Ontwikkeling van multiplex real-time RT-qPCR-assays voor de detectie van SARS-CoV-2, influenza A/B en MERS-CoV
10 november 2023
We presenteren twee op sondes gebaseerde in-house eenstaps RT-qPCR-kits voor veel voorkomende respiratoire virussen. De eerste test is voor SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 en H3N2) en Influenza B. De tweede is voor SARS-Cov-2 (N) en MERS (UpE en ORF1a). Deze testen kunnen met succes worden geïmplementeerd in elk gespecialiseerd laboratorium.
Het algemene doel van deze test is het beheren van een multiplexbenadering voor de gelijktijdige detectie van vaak circulerende respiratoire virussen zoals SARS-CoV-2, MERS, influenza A en influenza B. De heersende technologieën die de vooruitgang in ons vakgebied stimuleren, zijn onder meer CRISPR, laterale flow-aminotesten, op papier gebaseerde biomoleculaire sensoren, Sherlock-testen in één pot, DNA-aptameren en multiplex RT-qPCR geïntegreerd met lus-gemedieerde isotherme amplificatie, LAMP. Multiplex RT-qPCR is echter de meest gevoelige, meest voorkomende en is de gouden standaard voor het diagnosticeren van verschillende virussen. De huidige experimentele uitdaging is het opstellen van een protocol dat kan worden gebruikt om RNA-kopieën van slechts 10 kopieën te detecteren.
We gebruikten een interne RT-qPCR-kit voor de test, wat tijd- en kostenbesparend is. Bereid om te beginnen de 2x buffer voor RT-qPCR voor in DNAs/RNA's-vrij water Bewaar de buffer bij min 20 graden Celsius tot verder gebruik. Meng vervolgens de primers en de sondes in een tube van 1,5 milliliter.
Vul het volume aan met elutiebuffer en bewaar de tube vervolgens bij min 20 graden Celsius. Bereid een enzymenmix met taq-polymerase en MMLV-RT in een tube van 1,5 milliliter op ijs. Vul het volume aan met de opslagbuffer van taq-polymerase.
Resuspendeer nu de virale synthetische RNA's in afzonderlijke buisjes met 100 microliter Tris-EDTA-buffer om voorraden van 10 tot de zesde RNA-kopieën per microliter te maken. Om de virusvoorraden te mengen, voegt u vijf microliter SARS-CoV-2, influenza A en B toe aan 50 microliter Tris-EDTA-buffer. Meng op dezelfde manier SARS-CoV-2 en MERS-CoV om een tweede virale mix te verkrijgen.
Verdun beide mengsels tienvoudig om een uiteindelijke verdunning van 10 RNA-kopieën per microliter te verkrijgen. Pipetteer in elk putje van een plaat met 96 putjes 2x buffer, primer, enzym, DNAs/RNA's-vrij water en de bijbehorende RNA-mengsels. Sluit de plaat af met een zelfklevende plaatafdichting.
Centrifugeer vervolgens de plaat gedurende een minuut om de vloeistof op de bodem van de put op te vangen. Programmeer vervolgens de PCR-machine om het snelle bloktype met 96 putjes te accepteren, waarbij het experimentele type is ingesteld op de standaardcurve. Stel de reagentia in op TaqMan-reagentia en selecteer de eigenschappen van de standaarduitvoering.
Definieer de gendoelen en de reporterkleurstof. Definieer vervolgens de monsternamen voor elke te testen reactie en wijs doelen en monsters toe aan de plaatlay-out. Voer nu het cyclusprogramma in het instrument in.
Breng de plaat in de juiste richting over naar de real-time QPCR-machine en druk op run om de cyclus te starten. Kies de bestandslocatie om de experimentele gegevens op te slaan. Onderzoek vervolgens de versterkingsplots die door het QPCR-programma worden geleverd.
De twee ontwikkelde kits waren in staat om alle drie de doelgenen met succes tegelijkertijd te amplificeren, met slechts 10 RNA-kopieën per reactie. De amplificatie-efficiëntie voor alle virale titraties was meer dan 99%
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert de ontwikkeling van twee probe-gebaseerde one-step RT-qPCR-kits, ontworpen voor de simultane detectie van veelvoorkomende respiratoire virussen, waaronder SARS-CoV-2, MERS en diverse stammen van Influenza. Deze kits verbeteren de diagnostische mogelijkheden van gespecialiseerde laboratoria door middel van een kosteneffectieve en tijdsefficiënte aanpak.
Belangrijke componenten van de studie
Onderzoeksgebied
- Detectie van respiratoire virussen
- RT-qPCR-techniek
- Ontwikkeling van multiplex-assays
Achtergrond
- De noodzaak van een snelle en sensitieve diagnose van respiratoire virussen.
- De beperkingen van huidige detectietechnologieën.
- Het belang van een multiplex-benadering voor simultane detectie.
Gebruikte methoden
- In-house ontwikkelde RT-qPCR-kits
- Detectie van viraal RNA
- Multiplex RT-qPCR gecombineerd met specifieke probes
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle detectie van SARS-CoV-2 en MERS samen met Influenza A en B.
- Amplificatie bereikt bij RNA-kopieën tot wel 10 per reactie.
- Hoge amplificatie-efficiënties van boven de 99% aangetoond voor doelgenen.
Conclusies
- De ontwikkelde RT-qPCR-kits zijn effectief voor de multiplexdetectie van respiratoire virussen.
- Deze studie draagt bij aan betere diagnostische strategieën in virologisch onderzoek.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Multiplex real-time RT-qPCR-assays voor SARS-CoV-2, Influenza A/B en MERS-CoV voorzien in de dringende behoefte aan een snelle, gevoelige en specifieke detectie van co-circulerende respiratoire virussen in fundamenteel en translationeel onderzoek. Deze assays maken een betrouwbare differentiatie van virale targets mogelijk, wat een robuuste targetvalidatie ondersteunt en ambiguïteit bij de vroegtijdige ontwikkeling van diagnostica vermindert. De integratie ervan verhoogt het voorspellend vertrouwen en de operationele efficiëntie binnen R&D-portfolio's die gericht zijn op infectieziekten.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt nauwkeurige analyse van virale targets mogelijk voor functionele validatie in modellen voor respiratoire aandoeningen.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door nauw verwante virale pathogenen in complexe monsters te onderscheiden.
- Vergemakkelijkt voorspellende betrouwbaarheid bij de selectie en triage van targets voor diagnostische en therapeutische programma's.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde multiplex-assay-systemen voor voor downstream screening van antivirale verbindingen of diagnostiek.
- Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare en kwantitatieve resultaten voor assay-benchmarking en optimalisatie.
- Maakt schaalbare, high-throughput screening mogelijk voor de snelle evaluatie van kandidaat-interventies.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij translationele biomarkerstrategieën door gelijktijdige detectie van meerdere respiratoire virussen mogelijk te maken.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door robuuste, kwantitatieve virale detectie te bieden.
- Vermindert het risico bij het verder ontwikkelen van kandidaten door nauwkeurige identificatie van pathogenen in ziekterelevante systemen te waarborgen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Multiplex RT-qPCR-assays passen binnen het continuüm van ontdekking tot preklinische fase en ondersteunen vroege hypothese-testen, assay-ontwikkeling en translationeel onderzoek voor portfolio's van infectieziekten.
- Discovery Biology: Biedt hooggevoelige detectie voor hypothesegestuurde validatie van virale targets.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor assay-standaardisatie en evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Levert robuuste amplificatiegegevens en specificiteitsmetrieken voor vergelijkende analyse.
- Translationeel Onderzoek: Maakt biomarker-afstemming en continuïteit over verschillende onderzoeksfasen mogelijk.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar, aanpasbaar platform voor multiplex virale detectie in diverse R&D-omgevingen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij virale detectie.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van diagnostische workflows.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming en kapitaalefficiëntie door vroege, nauwkeurige differentiatie van pathogenen mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en voortgang van programma's voor infectieziekten.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in moleculaire virologie en het ontwerp van kwantitatieve PCR-assays.
- Toegang tot real-time PCR-instrumentatie en analytische software-infrastructuur is noodzakelijk.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor de assay-opzet, data-interpretatie en kwaliteitscontrole.
- Aanpassing voor verschillende monstertypes of opkomende virale varianten kan vereist zijn.
- De prestaties zijn afhankelijk van de specificiteit van de primer/probe en de RNA-kwaliteit zoals ondersteund door de bron.
