Name: Membraanexplantatie van cavias met rond venster voor ex vivo-onderzoek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T13:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 14 s
Description: Leer membraanexplantatie van het ronde venster bij cavia's voor ex vivo-onderzoek naar geneesmiddeltransport in het binnenoor. Deze methode behoudt de weefselintegriteit en ondersteunt gerichte studies naar behandelstrategieën voor gehoorverlies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de NIDCD-subsidies nr. 1K08DC020780 en 5T32DC000027-33, en het Rubenstein Hearing Research Fund.

Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (GP18M226). Hartley albino cavia's (zowel mannetje als vrouwtje, met een gewicht van 500-700 g) werden gebruikt in de huidige studie.
1. Opzet en voorbereiding van de procedure
<ol><li>Steriliseer alle instrumenten met ethyleenoxide voordat u met het experiment begint.</li>
	<li>Euthanaseer de dieren volgens het institutioneel goedgekeurde protocol. OPMERKING: In de huidige studie werd een niet-voorgeladen kamer gebruikt om 100% kooldioxide (CO2) uit een commerciële cilinder vrij te maken. Een inline restrictor werd gebruikt om de gasstroom te regelen, waarbij deze binnen het bereik van 30% tot 70% van het volume van de kamer per minuut werd gehouden in overeenstemming met de AVMA-richtlijnen van 202011.</li>
	<li>Plaats het dier in de kamer en geef kooldioxide af gedurende 5 minuten. De CO2 -stroom wordt gedurende 1 minuut na ademstilstand gehandhaafd.</li>
	<li>Voer onthoofding uit na ademstilstand om euthanasie te garanderen.</li>
</ol>2. Chirurgische benadering en explantatie
<ol><li>Haal het slaapbeen op de gebruikelijke manier uit de schedel van de cavia12. Verwijder het overtollige zachte weefsel met een rongeur. Identificeer de uitwendige akoestische meatus, de temporale bulla en het gezichtskanaal13 (Figuur 1).</li>
	<li>Boor de ventrale aspecten van de temporale bulla weg met een diamantboor van 6 mm (zie Materiaaltabel), waardoor de middenoorruimte en de uitwendige gehoorgang rondom bloot komen te liggen.</li>
	<li>Verwijder met behulp van rongeurs voorzichtig de uitwendige gehoorgang en de trommelvliesring, waarbij u tegelijkertijd het incudomalleolaire gewricht scheidt. Identificeer de incus, het incudostapediale gewricht, het slakkenhuis, het horizontale halfcirkelvormige kanaal en het gezichtskanaal13 (figuur 2A).</li>
	<li>Scheid het incudostapediale gewricht en verwijder de incus met een pincet. Identificeer de benige nis van het ronde raam.</li>
	<li>Gebruik een diamantboor van 6 mm om de benige lamina weg te boren die het slakkenhuis verbindt met de mediale wand van de trommelholte in de richting van het tensor tympani-kanaal. Decomprimeer voorzichtig het benige kanaal van de tensor tympani en verwijder de tensor tympani-spier met een naald van 28 G. OPMERKING: De mediale wand van de fossa tensor tympani is rechtstreeks verbonden met het cochleaire bot rond de RWM en er wordt voor gezorgd dat er geen breuken ontstaan die zich kunnen uitstrekken tot het ronde venster.</li>
	<li>Boor de benige lamina weg die het slakkenhuis verbindt met de onderwand van de trommelholte totdat er nog 1 mm benige richel tegen het slakkenhuis overblijft (Figuur 2B).</li>
	<li>Maak met een diamantboor van 2 mm (zie Materiaaltabel) een cochleostoma aan de basale draaiing van het slakkenhuis, waarbij ongeveer 2 mm bot overblijft tot het ronde venster. Zet de cochleostomie inferieur voort in een vlak evenwijdig aan het ronde venstermembraan om de basis te scheiden van de top van het slakkenhuis.</li>
	<li>Verleng de snee van het slakkenhuis door de schedelbasis, die veel dichter is, wat resulteert in een dwarsdoorsnede van de basale draaiing van het slakkenhuis. NOTITIE: Door de boor op de meatus van de inwendige gehoorgang te richten, resulteert dit in een traject dat de botverwijdering maximaliseert en tegelijkertijd voorkomt dat u te dicht bij het ronde venster komt.</li>
	<li>Onderzoek het monster vanaf de basiszijde van de schedel en, indien nog niet gedaan, identificeer de inwendige gehoorgang en boor naar de cochleaire opening. Verwijder de cochleaire zenuw met een naald van 28 G.</li>
	<li>Onderzoek het monster vanaf de intracochleaire zijde. Identificeer en verwijder de ossale spiraallamina in de basale draaiing en de resterende modiolus met een pincet of een naald van 28 G.</li>
	<li>Spoel de verenigde scala tympani-scala vestibuli-holte overvloedig om puin te verwijderen. Het ronde venster moet duidelijk zichtbaar zijn vanaf de cochectomie zonder bovenliggend vuil (Figuur 2C).</li>
	<li>Onderzoek vervolgens het monster vanaf de kant van het middenoor. Boor het laterale halfcirkelvormige kanaal en het gezichtskanaal tot het niveau van het ovale venster. Verwijder de stijgbeugels voorzichtig met een pincet, zodat de ovale raamnis zichtbaar wordt. Merk op dat er een benige brug is tussen de crura van de stijgbeugels die bekend staat als de crista stapedis.</li>
	<li>Open met een diamantboor van 1 mm (zie Materiaaltabel) de vestibule verder door het ovale venster langs de voorkant van het ronde raam uit te schuiven, waarbij u ervoor zorgt dat er 1-2 mm cochleair bot tegen de ronde vensternis blijft (Figuur 2D).</li>
	<li>Voltooi de temporele botsneden door de ovale venstersneden te verbinden met de cochlectomiesneden aan weerszijden van het ronde venster. OPMERKING: Vanwege de kwetsbaarheid van het cochleaire bot, zal het behoud van de fossa tensor tympani in het monster en het vermijden van sneden erdoorheen helpen voorkomen dat cochleaire botfracturen die zich uitstrekken tot de RWM en de integriteit ervan in gevaar brengen.</li>
	<li>Maak de laatste bevestigingen aan het dichte bot van de schedelbasis grenzend aan de inwendige gehoorgang en scheer voorzichtig naar beneden om te resulteren in een uitgesneden RWM-monster (Figuur 3A).</li>
</ol>

Cavia Ronde Venster Membraan Transplantatie

<ol><li>Duan, M. I., Zhi-qiang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+of+round+window+membrane+and+its+role+for+drug+delivery%3A+our+own+findings+and+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Otol%22%5BJournal%5D)">Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review.</a> J Otol. 4 (1), 34-43 (2009).</li>
<li>Kelso, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microperforations+significantly+enhance+diffusion+across+round+window+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Microperforations significantly enhance diffusion across round window membrane.</a> Otol Neurotol. 36 (4), 694-700 (2015).</li>
<li>Salt, A. N., Plontke, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetic+principles+in+the+inner+ear%3A+Influence+of+drug+properties+on+intratympanic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetic principles in the inner ear: Influence of drug properties on intratympanic applications.</a> Hear Res. 368, 28-40 (2018).</li>
<li>Szeto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inner+ear+delivery%3A+Challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope+Investig+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Inner ear delivery: Challenges and opportunities.</a> Laryngoscope Investig Otolaryngol. 5 (1), 122-131 (2020).</li>
<li>Carpenter, A. M., Muchow, D., Goycoolea, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+studies+of+the+human+round+window+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural studies of the human round window membrane.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 115 (5), 585-590 (1989).</li>
<li>Forouzandeh, F., Borkholder, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtechnologies+for+inner+ear+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Microtechnologies for inner ear drug delivery.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 28 (5), 323-328 (2020).</li>
<li>Leong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedles+facilitate+small-volume+intracochlear+delivery+without+physiologic+injury+in+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Microneedles facilitate small-volume intracochlear delivery without physiologic injury in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 44 (5), 513-519 (2023).</li>
<li>Singh, R., Birru, B., Veit, J. G. S., Arrigali, E. M., Serban, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+an+in+vitro+round+window+membrane+model+for+drug+permeability+evaluations%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of an in vitro round window membrane model for drug permeability evaluations.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1105(2022).</li>
<li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+targeted+delivery+of+dexamethasone+acetate+across+the+round+window+membrane+in+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Magnetic targeted delivery of dexamethasone acetate across the round window membrane in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 34 (1), 41-47 (2013).</li>
<li>Kopke, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+nanoparticles%3A+inner+ear+targeted+molecule+delivery+and+middle+ear+implant%5BTitle%5D)+AND+%22Audiol+Neurootol%22%5BJournal%5D)">Magnetic nanoparticles: inner ear targeted molecule delivery and middle ear implant.</a> Audiol Neurootol. 11 (2), 123-133 (2006).</li>
<li>AVMA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AVMA+Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals%3A+2020+Edition%5BTitle%5D)+AND+%22AVMA%22%5BJournal%5D)">AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition.</a> AVMA. , (2020).</li>
<li>Goksu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Ann Otolaryngol. 101 (8), 699-704 (1992).</li>
<li>Wysocki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographical+anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Topographical anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Hear Res. 199 (1), 103-110 (2005).</li>
<li>Veit, J. G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+the+drug+permeability+properties+of+human+cadaveric+in+situ+tympanic+and+round+window+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">An evaluation of the drug permeability properties of human cadaveric in situ tympanic and round window membranes.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1037(2022).</li>
<li>Kansara, V., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+ex+vivo+model+implication+for+carrier-mediated+retinal+drug+delivery%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an ex vivo model implication for carrier-mediated retinal drug delivery).</a> Curr Eye Res. 31 (5), 415-426 (2006).</li>
<li>Lundman, L., Bagger-Sjöbäck, D., Holmquist, L., Juhn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Round+window+membrane+permeability.+An+in+vitro+model%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol+Suppl%22%5BJournal%5D)">Round window membrane permeability. An in vitro model.</a> Acta Otolaryngol Suppl. 457, 73-77 (1989).</li>
<li>Moatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+drug+permeability+through+an+ex+vivo+porcine+round+window+membrane+model%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Assessment of drug permeability through an ex vivo porcine round window membrane model.</a> iScience. 26 (6), 106789(2023).</li>
<li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+microbubble-facilitated+inner+ear+delivery+of+gold+nanoparticles+involves+transient+disruption+of+the+tight+junction+barrier+in+the+round+window+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ultrasound microbubble-facilitated inner ear delivery of gold nanoparticles involves transient disruption of the tight junction barrier in the round window membrane.</a> Front Pharmacol. 12, 689032(2021).</li>
<li>Jeong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctional+modulation+of+round+window+membrane+enhances+dexamethasone+uptake+into+the+inner+ear+and+recovery+after+NIHL%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Junctional modulation of round window membrane enhances dexamethasone uptake into the inner ear and recovery after NIHL.</a> Int J Mol Sci. 22 (18), 10061(2021).</li>
</ol>

De auteurs hoeven geen onthullingen te doen.

Bij lokale medicijnafgifte aan het oor is de RWM de primaire doorgangsroute voor therapieën om het binnenoor te bereiken. Een nauwkeurig en betrouwbaar benchtop-model is nodig om transportmechanismen en permeabiliteit tussen nieuwe leveringsvoertuigen en voor de ontwikkeling van geneesmiddelen beter te begrijpen. In deze studie tonen we aan dat RWM-explantatie bij cavia's een haalbare en betrouwbare procedure is om systematisch onderzoek naar geneesmiddel-membraaninteracties mogelijk te maken. Lundman et al. en Kelso et al. beschreven eerder het gebruik van een vergelijkbaar RWM-permeabiliteitsmodel 2,16; de specifieke stappen van de chirurgische extractie zijn tot nu toe echter niet gedetailleerd en de kwetsbaarheid van het cochleaire bot en de complexe anatomie vormden een uitdaging voor de consistente, en bloc oogst van intacte RWM's.
De cavia RWM bevindt zich aan het einde van de scala tympani van het slakkenhuis en is omgeven door een dun laagje cochleair bot. Breuk van deze botstructuur tijdens het explantatieproces kan resulteren in een onbruikbaar monster, omdat de RWM de neiging heeft weg te scheuren als het omringende cochleaire bot niet intact blijft. Onze groep merkte op dat fracturen het vaakst optraden bij het boren in de buurt van de kruising tussen het zeer dichte schedelbasisbot en het broze slakkenhuis, omdat de overgang in botdichtheid de kans op voortplanting van fracturen door het ronde venster verhoogde. Om deze reden wordt gesuggereerd dat het behoud van het dichtere bot van de fossa tensor tympani, dat in de nabijheid van de RW aan het slakkenhuis is bevestigd, de opbrengst van de oogst van specimens zal verhogen, vooral bij oudere dieren. Verstoring van het bot kan ook optreden tijdens het verwijderen van de cochleaire inhoud; Er moet voor worden gezorgd dat de botvormige spiraallamina voorzichtig wordt verwijderd met minimale manipulatie van het omringende cochleaire bot.
Een belangrijk detail om rekening mee te houden bij dit model is de levensvatbaarheid van de RWM na explantatie. Eerdere groepen hebben gesuggereerd dat RWM van zoogdieren 24-48 uur na extractie levensvatbaar blijft17. De huidige studie heeft deze bevindingen weerspiegeld; consistente transportstudies en histologische analyses die intacte celstructuren aantonen (figuur 2A) hebben beide de levensvatbaarheid van de RWM van de cavia ten tijde van de experimenten ondersteund. Om de algehele gezondheid van het geëxtraheerde monster te behouden, wordt de RWM binnen 3 uur na euthanasie geëxtraheerd en ingebed.
Bij de studie van de farmacokinetiek van geneesmiddelen in de RWM in vivo blijven er aanzienlijke technische problemen bestaan bij het meten van de perilymfatische distributie en concentratie1. Veranderingen in intra-trommelvliente toedieningsmethoden en toegepaste hoeveelheid hebben geresulteerd in uiteenlopende therapeutische resultaten. Deze moeilijkheden worden nog verergerd door de complexe vloeistofdynamica in het labyrint, evenals de onregelmatige uitgang van geïnjecteerd materiaal door de buis van Eustachius. De beschreven explantatiemethode maakt de geïsoleerde studie van de RWM en factoren die van invloed zijn op de permeabiliteit ervan mogelijk als een ex vivo-model . Bovendien maakt de explantatie ook de directe ondervraging en visualisatie mogelijk van verschillende methoden die momenteel worden gebruikt om de RWM-permeabiliteit te vergroten, zoals ultrasone microbellen18 en chemisch geïnduceerde junctionele modulatie19. Toekomstige studies naar specifieke endocytosemechanismen die betrokken zijn bij de toediening van geneesmiddelen zouden ook baat hebben bij dit benchtop-model.

Er zijn nieuwe klassen van therapieën ontstaan voor de behandeling van perceptief gehoorverlies. De vertaling van deze therapieën naar klinische populaties wordt beperkt door veilige en effectieve transportroutes naar het binnenoor. De huidige methoden voor in vivo toediening in dierstudies zijn gebaseerd op fenestratie in het binnenoor of diffusie door het ronde venstermembraan (RWM), een niet-botvormige barrière die de middenoorruimte scheidt van het slakkenhuis.
Chirurgische fenestratie en micro-injectie in het binnenoor zijn beide invasief en kunnen risico's opleveren voor de resterende binnenoorfunctie2. Daarom is de RWM een belangrijke route voor lokale medicijnafgifte, en cavia's zijn het primaire preklinische diermodel dat wordt gebruikt om de lokale farmacokinetiek van geneesmiddelen in de RWM en in het binnenoor te bestuderen voor farmaceutische ontwikkeling 3,4. Hoewel dunner dan de menselijke RWM, deelt de cavia RWM een identieke drielaagse structuur. Het heeft een diameter van ongeveer 1 mm, is 15-25 μm dik en bestaat uit twee epitheelcellagen die een bindweefsellaag5 omklemmen. De epitheellaag die naar het middenoor is gericht, is dicht opeengepakt en verbonden via krappe verbindingen, terwijl de laag die naar het binnenoor en de scala tympani is gericht, een lossere architectuur heeft en geen significante intercellulaire verklevingen heeft.
Huidige preklinische studies naar de permeabiliteit van geneesmiddelen bij de cavia RWM zijn gebaseerd op in-vivo-injecties in het middenoor, gevolgd door de bemonstering van het perilymfevocht in het binnenoor, waardoor de specifieke studie van RWM-transport niet mogelijk is 6,7. Fragmenten van RWM-explantaten zijn gebruikt in preklinische studies, maar vanwege hun kwetsbaarheid en kleine formaat zijn ze niet geschikt voor systematisch, microfluïdisch onderzoek van het transport van geneesmiddelen en voertuigen waarvoor een waterdichte afsluiting over de RWM2 nodig is. Andere groepen hebben in vitro modellen met gekweekte menselijke epitheelcellen gebruikt om de RWM 8,9,10 te benaderen. De meeste van deze constructen richten zich echter uitsluitend op de buitenste epitheellaag en leggen de complexiteit van de oorspronkelijke weefselarchitectuur niet vast. Voor een gedetailleerder inzicht in de transportmechanismen in het RWM zijn gerichte, ex vivo studies nodig.
In deze studie demonstreren we de explantatie van een RWM van een cavia met omringende benige ondersteuning om de integriteit van het membraan te behouden en illustreren we hun gebruik in een experimenteel paradigma dat is ontworpen voor de specifieke studie van het RWM-transport van voertuigen voor medicijnafgifte.

<table><tbody><tr><td>1 mm Diamond Ball Drill Bit</td><td>Anspach</td><td>1SD-G1</td><td></td></tr><tr><td>2 mm Diamond Ball Drill Bit</td><td>Anspach</td><td>2SD-G1</td><td></td></tr><tr><td>6 mm Diamond Ball Drill Bit</td><td>Anspach</td><td>6D-G1</td><td></td></tr><tr><td>ANSPACH EMAX 2 Plus System</td><td>Anspach</td><td>EMAX2PLUS</td><td>Elk botensnijboorsysteem werkt</td></tr><tr><td>BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. met afneembare 1 mL BD Luer-Lok spuit</td><td>Becton, Dickinson, and Co.&nbsp;</td><td>382903057894</td><td>Elke 27-28 G naald</td></tr><tr><td>Gorilla Epoxy</td><td>Gorilla</td><td>4200101</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-CAST</td><td>World Precision Instruments</td><td>KWIK-CAST</td><td></td></tr></tbody></table>

membraanexplantatie van cavia's met rond venster voor ex vivo-onderzoek

Guinea Pig Round Window Membrane Explantation for Ex Vivo Studies

Efficiënte en minimaal invasieve medicijnafgifte aan het binnenoor is een grote uitdaging. Het ronde raammembraan (RWM), een van de weinige toegangspunten tot het binnenoor, is een essentieel aandachtspunt van onderzoek geworden. Vanwege de complexiteit van het isoleren van de RWM blijft ons begrip van de farmacokinetiek ervan echter beperkt. De RWM bestaat uit drie verschillende lagen: het buitenste epitheel, de middelste bindweefsellaag en de binnenste epitheellaag, die elk potentieel unieke afgifte-eigenschappen hebben.
De huidige modellen voor het onderzoeken van transport over de RWM maken gebruik van in vivo diermodellen of ex vivo RWM-modellen die gebaseerd zijn op celculturen of membraanfragmenten. Cavia's dienen als een gevalideerd preklinisch model voor het onderzoek naar de farmacokinetiek van geneesmiddelen in het binnenoor en zijn een belangrijk diermodel voor de translationele ontwikkeling van toedieningsvoertuigen aan het slakkenhuis. In deze studie beschrijven we een aanpak voor explantatie van een cavia RWM met omringend cochleair bot voor benchtop medicijnafgifte-experimenten. Deze methode maakt het mogelijk om de oorspronkelijke RWM-architectuur te behouden en kan een realistischere weergave geven van transportbarrières dan de huidige benchtop-modellen.

Zoals aangetoond in figuur 3A, maakt deze methode het mogelijk om het intacte ronde venstermembraan van cavia's met een omringende ring van stijf bot te explanteren. De RWM moet volledig verbonden zijn met de benige annulus in de omtrek. Er mogen geen fracturen van het cochleaire bot worden gewaardeerd. In vergelijking met menselijke exemplaren met ronde vensters heeft cavia RWM geen bovenliggend pseudomembraan. Bovendien is er, in tegenstelling tot mensen, een benige brug tussen de crura van de stijgbeugels van de cavia, die moet worden gebroken en verwijderd voordat de bovenbouw van de stapes wordt geëxtraheerd. Histologische analyse (Figuur 3B) van de representatieve RWM toont een duidelijke drielaagse epitheelstructuur met een aangrenzende, intacte ronde vensternis.
Vanuit een technisch perspectief zijn er twee cruciale stappen. Ten eerste is het bij het maken van de cochectomie in stap 2.7 belangrijk om de evenaar van de boor te gebruiken, in plaats van de punt, om de snede te maken, omdat kriebels aan de braampunt kunnen leiden tot traumatische breuken in het cochleaire bot die zich kunnen uitstrekken tot het ronde raammembraan. Ten tweede is het belangrijk om de inwendige gehoorgang volledig uit te boren, omdat dit de volledige verwijdering van de cochleaire zenuw mogelijk maakt en de dissectie van de ossale spiraallamina vergemakkelijkt, wat resulteert in een uniforme holte aan de intracochleaire zijde voor experimentele bemonstering (Figuur 2C).
Nadat de RWM met succes was geëxtraheerd, gebruikte onze groep een gemodificeerde Ussing-kamer om de farmacokinetische eigenschappen van het membraan te evalueren. De gemodificeerde Ussing-kamer is gevalideerd door andere groepen in trommelvlies- en ronde venstermembranen en in netvliesweefsel om de transporteigenschappen van epitheelmembranen te evalueren14,15. Dit 3D-geprinte apparaat is geconstrueerd met behulp van Poly-Jet Vero en bestaat uit twee driehoekige basisstukken, elk met een vloeistofkamer van 400 μL (Figuur 3). De benige rand van de RWM wordt op de basis bevestigd met behulp van 2-componenten epoxy (Gorilla, zie Tabel met materialen), gevolgd door siliconenkit (zie Materiaaltabel) om een waterdichte afdichting te garanderen (Figuur 4). Er wordt nauwgezet op gelet dat epoxy of kit niet in contact komt met het membraan. Met de RWM op zijn plaats geklemd, worden de twee bases vervolgens met epoxy aan elkaar gelijmd. Tijdens transportexperimenten wordt de lading (naar het middenoor gericht) gevuld met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) die het toedieningsvoertuig (of een ander interessant molecuul) bevat, en wordt de bemonsteringskamer (scala tympani facing) alleen gevuld met PBS. Op regelmatige tijdstippen wordt vloeistof uit de bemonsteringskamer volledig opgezogen en vervangen door vers PBS.
Tijdens elk experiment worden kwaliteitscontrolemaatregelen genomen om ervoor te zorgen dat er zowel een waterdichte afdichting rond het monster in het apparaat is, als een volledig intact membraan zonder microperforaties. Representatieve resultaten met een bruine, ijzeren nanodeeltjesoplossing worden hieronder weergegeven. De kwantitatieve controle van een waterdichte afdichting wordt bereikt door tijdens elk bemonsteringsinterval het volledige volume van de bemonsteringskamer aan te zuigen; Vloeistof die uit de bemonsteringskamer lekt, resulteert in minder dan het volledige aspiratievolume. Aan het einde van elk experiment moet ook het vloeistofvolume in de laadkamer hetzelfde blijven. Bovendien, omdat onze doelvloeistof bruin van kleur is, is deze ook goed zichtbaar in het geval van een lek.
Om ervoor te zorgen dat er geen lekkage in het membraan ontstaat, zijn verschillende benaderingen gevolgd. Ten eerste worden RWM-monsters die in deze studie zijn gebruikt, allemaal onmiddellijk geëxtraheerd, en lichte, confocale en elektronenmicroscopiebeelden bevestigen intacte cellulaire en membraanstructuren zonder microperforaties (Figuur 3A,B). Ten tweede werden microperforaties opzettelijk gemaakt in een subset van RWM-monsters om het effect op de levering van nanodeeltjes te vergelijken. Visuele inspectie van de bemonsterings- en laadkameraspiratie dient als verdere bevestiging van de integriteit van het monster en de waterdichte bevestiging. In RWM met perforaties is er een snelle balancering van de laad- en bemonsteringskamer, die kan worden waargenomen via een duidelijke kleurverandering (aanvullende figuur 1). Bovendien bleek dat het transport in microgeperforeerde RWM's hoger was dan de maximale variantie die werd waargenomen in intacte membranen (aanvullende figuur 2). Samen dienen deze als kwaliteitscontrolemechanismen voor de integriteit van de waterdichte afdichting rond het monster, evenals de RWM.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65816/65816fig01.jpg"> Figuur 1: Preoperatief beeld van het slaapbeen van de cavia. De trommelvlies, de uitwendige gehoorgang en de aangezichtsgang (*) worden getoond in deze preoperatieve afbeelding van het slaapbeen van de cavia. Schaalbalk = 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/65816fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65816/65816fig02.jpg"> Figuur 2: Intraoperatieve beelden. Intraoperatieve beelden die de relatie aantonen tussen het ronde venstermembraan en de incus (*), slakkenhuis (**), stijgbeugel (†) en gedecomprimeerde interne gehoorgang (‡). Gearceerde gebieden geven delen van het monster aan die zullen worden verwijderd. (A) Middenoorholte van cavia na verwijdering van trommelvlies en aangezichtszenuw (stap 2.3). (B) Middenoorholte na decompressie van het tensortrommelvlieskanaal (stap 2.6). (C) Basale weergave van RWM na cochleostomie en verwijdering van de inhoud van het binnenoor (stap 2.11). (D) Zicht op RWM na verwijdering van de stijgbeugels en identificatie van de vestibule (stap 2.13). Schaalbalk = A,B (1 cm); C,D (5 mm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/65816fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65816/65816fig03.jpg"> Figuur 3: Definitief RWM-monster en histologie. (A) Cavia RWM bruto monster met een benige annulus. Schaalbalk = 1 cm. (B) Histologie van het geëxplanteerde ronde venstermembraan van cavia's toont een intacte drielaagse structuur. Schaalbalk = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/65816fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65816/65816fig04.jpg"> Figuur 4: Microfluïdisch apparaat voor experimenten met transmembraantransport. (A) Diagram van het microfluïdische apparaat dat wordt gebruikt voor experimenten met transmembraantransport. (B,C) Geprint microfluïdisch apparaat voor de experimenten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/65816fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullende figuur 1: Laden en bemonsteren van de inhoud van de kamer gedurende een 5 uur durend experiment met de levering van nanodeeltjes met ijzerkern. (A) De laadkamer van intacte RWM vertoont een geleidelijke daling van de kleurintensiteit naarmate de concentratie van nanodeeltjes afneemt. (B) De bemonsteringskamer van intacte RWM vertoont stabiele kleuring in de tijd, consistent met lage niveaus van nanodeeltjeslevering. (C) De laadkamer van geperforeerde RWM vertoont een snelle daling van de kleurintensiteit aangezien de inhoud in evenwicht is met de bemonsteringskamer. (D) De bemonsteringskamer van geperforeerde RWM toont een geleidelijke toename in kleur in de tijd, in overeenstemming met hoge niveaus van nanodeeltjeslevering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/Supplemental%20Figure%201.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende figuur 2: Representatieve transportresultaten voor de levering van nanodeeltjes. Representatieve transportresultaten voor de levering van nanodeeltjes (Fe3O4-kern met polyethyleenglycolcoating, gemiddelde straal van 77 nm) over RWM bij cavia's, zowel intact als met perforaties (gemiddelde ± SD, n ≥ 3 RWM-experimenten). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/Supplemental%20Figure%202.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Dit protocol schetst een methode voor de explantatie van het ronde venstermembraan uit slaapbeenderen van cavia's, wat een waardevolle bron is voor ex vivo-studies .

Membraanexplantatie van cavia's met rond venster voor ex vivo-onderzoek

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry ...

Onze groep onderzoekt medicijnen en voertuigen voor medicijnafgifte voor de behandeling van aandoeningen van het binnenoor, zoals gehoorverlies. Het ronde raammembraan is de kritische barrière die voorkomt dat lokaal aangebrachte medicijnen in het slakkenhuis terechtkomen en we werken er momenteel aan om te begrijpen hoe voertuigen voor de levering van nanodeeltjes kunnen worden ontworpen om door deze barrière te gaan. Begrijpen hoe het ronde venstermembraan werkt in termen van medicijntransport is cruciaal voor het ontwikkelen van effectieve strategieën voor medicijnafgifte aan het oor.Cavia is een belangrijk preklinisch diermodel voor het bestuderen van medicijnafgifte aan het oor. Het isoleren van dit fragiele membraan, dat slechts 17 micron dik is, voor studies naar het transport van geneesmiddelen blijft echter een grote uitdaging. Hier beschrijven we een methode voor het extraheren van het ronde venstermembraan van de cavia dat efficiënte onderzoeken naar het transport van geneesmiddelen op de bank mogelijk maakt.Huidig onderzoek naar de toediening van geneesmiddelen aan het binnenste jaar is voornamelijk gebaseerd op in vivo experimentele modellen, gevolgd door perilymfebemonstering, die geen specifieke en gerichte studie van transportmechanismen voor ronde venstermembranen mogelijk maken. In deze studie demonstreren we de extractie van het ronde venstermembraan van de cavia met omringende benige ondersteuning. Deze methode behoudt de integriteit van de oorspronkelijke weefselarchitectuur en maakt nauwkeurige en gerichte studies mogelijk van de toediening van geneesmiddelen over het ronde venstermembraan.

guinea-pig-round-window-membrane-explantation-for-ex-vivo-studies

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video laat zien hoe operatief de cavia's endolymfatische kanaal belemmeren om endolymfatische hydrops te produceren.

Chirurgische Inductie van endolymphatic hydrops door Vernietiging van de endolymfatische Duct

In this video we describe a technique to isolate iris and retinal pigment epithelial cells from porcine eyes to obtain their primary cultures for in vivo and ex vivo studies. These pigment cells could be genetically modified to study regenerative approaches to treat ocular disorders.

Isolation of IPE and RPE cells: A Technique to Obtain Pigmented Epithelial Cells from Isolated Porcine Eye

In this video, we describe a surgical procedure to extract bronchiolar tissues from harvested pig lung. The ex vivo bronchiolar tissue could be used to develop infection models for studying chronic lung infections.

Pig Bronchiolar Tissue Extraction: A Procedure to Dissect Bronchiolar Tissue Sections From Porcine Lungs

Hier presenteren we een protocol voor de inductie van links ventriculaire cryoinjury gevolgd door de inplanting van een patch van de hartspier, afgeleid van menselijke iPS-cel cardiomyocytes in een cavia-model.

Implantatie van hiPSC afkomstige hartspier Patches na myocardiale letsel in een cavia-Model

Dit artikel toont een extradurale benadering aan om de cavia endolymphatische zak uit te wissen en het endolymphatische kanaal te verwonden met een fijne pick om experimentele endolymphatische hydrops te induceren.

Een herziene chirurgische aanpak om endolymphatische hydrops in het cavia te induceren

Hier wordt een protocol gepresenteerd om primaire iris- en retinale pigmentepitheelcellen van verschillende zoogdieren (muizen, ratten, konijnen, varkens en runderen) te isoleren en te transfecteren. De methode is bij uitstek geschikt om oculaire gentherapiebenaderingen te bestuderen in verschillende opstellingen voor ex vivo analyses en in vivo studies die overdraagbaar zijn op mensen.

Isolatie, kweek en genetische manipulatie van primaire pigmentepitheelcellen van zoogdieren voor niet-virale gentherapie

De subretinale implantatie van retinaal gepigmenteerd epitheel (RPE) is een van de meest veelbelovende benaderingen voor de behandeling van degeneratieve retinale ziekten. De uitvoering van preklinische studies op diermodellen met grote ogen blijft echter een uitdaging. Dit rapport presenteert richtlijnen voor de subretinale transplantatie van RPE op een celdrager in minivarkens.

Subretinale implantatie van RPE op een drager in minivarkens: richtlijnen voor preoperatieve preparaten, chirurgische technieken en postoperatieve zorg

Glomerulaire filtratiesnelheid (GFR) is de ideale marker voor het beoordelen van de nierfunctie. De standaard meetmethode met inuline-injectie met seriële bloed- en urineanalyse is echter onpraktisch. Dit artikel schetst een praktische methode om GFR transdermaal te meten bij biggen.

Transdermale meting van glomerulaire filtratiesnelheid in mechanisch geventileerde biggen

We beschrijven een eenvoudige en efficiënte methode voor het isoleren van cellen van het retinale pigmentepitheel (RPE) cellen uit de ogen van jonge gepigmenteerde cavia's. Deze procedure maakt follow-up moleculair biologisch onderzoek naar de geïsoleerde RPE mogelijk, inclusief genexpressieanalyses.

Isolatie van retinale pigmentepitheelcellen uit caviaogen

Deze studie presenteert een schaalbare, betrouwbare en reproduceerbare methode voor herhaalde chronische corticale opnames in een varkensmodel. De methode heeft toepassingen in verschillende gebieden van de neurowetenschappen, waaronder pijnonderzoek en diagnostiek van neurologische aandoeningen.

Chronische craniale venstertechniek voor herhaalde corticale opnames tijdens anesthesie bij varkens

Hier bieden we een gedetailleerde methodologie voor het isoleren van het netvlies van het oog van de muis voor uitgebreide ex vivo experimenten. Dit protocol benadrukt het toegankelijk maken van deze technisch veeleisende benadering voor onderzoekers die willen profiteren van de onderzoeksmogelijkheden die worden geboden door retinale glia in situ te houden in levend weefsel.

Een ex vivo explantatiemodel voor het bestuderen van gliale interacties in het netvlies van de muis

Leer membraanexplantatie van het ronde venster bij cavia's voor ex vivo-onderzoek naar geneesmiddeltransport in het binnenoor. Deze methode behoudt de weefselintegriteit en ondersteunt gerichte studies naar behandelstrategieën voor gehoorverlies.

Membraanexplantatie van cavia's met rond venster voor ex vivo-onderzoek

Meer video's verkennen