagie in pancreas-β-cellen: ten eerste een combinatie van celdoorlatende mitochondriën-specifieke kleurstoffen en ten tweede een genetisch gecodeerde mitofagie-reporter. Deze twee technieken vullen elkaar aan en kunnen worden ingezet op basis van specifieke behoeften, waardoor flexibiliteit en precisie mogelijk zijn bij het kwantitatief aanpakken van mitochondriale kwaliteitscontrole.

Complementaire benaderingen om mitofagieflux in pancreas-β-cellen te ondervragen

Mitophagy is a quality control mechanism necessary to maintain optimal mitochondrial function. Dysfunctional &#946;-cell mitophagy results in insufficient ...

Ons protocol beschrijft twee complementaire methoden om bètacelmitofagieflux te bestuderen bij de resolutie van één cel via flowcytometrie. Het mt-Keima-protocol maakt gebruik van een genetische mitofagie-reporter, terwijl het MtPhagy-protocol drie fluorescerende kleurstoffen combineert, waardoor het gemakkelijk te extrapoleren is naar moeilijk te transfecteren cellen in menselijke monsters. Beoordelingen van mitofagie met behulp van traditionele biochemische benaderingen en beeldvormingsbenaderingen zijn zowel tijdrovend als uitdagend.Het is dus belangrijk om nieuwe, robuuste en effectieve methoden te ontwikkelen om mitofagieflux in bètacellen te bestuderen. Zowel de mt-Keima- als de MtPhagy-methode zijn kwantitatieve beoordelingen die efficiënt zijn voor het bestuderen van mitofagieflux in bètacellen van de alvleesklier. Het Soleimanpour-lab richt zich dus op de verschillende mechanismen die het falen van bètacellen van de alvleesklier en diabetes veroorzaken.En we richten ons specifiek op de verschillende aspecten van de mitochondriale levenscyclus, waaronder mitofagie, om te begrijpen hoe defecten in de mitochondriale functie de ontwikkeling van diabetes stimuleren.

complementary-approaches-to-interrogate-mitophagy-flux-pancreatic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we in detail een time-lapse videomicroscopie-benadering om de temporele recrutering van EYFP-Parkin te meten tijdens de selectieve verwijdering van beschadigde mitochondriën. Dit dynamische proces van EYFP-Parkin-afhankelijke verwijdering van beschadigde mitochondriën kan worden gebruikt als een indicator van cellulaire gezondheid onder verschillende experimentele omstandigheden.

Time-lapse video microscopie voor de Beoordeling van EYFP-Parkin Aggregation als marker voor Cellular mitofagie

Mitophagy, het proces van clearing beschadigd de mitochondriën, is noodzakelijk voor mitochondriale homeostase en gezondheid onderhoud. Dit artikel presenteert een aantal van de meest recente mitophagy detectiemethoden in menselijke cellen, Caenorhabditis elegansen muizen.

In Vitro en In Vivo opsporing van Mitophagy in menselijke cellen, C. Elegansen muizen

Dit protocol schetst een methode voor kwantitatieve analyse van mitophagy eiwit complexvorming specifiek in bètacellen van primaire menselijke eilandje monsters. Deze techniek maakt dus analyse van mitophagie van beperkt biologisch materiaal mogelijk, die cruciaal zijn in de voorbeelden van kostbare humane alvleesklier bètacellen.

Visualisatie van endogene Mitophagie complexen in situ in humane pancreas Bètacellen met behulp van proximity Ligatie test

Mitofagie is het primaire mechanisme van mitochondriale kwaliteitscontrole. De evaluatie van mitofagie in vivo wordt echter belemmerd door het gebrek aan betrouwbare kwantitatieve testen. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de observatie van mitofagie in levende cellen met behulp van een celpermeant groen-fluorescerende mitochondriënkleurstof en een rood-fluorescerende lysosoomkleurstof.

Mitofagie visualiseren met fluorescerende kleurstoffen voor mitochondriën en lysosoom

Het doel van dit protocol is om autofagische niveaus in alvleesklierkanker en pancreasacinaire cellen te bepalen door middel van LC3-immunofluorescentie en LC3-puntkwantificering.

Evaluatie van autofagieniveaus in twee verschillende pancreascelmodellen met behulp van LC3-immunofluorescentie

Het verkennen van mitofagie door middel van elektronenmicroscopie, genetische sensoren en immunofluorescentie vereist dure apparatuur, geschoold personeel en een aanzienlijke tijdsinvestering. Hier demonstreren we de werkzaamheid van een commerciële fluorescentiekleurstofkit bij het kwantificeren van het mitofagieproces in zowel Caenorhabditis elegans als een leverkankercellijn.

Detectie van mitofagie in Caenorhabditis elegans en zoogdiercellen met behulp van organel-specifieke kleurstoffen

Murine eilandjes van Langerhans Isolatie

Experimentele benaderingen van Tissue Engineering

Het bereiken van hoge kwaliteit en de juiste hoeveelheid van de menselijke eilandjes is een van de prominente voorwaarden voor een succesvolle transplantatie eilandjes van Langerhans. In deze video, beschrijven we stap voor stap de procedures voor de menselijke eilandjes van Langerhans isolatie (deel I: de spijsvertering en het verzamelen van de pancreas weefsel) met behulp van een aangepaste automatische methode.

Human eilandjes van Langerhans Isolatie: Deel I: Spijsvertering en verzameling van alvleesklierweefsel

Het volgende protocol schetst het proces van het pancreas dissectie voor virtuele slice beeldvorming, en de daaropvolgende kwantificering van alle GFP-gelabelde beta-cellen in de gehele alvleesklier.

In situ kwantificering van beta-celmassa in Muizen

Ontdek twee complementaire methoden om mitofagieflux in pancreas-β-cellen te analyseren met behulp van flowcytometrie en fluorescentie. Deze technieken bieden kwantitatieve inzichten voor diabetesonderzoek.

Complementaire benaderingen om mitofagieflux in pancreas-β-cellen te ondervragen

Meer video's verkennen