Name: In Planta Genexpressie en genbewerking in Moso Bamboo Leaves (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Leer een efficiënte in planta methode voor genexpressie en genbewerking in bamboebladeren met Agrobacterium. Deze techniek versnelt de validatie van genfuncties en biedt nieuwe mogelijkheden voor bamboeveredeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen het National Key Research and Development Program of China (Grant No. 2021YFD2200502), de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31971736) bedanken voor de financiële steun.

1. Voorbereiding van bamboezaailingen
<ol><li>Bereid zaailingen van moso-bamboe (Phyllostachys edulis) voor met zaden die zijn geoogst in Guilin, Guangxi, China. Begin met het weken van de zaden in water gedurende 2-3 dagen en zorg ervoor dat je het water dagelijks ververst. Maak vervolgens een substraat door aarde en vermiculiet te mengen in een verhouding van 3:1.</li>
	<li>Zaai de geweekte zaden in het substraat om te ontkiemen. Houd de zaailingen onder laboratoriumomstandigheden en houd de temperatuur tussen 18-25 °C. Zorg voor een fotoperiode van 16 uur licht/8 uur donker met een lichtintensiteit van 250-350 μmol/m2/s tijdens de lichtfase.</li>
	<li>Zorg voor een relatieve luchtvochtigheid van ongeveer 60%. Gebruik voor Agrobacterium-infectie zaailingen die 15 dagen oud zijn en een hoogte hebben van 2-10 cm, wat het beste stadium is voor transformatie. LET OP: Omdat de bloei van bamboe onvoorspelbaar is, zijn zaden niet elk jaar beschikbaar. De zaden worden meestal 2-3 jaar bewaard bij 4 °C in een droge omgeving en kunnen nog steeds een levensvatbaarheid van meer dan 20% behouden.</li>
</ol>2. Bereiding van plasmiden en Agrobacterium
<ol><li>Plasmiden: Om het voorbijgaande expressie-effect te valideren, gebruikt u het pHDE-35S::RUBY-construct dat een zichtbaar reporter-gen bevat dat wordt aangedreven door de CaMV 35S-promotor 10. Gebruik voor het bewerken van genen het pCambia1300-Ubi::Cas9-construct, dat het Cas9-gen draagt dat wordt aangedreven door de maïs Ubi-promotor 11. Voeg de sgRNA-geleidingssequenties van PeVDE en andere doelgenen tussen de twee AarI-sites in het pCambia1300-Ubi::Cas9-construct 9 in.</li>
	<li>Plaats de CRISPR/Cas9-gids-RNA-sequenties tussen de twee AarI-restrictie-endonucleaseplaatsen van het pCambia1300-Ubi::Cas9-construct , inclusief PeVDE - en PeCCR5-doelgenen .</li>
	<li>Voeg GGCA toe aan het 5'-uiteinde van de 20-nucleotidesequentie en synthetiseer een enkelstrengs DNA-sequentie. Omgekeerd complement de 20-nucleotidesequentie en voeg AAAC toe aan het 5'-uiteinde, en synthetiseer vervolgens een andere enkelstrengs DNA-sequentie.</li>
	<li>Verdun beide enkelstrengs DNA-sequenties tot een concentratie van 10 nM/L in verdund water, meng grondig en verwarm gedurende 5 minuten bij 95 °C. Laat het mengsel afkoelen tot kamertemperatuur, wat resulteert in de vorming van dubbelstrengs adapters.</li>
	<li>Verbind de adapters met het lineaire pCambia1300-Ubi::Cas9-fragment verteerd door AarI-endonuclease met behulp van T4-DNA-ligase en sequentie van de geconstrueerde CRISPR/Cas9-vector om het gewenste gengerichte construct te verkrijgen.</li>
	<li>Om plasmiden om te zetten in Agrobacterium, gebruikt u de vries-dooimethode als volgt: Meng 1 μL van de plasmiden (concentratie: 10 - 1.000 ng/μL) met 100 μL Agrobacterium-competente cellen (translatie-efficiëntie: > 1 x 10 4 kolonievormende eenheden/μg) en meng ze voorzichtig. Leg het mengsel 5 minuten op ijs. Breng het mengsel over aan vloeibare stikstof gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Ontdooi het mengsel in een waterbad van 37 °C gedurende 5 min. Voeg 500 μL Luria-Bertani (LB) medium toe aan het mengsel en incubeer het gedurende 2-3 uur op een schudincubator bij 28 °C bij 200 rpm. Introduceer de pHDE-35S::ROBY-plasmiden afzonderlijk in de AGL1-, GV3101-, LBA4044- en EHA105-stammen van Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens)12. Introduceer de CRISPR/Cas9-plasmiden in de GV3101-stam van A. tumefaciens.</li>
	<li>Kweek Agrobacterium in gistextractpepton (YEP) medium (10 g rundvleesextract, 10 g gistextract en 5 g NaCl per L) met de bijbehorende antibiotica (spectinomycine voor 35S::RUBY en kanamycine voor CRISPR/Cas9) bij 28 °C. De enkele kolonies werden 36-48 uur na de teelt waargenomen.</li>
	<li>Pluk de kolonies en breng ze over in vloeibaar YEP-medium (met bijbehorende antibiotica) voor verdere groei. Gebruik na 24-36 uur de primers van RUBY-F en RUBY-R (Tabel 1) om PCR uit te voeren om de succesvolle overdracht van plasmiden naar Agrobacterium te bevestigen.</li>
	<li>Breng 1 ml van de succesvol getransformeerde Agrobacterium over in 100 ml vers vloeibaar YEP-medium (met bijbehorende antibiotica) en laat het vervolgens een nacht groeien bij 28 °C tot een OD600 van 0,8.</li>
	<li>Centrifugeer de bacteriële suspensie bij 4.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, was de bacteriepellet eenmaal met suspensie infiltratiemedium (10 mM MgCl2 en 10 mM MES-KOH [pH 5,6]) en centrifugeer vervolgens opnieuw. Resuspendeer de bacteriekorrel in een suspensie-infiltratiemedium tot een OD600 van 0,6 voor bamboetransformatie.</li>
</ol>3. Agrobacterium -gemedieerd in planta transformatiesysteem
<ol><li>Bereid je voor op transformatie; Verwijder de zaailingen met wortels die aan de aarde vastzitten voorzichtig uit het substraat en zorg ervoor dat de wortels intact blijven. Wikkel de zaailingen in aluminiumfolie om vocht vast te houden en loslating van de grond te voorkomen (Figuur 1A).</li>
	<li>Breng de verpakte zaailingen gedurende 2 uur over naar een omgeving met een hogere luchtvochtigheid (relatieve luchtvochtigheid >90%) en een lagere verlichting (intensiteit minder dan 50 μmol/m2/s).</li>
	<li>Wikkel met een scherpe naald van een injectiespuit het bovenste deel van gekrulde onrijpe bladeren (ongeveer 1-2 cm van de bovenkant) van de bamboezaailingen een of twee keer op (zoals aangegeven door de rode driehoeken in figuur 1A).</li>
	<li>Dompel daarna het gewonde bovenste deel van de zaailingen in suspensies van Agrobacterium. Voer het hele proces, van verwonden tot onderdompelen in Agrobacterium snel uit, omdat de verse wond de inoculatie-efficiëntie verhoogt.</li>
	<li>Breng de zaailingen onmiddellijk over naar een vacuümkamer met een druk van 25-27 mmHg gedurende 2 minuten (Figuur 1B).</li>
	<li>Pak de zaailingen na het stofzuigen voorzichtig uit en plant ze opnieuw in het substraat. Zet de zaailingen gedurende 2 dagen in weinig licht of duisternis (<50 μmol/m2/s) met een hoge luchtvochtigheid (RV>90%) bij kamertemperatuur (18-25 °C). Kweek vervolgens de zaailingen onder normale groeiomstandigheden en geef ze elke 5-7 dagen water. Observeer hun fenotypes om materiaal te leveren voor volgende experimenten.</li>
</ol>4. Ontwerpen van single guide RNA's (sgRNA's) voor genbewerking
<ol><li>Identificeer een protospacer aangrenzend motief (PAM)-plaats in de buurt van een specifiek en geconserveerd domein van de doelgensequentie. Zorg ervoor dat de specifieke PAM-sequentie NGG is in dit CRISPR/Cas9-systeem. Controleer de specificiteit van de geselecteerde sequentie op het doel door een BlastN-zoekopdracht uit te voeren in de bamboegenoomdatabase. Zorg ervoor dat het sgRNA uniek is, vooral in het stroomopwaartse gebied en dicht bij de PAM 9,11. OPMERKING: Deze vergelijking zal potentiële off-target sites in het genoom die worden beïnvloed door het genbewerkingsproces effectief verminderen.</li>
	<li>Ontwerp twee sgRNA's (sgRNA-1 en sgRNA-2) op het eerste exon van het PeVDE-gen 13. Neem AgeI-restrictieplaatsen stroomopwaarts van de PAM in sgRNA-1 en XbaI-restrictieplaatsen stroomopwaarts van de PAM in sgRNA-2 op. Ontwerp één sgRNA op het vierde exon van het PeCCR5-gen , dat codeert voor het geconserveerde motief van KNWYCYGK. Dit motief is van cruciaal belang voor de katalyse van CCR's14.</li>
	<li>Ontwerp een 20-nucleotide-afstandssequentie naast de PAM-site. Deze afstandssequentie zal het Cas9-enzym naar de doellocatie leiden voor DNA-splitsing en daaropvolgende genbewerking. OPMERKING: Het is raadzaam om een doelgebied stroomopwaarts van de splitsingsplaats van het endonuclease-enzym binnen de PAM-plaats te kiezen. Dit zal de validatie van de efficiëntie van genbewerking vergemakkelijken.</li>
</ol>5. Primerontwerp en PCR
<ol><li>Ontwerp handmatig specifieke primers voor amplificatie van de PeVDE- en PeCCR5-fragmenten . Ontwerp de stroomopwaartse en stroomafwaartse primers zo dat ze zich ten minste 100 bp buiten de doellocatie bevinden, met een lengteverschil van meer dan 100 bp om een duidelijke bandscheiding tijdens elektroforese mogelijk te maken. Ontwerp primers voor amplificatie van RUBY binnen de eerste 500 bp van het gen. Tabel 1 bevat een lijst van alle gebruikte primers.</li>
	<li>Gebruik een high-fidelity DNA-polymerase voor PCR. Gebruik in dit geval DNA-polymerase met hoge getrouwheid en efficiënte amplificatie bij het klonen van genen.</li>
	<li>Bereid het PCR-reactiemengsel als volgt: 5x buffer (Mg2+ Plus): 4 μL; dNTP-mengsel (elk 2,5 mM): 1,6 μL; Voorwaartse en achterwaartse primers (elk 10 pmol): elk 1 μL; bamboe genoom DNA (ongeveer 50 ng); DNA-polymerase (2,5 E/μL): 0,2 μL; Verdun water tot een totaal volume van 20 μL.</li>
	<li>Volg de PCR-bedrijfsomstandigheden: Initiële denaturatie bij 98 °C gedurende 5 minuten; Denaturatie bij 98 °C gedurende 10 s; Gloeien bij 56 °C gedurende 5 s; Verlenging bij 72 °C gedurende 30 s; Herhaal de denaturatie tot verlenging gedurende 32 cycli; Laatste verlenging bij 72 °C gedurende 5 min; Voor onbepaalde tijd op 4 °C houden. OPMERKING: PCR-omstandigheden worden als voorbeeld gegeven en moeten mogelijk worden geoptimaliseerd voor specifieke toepassingen of doelen.</li>
</ol>6. DNA-extractie, endonuclease-enzymvertering en sequencing
<ol><li>Scheid het gebied met de laagste NPQ-waarden van verse bamboebladmessen met behulp van een schaar, zoals geïdentificeerd door de beeldvormende PAM-fluorometer (zie stap 7.4). Vries de bladmonsters in met vloeibare stikstof en breng de bevroren bladmonsters over in een vijzel. Maal de monsters met behulp van een stamper tot een fijn poeder en voeg tijdens het maalproces voldoende vloeibare stikstof toe. Deze stap helpt bij het vrijgeven van de cellulaire inhoud, inclusief DNA.</li>
	<li>Genoom-DNA extraheren uit het blad in poedervorm met behulp van de Cetyltrimethylammonium-ammoniumbromide (CTAB)-methode. Voeg 50 mg bladpoedermonsters toe aan 800 μL van een 2% CTAB-oplossing. Meng het monster grondig en incubeer het gedurende 30 minuten bij 65 °C, waarbij het om de 5 minuten zachtjes wordt geschud.</li>
	<li>Voeg een gelijk volume chloroform/isoamylalcohol (24:1, v/v) toe en schud het mengsel krachtig. Breng na het centrifugeren bij 8.000 g gedurende 8 minuten het supernatans over in een nieuwe buis.</li>
	<li>Voeg een gelijk volume chloroform/isoamylalcohol toe en herhaal stap 6.3. Voeg een gelijk volume ijskoude isopropanol toe en keer de buis meerdere keren om voordat u deze gedurende 30 minuten bij -20 °C plaatst. Na 5 minuten centrifugeren bij 8.000 x g de supernatant weggooien.</li>
	<li>Was de DNA-korrel 2x met 75% ethanol op 4 °C, los vervolgens op in 50 μL water.</li>
	<li>Amplificeer het genomische DNA met de doellocatie van de doelgenen van zowel wildtype als met Agrobacterium geïnfecteerde bamboebladeren met het protocol in stap 5.4.</li>
	<li>Voer de endonuclease-enzymvertering van de PCR-producten uit. Selecteer een specifiek enzym dat de gewenste restrictieplaatsen binnen de geamplificeerde DNA-fragmenten herkent. Gebruik AgeI en XbaI endonucleases voor de spijsvertering.</li>
	<li>Bereid een reactiemengsel bestaande uit AgeI of XbaI (20 eenheden/μL) - 1 μL, 1 μg PCR-producten, 10x buffer- 5 μL en voeg water toe tot een totaal volume van 50 μL. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.</li>
	<li>Analyseer het aandeel verteerde DNA-fragmenten met behulp van gelelektroforese. Vergelijk de verteerde fragmenten van de wildtype en Agrobacterium-geïnfecteerde monsters om de efficiëntie van het bewerken van genen te beoordelen.</li>
	<li>Tag de transposase-adapter TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG en GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG sequenties naar het 5'-uiteinde van respectievelijk de voorwaartse en achterwaartse primers voor de versterking van PeVDE- en PeCCR5-fragmenten 9,15. Gebruik het protocol beschreven in stap 5.4 voor versterking. Bereid de PCR-producten (vóór de vertering) voor op diepe sequencing.</li>
</ol>7. Meting van chlorofylfluorescentie van NPQ-waarden in bladeren
<ol><li>Stel de bamboezaailingen voorafgaand aan de metingen gedurende 2 uur bloot aan een hoge lichtintensiteit van 1200 μmol/m2/s. Deze blootstelling verhoogt de hoeveelheid geabsorbeerd licht en activeert het fotoprotectiesysteem in de bladeren.</li>
	<li>Gebruik een beeldvormende PAM-fluorometer om de in vivo PS II chlorofylfluorescentie van bamboebladeren te meten. Stel de actinische lichtintensiteit in op 800 μmol/m2/s voor fluorescentiemetingen van 6 minuten. Breng gedurende deze periode elke 30 s een verzadigingspuls aan om chlorofylfluorescentiecurven te verkrijgen. De stabiele waarden van de curven worden gebruikt voor berekeningen13.</li>
	<li>Bereken de niet-fotochemische afschrikking (NPQ) met behulp van de formule: NPQ = (F m - F m') / F m' waarbij F m staat voor de maximale fluorescentie in de aan het donker aangepaste toestand, en Fm' voor de maximale fluorescentie in elke aan het licht aangepaste toestand.</li>
	<li>Bewaak de NPQ-waarden via de visuele interface van de beeldvormingssoftware. De software maakt real-time analyse en weergave van de fluorescentiegegevens mogelijk, inclusief de NPQ-waarden.</li>
</ol>

Ontwikkeling van methoden voor gentransformatie en bewerking in bamboe

<ol><li>Jiang, Z. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJiang%2C+ZH+%22World+Bamboo+and+Rattan+%28in+Chinese%29%22">World Bamboo and Rattan (in Chinese)</a>. , Liaoning Science and Technology Publishing House. Shenyang, China. (2002).</li>
<li>Ye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+plant+regeneration+and+transformation+system+of+ma+bamboo+%28Dendrocalamus+latiflorus+Munro%29+started+from+young+shoot+as+explant%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">An efficient plant regeneration and transformation system of ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro) started from young shoot as explant.</a> Frontiers in Plant Science. 8, 1298(2017).</li>
<li>Ye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+CRISPR%2FCas9+mediated+genome+editing+and+its+application+in+manipulating+plant+height+in+the+first+generation+of+hexaploid+Ma+bamboo+%28Dendrocalamus+latiflorus+Munro%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Robust CRISPR/Cas9 mediated genome editing and its application in manipulating plant height in the first generation of hexaploid Ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro).</a> Plant Biotechnology Journal. 18 (7), 1501-1503 (2020).</li>
<li>Xiang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+purple+Ma+bamboo+%28Dendrocalamus+latiflorus+Munro%29+with+enhanced+drought+and+cold+stress+tolerance+by+engineering+anthocyanin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Production of purple Ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro) with enhanced drought and cold stress tolerance by engineering anthocyanin biosynthesis.</a> Planta. 254 (3), 50(2021).</li>
<li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+genetic+transformation+and+CRISPR%2FCas9-based+genome+editing+system+for+moso+bamboo+%28Phyllostachys+edulis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">An efficient genetic transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing system for moso bamboo (Phyllostachys edulis).</a> Frontiers in Plant Science. 13, 822022(2022).</li>
<li>Lee, M. W., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+assay+by+agroinfiltration+of+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transient expression assay by agroinfiltration of leaves.</a> Methods in Molecular Biology. 323, 225-229 (2006).</li>
<li>Canto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+systems+in+plants%3A+potentialities+and+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Transient expression systems in plants: potentialities and constraints.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 896, 287-301 (2016).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+production+and+expedient+screening+of+CRISPR%2FCas9-mediated+non-transgenic+mutant+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Horticulture+Research%22%5BJournal%5D)">A method for the production and expedient screening of CRISPR/Cas9-mediated non-transgenic mutant plants.</a> Horticulture Research. 5, 13(2018).</li>
<li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+biotechnology+for+in-planta+gene+editing+and+its+application+in+promoting+flavonoid+biosynthesis+in+bamboo+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A new biotechnology for in-planta gene editing and its application in promoting flavonoid biosynthesis in bamboo leaves.</a> Plant Methods. 19 (1), 20(2023).</li>
<li>He, Y., Zhang, T., Sun, H., Zhan, H., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reporter+for+noninvasively+monitoring+gene+expression+and+plant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Horticulture+Research%22%5BJournal%5D)">A reporter for noninvasively monitoring gene expression and plant transformation.</a> Horticulture Research. 7 (1), 152(2020).</li>
<li>Wang, C., Shen, L., Fu, Y., Yan, C., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+CRISPR%2FCas9+system+for+multiplex+genome+editing+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">A simple CRISPR/Cas9 system for multiplex genome editing in rice.</a> Journal of Genetics and Genomics. 42 (12), 703-706 (2015).</li>
<li>McCormick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leaf+disc+transformation+of+cultivated+tomato+%28L.+esculentum%29+using+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Leaf disc transformation of cultivated tomato (L. esculentum) using Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Cell Reports. 5 (2), 81-84 (1986).</li>
<li>Lou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+violaxanthin+de-epoxidase+gene+from+moso+bamboo%2C+confers+photoprotection+ability+in+transgenic+Arabidopsis+under+high+light%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">a violaxanthin de-epoxidase gene from moso bamboo, confers photoprotection ability in transgenic Arabidopsis under high light.</a> Frontiers in Plant Science. 13, 927949(2022).</li>
<li>Zhou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+cinnamoyl+CoA+reductases+involved+in+parallel+routes+to+lignin+in+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Distinct cinnamoyl CoA reductases involved in parallel routes to lignin in Medicago truncatula.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17803-17808 (2010).</li>
<li>De Roeck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleterious+ABCA7+mutations+and+transcript+rescue+mechanisms+in+early+onset+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Deleterious ABCA7 mutations and transcript rescue mechanisms in early onset Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica. 134 (3), 475-487 (2017).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen tegenstrijdige belangen hebben.

Deze methode vermindert de benodigde tijd aanzienlijk in vergelijking met traditionele genetische transformatiemethoden, die doorgaans 1-2 jaar duren, en bereikt voorbijgaande expressie van exogene genen en genbewerking van endogene genen binnen 5 dagen. Deze methode heeft echter beperkingen omdat het slechts een klein deel van de cellen kan transformeren, en de gen-bewerkte bladeren zijn chimeer en missen het vermogen om te regenereren tot complete planten. Desalniettemin biedt deze technologie voor genexpressie en genb...

Het onderzoek naar de genfunctie in bamboe is veelbelovend voor het geavanceerde begrip van bamboe en het ontsluiten van het potentieel voor genetische modificatie. Een effectieve manier hiervan kan worden bereikt door het proces van Agrobacterium-gemedieerde infectie in bamboebladeren, waarbij het T-DNA-fragment met exogene genen in de cellen wordt ingebracht, wat vervolgens leidt tot de expressie van de genen in de bladcellen.
Bamboe is een waardevolle en hernieuwbare grondstof met een breed scala aan toepassingen in productie, kunst en onderzoek. Bamboe heeft uitstekende houteigenschappen, zoals hoge mechanische sterkte, taaiheid, matige stijfheiden flexibiliteit1, die nu veel wordt gebruikt in een verscheidenheid aan huishoudelijke en industriële benodigdheden, waaronder tandenborstels, rietjes, knopen, wegwerpservies, ondergrondse pijpleidingen en koeltorenvullers voor thermische energieopwekking. Daarom speelt bamboeveredeling een cruciale rol bij het verkrijgen van bamboevariëteiten met uitstekende houteigenschappen voor het vervangen van kunststoffen en het verminderen van het gebruik van plastic, het beschermen van het milieu en het aanpakken van klimaatverandering, evenals het genereren van aanzienlijke economische waarde.
Traditionele bamboeveredeling staat echter voor uitdagingen vanwege de lange vegetatieve groeifase en de onzekere bloeiperiode. Hoewel er moleculaire veredelingstechnieken zijn ontwikkeld en toegepast op bamboeveredeling, is het proces van bamboegentransformatie tijdrovend, arbeidsintensief en gecompliceerd vanwege de eeltinductie- en regeneratieprocessen 2,3,4,5. Stabiele genetische transformatie vereist vaak Agrobacterium-gemedieerde methoden, waarbij weefselkweekprocessen zoals eeltinductie en regeneratie betrokken zijn. Bamboe heeft echter een laag vermogen tot eeltregeneratie, waardoor de toepassing van stabiele genetische transformatie in bamboe sterk wordt beperkt. Nadat Agrobacterium plantencellen heeft geïnfecteerd, komt het T-DNA-fragment de plantencellen binnen, waarbij de meeste T-DNA-fragmenten niet-geïntegreerd in de cellen blijven, wat resulteert in voorbijgaande expressie. Slechts een klein deel van de T-DNA-fragmenten integreert willekeurig in het chromosoom, wat leidt tot stabiele expressie. De voorbijgaande expressieniveaus vertonen een accumulatiecurve die kan variëren voor elk gen dat tot expressie wordt gebracht door een door Agrobacterium afgeleverd T-DNA. In de meeste gevallen treden de hoogste expressieniveaus 3-4 dagen na infiltratie op en nemen ze snel af na 5-6 dagen 6,7. Eerdere studies hebben aangetoond dat meer dan 1/3e van de mutaties in gen-bewerkte planten verkregen zonder selectiedruk voor resistentie afkomstig is van de voorbijgaande expressie van CRISPR/Cas9, terwijl de resterende minder dan 2/3e afkomstig is van stabiele expressie na DNA-integratie in het genoom8. Dit geeft aan dat T-DNA-integratie in het plantengenoom niet nodig is voor genbewerking. Bovendien remt selectiedruk voor resistentie de groei van niet-transgene cellen aanzienlijk, wat het regeneratieproces van geïnfecteerde explantaten rechtstreeks beïnvloedt. Daarom is het, door gebruik te maken van voorbijgaande expressie zonder selectiedruk voor resistentie in bamboe, mogelijk om niet-geïntegreerde expressie van exogene genen te bereiken en de genfunctie rechtstreeks in plantenorganen te bestuderen. Daarom kan een eenvoudige en tijdbesparende methode worden ontwikkeld voor exogene genexpressie en -bewerking in bamboe9.
De ontwikkelde exogene genexpressie- en genbewerkingsmethode wordt gekenmerkt door zijn eenvoud, kosteneffectiviteit en de afwezigheid van dure apparatuur of complexe procedures9. Bij deze methode werd het bamboe-endogene violaxanthine de-epoxidase-gen (PeVDE) gebruikt als verslaggever voor exogene genexpressie zonder selectiedruk. Dit komt omdat de bewerkte PeVDE in bamboebladeren het fotobeschermingsvermogen bij veel licht vermindert en een afname van de niet-fotochemische afschrikking (NPQ)-waarde vertoont, die kan worden gedetecteerd door middel van chlorofylfluorescentiebeeldvorming. Om de effectiviteit van deze methode aan te tonen, werd een ander bamboe-endogeen gen, het cinnamoyl-CoA-reductase-gen (PeCCR5)9, uitgeschakeld met behulp van dit systeem en genereerde met succes mutanten van dit gen. Deze techniek kan worden gebruikt voor de functionele karakterisering van genen die functies hebben in bamboebladeren. Door deze genen tijdelijk tot overexpressie te brengen in bamboebladeren, kunnen hun expressieniveaus worden verhoogd, of door genbewerking kan hun expressie worden verlaagd, waardoor stroomafwaartse genexpressieniveaus, bladfenotypes en productinhoud kunnen worden bestudeerd. Dit zorgt voor een efficiëntere en haalbaardere aanpak voor genfunctieonderzoek in bamboe. Deze techniek kan worden toegepast op de functionele karakterisering van genen die functioneren in bamboebladeren. Door deze genen tijdelijk tot overexpressie te brengen in bamboebladeren, kunnen hun expressieniveaus worden verhoogd, of door genbewerking kan hun expressie worden verlaagd, waardoor stroomafwaartse genexpressieniveaus, bladfenotypes en productinhoud kunnen worden bestudeerd. Bovendien is het belangrijk op te merken dat, als gevolg van uitgebreide polyploïdisatie, de meerderheid van commercieel belangrijke genen in bamboegenomen aanwezig zijn in meerdere kopieën, wat resulteert in genetische redundantie. Dit vormt een uitdaging voor het uitvoeren van multiplex genoombewerking in bamboe. Voorafgaand aan de toepassing van stabiele genetische transformatie- of genbewerkingstechnieken is het van cruciaal belang om genfuncties snel te valideren. Bij het aanpakken van het probleem van meerdere genkopieën, is een benadering het analyseren van transcriptoomexpressieprofielen om genen te identificeren die actief tot expressie worden gebracht tijdens specifieke stadia. Bovendien maakt het richten op de geconserveerde functionele domeinen van deze genkopieën het mogelijk om gemeenschappelijke doelsequenties te ontwerpen of meerdere doellocaties in dezelfde CRISPR/Cas9-vector op te nemen, waardoor deze genen gelijktijdig kunnen worden uitgeschakeld. Dit zorgt voor een efficiëntere en haalbaardere aanpak voor genfunctieonderzoek in bamboe.

<table><tbody><tr><td>35S::RUBY</td><td>Addgene, United States</td><td>160908</td><td>Plamid construct</td></tr><tr><td>Agrobacterium competent cells van GV3101, EHA105, LBA4404 en AGL1</td><td>Biomed, China</td><td>BC304-01, BC303-01, BC301-01 en BC302-01</td><td>Voor Agrobacterium infectie</td></tr><tr><td>CTAB</td><td>Sigma-Aldrich, United States</td><td>57-09-0</td><td>DNA extractie</td></tr><tr><td>Imaging-PAM fluorometer</td><td>Walz, Effeltrich, Germany</td><td></td><td>Detecteer chlorofyl fluorescentie van bamboebladeren</td></tr><tr><td>ImagingWin</td><td>Walz, Effeltrich, Germany</td><td></td><td>Software voor Imaging-PAM fluorometer</td></tr><tr><td>Paq CI of Aar I</td><td>NEB, United States</td><td>R0745S</td><td>Incorporeren van de doelsequentie in het CRISPR/Cas9 vector.</td></tr><tr><td>PrimeSTAR Max DNA polymerase</td><td>Takara, Japan</td><td>R045Q</td><td>Voor genklonen</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>NEB, United States</td><td>M0202V</td><td>Incorporeren van de doelsequentie in het CRISPR/Cas9 vector.</td></tr></tbody></table>

in planta genexpressie en genbewerking in moso bamboo leaves

In Planta Gene Expression and Gene Editing in Moso Bamboo Leaves

Voor bamboe is een nieuwe planta-gentransformatiemethode ontwikkeld, die de noodzaak van tijdrovende en arbeidsintensieve eeltinductie- en regeneratieprocessen vermijdt. Deze methode omvat Agrobacterium-gemedieerde genexpressie via wonden en vacuüm voor bamboezaailingen. Het toonde met succes de expressie aan van exogene genen, zoals de RUBY reporter en het Cas9-gen , in bamboebladeren. De hoogste transformatie-efficiëntie voor de accumulatie van betalaïne in RUBY-zaailingen werd bereikt met behulp van de GV3101-stam, met een percentage van 85,2% na infectie. Hoewel het vreemde DNA niet integreerde in het bamboegenoom, was de methode efficiënt in het tot expressie brengen van de exogene genen. Verder is er ook een genbewerkingssysteem ontwikkeld met een inheemse reporter die deze methode gebruikt, waaruit een in situ mutant gegenereerd door het bewerkte bamboe violaxanthine de-epoxidase gen (PeVDE) in bamboebladeren, met een mutatiesnelheid van 17,33%. De mutatie van PeVDE resulteerde in verlaagde niet-fotochemische afschrikkingswaarden (NPQ) bij veel licht, die nauwkeurig kunnen worden gedetecteerd door een fluorometer. Dit maakt de bewerkte PeVDE een potentiële native reporter voor zowel exogene als endogene genen in bamboe. Met de verslaggever van PeVDE werd met succes een cinnamoyl-CoA-reductase-gen bewerkt met een mutatiesnelheid van 8,3%. Deze operatie vermijdt het proces van weefselkweek of eeltinductie, wat snel en efficiënt is voor het tot expressie brengen van exogene genen en endogene genbewerking in bamboe. Deze methode kan de efficiëntie van de verificatie van de genfunctie verbeteren en zal helpen bij het onthullen van de moleculaire mechanismen van belangrijke metabole routes in bamboe.

Agrobacterium-gemedieerd in planta genexpressie in bamboebladeren Van het RUBY-reportergen is aangetoond dat het effectief is in het visualiseren van voorbijgaande genexpressie vanwege het vermogen om levendig rood betalaïne te produceren uit tyrosine10. In deze studie werd Agrobacterium-gemedieerde transformatie gebruikt om het exogene ROBIJN-gen tijdelijk tot expressie te brengen in bamboebladeren (Figuur 1</st...

In deze studie werd een nieuwe methode voor planta-genexpressie en genbewerking ontwikkeld, gemedieerd door Agrobacterium , in bamboe. Deze methode verbeterde de efficiëntie van de validatie van genfuncties in bamboe aanzienlijk, wat aanzienlijke implicaties heeft voor het versnellen van het proces van bamboeveredeling.

In Planta Genexpressie en genbewerking in Moso Bamboo Leaves

A novel in planta gene transformation method was developed for bamboo, which avoids the need for time-consuming and labor-intensive callus induction and ...

In deze studie gebruikten we Agrobacterium als vector om vreemde DNA-fragmenten in bamboebladeren te introduceren. De meeste DNA-fragmenten zijn niet geïntegreerd in chromosomen en ondergaan voorbijgaande expressie. We hebben gebruik gemaakt van deze voorbijgaande expressie om genbewerking uit te voeren.De grootste uitdaging is de beperking van genbewerking van bamboebladeren, die niet kunnen regenereren. Dit brengt problemen met zich mee bij het uitvoeren van bewerkingen in regeneratieve organen, zoals jonge scheuten, en het verkrijgen van bewerkte takken of volgende generaties met de gewenste genetische uitdagingen. Het belangrijkste voordeel is het tijdbesparende aspect van het principe.Door bamboegenen rechtstreeks in bamboebladeren te kunnen bewerken, kan genfracties snel worden geverifieerd. Dit elimineert de noodzaak van tijdrovende procedures, zoals weefselkweek of transformatie, waardoor het onderzoek naar bamboe-genfracties aanzienlijk wordt versneld. Het primaire onderzoek zal gericht zijn op het onderzoeken van het moleculaire mechanisme van de vorming van bamboebiomassa.Dit houdt in dat we begrijpen waarom bamboe snel groeit, en die kennis gebruiken om bamboevariëteiten te ontwikkelen die geschikt zijn voor plasticvervangers.

in-planta-gene-expression-and-gene-editing-in-moso-bamboo-leaves

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In situ hybridisatie voor de precieze lokalisatie van de transcripten in planten

Een dubbelstrengs RNA interferentie (dsRNAi) techniek wordt toegepast om down-reguleren van de maïs cinnamoyl co-enzym A-reductase (ZmCCR1) gen tot lagere planten ligninegehalte. Lignine down-regulatie van de celwand wordt gevisualiseerd door microscopische analyses en gekwantificeerd door de Klason methode. Compositionele veranderingen in hemicellulose en cellulose geanalyseerd.

Lignine Neerregeling van<em&gt; Zea mays</em&gt; Via dsRNAi en Klason Lignine Analyse

Veel ontwikkelingsbelangrijke genen hebben cel- of weefselspecifieke expressiepatronen. Dit artikel beschrijft LM RNA-seq experimenten om genen te identificeren die differentieel tot expressie worden gebracht op de grens tussen het blad en de schede van maïs en in lg1-R mutanten in vergelijking met het wildtype. De experimentele overwegingen die hier worden besproken, zijn van toepassing op transcriptomische analyses van andere ontwikkelingsverschijnselen.

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessen uit een analyse van maïs Leaf Development

We ontwikkelden een eenvoudige en efficiënte protocol voor de voorbereiding van grote hoeveelheden soja protoplasten om te studeren van de ingewikkelde regelgeving en signalering mechanismen in levende cellen.

Een eenvoudige methode voor het isoleren van soja protoplasten en toepassing op voorbijgaande gen expressie Analyses

We hebben een nieuwe methode voor het uitdrukken van mede meerdere chimeer fluorescerende fusie-eiwitten in planten te overwinnen van de moeilijkheden van conventionele methoden ontwikkeld. Duurt het voordeel van het gebruik van een enkele uitdrukking plasmide waarin meerdere functioneel onafhankelijk eiwit uiting van cassettes om eiwituitdrukking mede.

Co expressie van meerdere chimeer fluorescerende Fusion eiwitten op een efficiënte manier in planten

De gepresenteerde methode creëert natuurlijke herbivoor beschadigd plantenweefsel door de toepassing van Manduca sexta larven op losgeraakte bladeren van aardappel. Het plantenweefsel wordt onderzocht voor de uitdrukking van zes transcriptiefactor homologs die betrokken zijn bij vroege reacties op insecten herbivory.

Vrijstaande blad testen voor het vereenvoudigen van genexpressie studies in aardappel tijdens besmetting door kauwen insect Manduca sexta

Hier presenteren we een aangepaste screeningmethode die uitgebreid kan worden gebruikt om RNA-uitschakelingssuppressors in plantenpathogenen snel te screenen.

Screening en identificatie van RNA Silencing Suppressors van secreted effectors of Plant Pathogens

Hier gepresenteerd is een protocol voor laser-capture microdissection (LCM) van plantaardige weefsels. LCM is een microscopische techniek voor het isoleren van gebieden van weefsel op een contaminatievrije manier. De procedure omvat weefselfixatie, paraffine inbedding, sectioning, LCM en RNA extractie. RNA wordt gebruikt in de downstream weefselspecifieke, tijdelijk opgeloste analyse van transcripto's.

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing voor ruimtelijke en temporale weefsel-specifieke genexpressie analyse in planten

Een agrobacterium-based injection (agroinjectie) protocol wordt gepresenteerd voor de inenting van vossenstaart mozaïek virus en suikerriet mozaïek virusclones in maïs zaailingen. Inenting op deze manier leidt tot virale infectie, virus-geïnduceerde gen-uitschakeling van markergenen en virale overexpressie van GFP.

Directe agroinoculatie van maïszaailingen door injectie met recombinant vossenstaartmozaïekvirus en suikerrietmozaïekvirus Infectieuze klonen

Hier presenteren we een high-throughput protocol om miljoenen maïsprotoplasten tijdelijk te transfecteren voor het testen van grote bibliotheken van plasmiden in maïsmesofylcellen.

Schaalbare transfectie van maïs mesophyl protoplasten

Het protocol beschrijft het veredelen van resistente zetmeelrijstvariëteiten door ontwerp met behulp van genoombewerkingstechnologieën op een nauwkeurige, efficiënte en technisch eenvoudige manier.

Veredeling door ontwerp voor functionele rijst met genoombewerkingstechnologieën

Leer een efficiënte in planta methode voor genexpressie en genbewerking in bamboebladeren met Agrobacterium. Deze techniek versnelt de validatie van genfuncties en biedt nieuwe mogelijkheden voor bamboeveredeling.

In Planta Genexpressie en genbewerking in Moso Bamboo Leaves

Meer video's verkennen