Het bestuderen van celdoodinitiatie met behulp van een digitale microscoop
10 november 2023
Hier presenteren we een protocol voor het bestuderen van de snelheid van geprogrammeerde celdoodinitiatie door continu geïnoculeerde bladeren in beeld te brengen na celdoodinductie.
Breng om te beginnen de met virus geïnfecteerde aardappelplanten over naar een groeikamer die op 22 graden Celsius wordt gehouden. Kies een plant om te observeren en gebruik plakband om het tweede geënte blad volledig te immobiliseren. Sluit vervolgens de digitale microscoop aan op de computer en start de software voor het vastleggen van afbeeldingen.
Leg het blad onder de microscoop. Gebruik vervolgens de draaiknop om scherp te stellen op het oppervlak van het blad. Om de camera-instellingen aan te passen, klikt u op de instellingenknop.
Stel nu de helderheid in op 64, het contrast op 14 en de tint op nul. Pas vervolgens de witbalans aan en stel vervolgens de verzadiging in op 47, de scherpte op nul en het gamma op vijf. Klik op het pictogram voor het vastleggen van afbeeldingen en selecteer de optie time-lapsed video.
Stel vervolgens de beeldopname in voor elke 15 minuten gedurende in totaal 24 uur. Druk op de startknop om de beeldopname te starten. Om de vastgelegde beelden op te slaan, selecteert u alle beelden en klikt u op het pictogram Opslaan.
Kies nu de exportopties en stel vervolgens dots per inch in op maximaal. Eenmaal opgeslagen, verwijdert u alle afbeeldingen uit het programma. Om de afbeeldingen te bewerken, start u bewerkingssoftware zoals ImageJ.
Klik op bestand, selecteer vervolgens importeren en kies afbeeldingsreeks om de tijdreeksen van afbeeldingen uit één gezichtsveld te importeren. Plak het pad van de map met opgeslagen foto's en druk op OK. Zodra de conversie is voltooid, start ImageJ automatisch een interne videospeler die de voltooide video weergeeft.
Klik op bestand, vervolgens opslaan als en selecteer het AVI-formaat om het videobestand te exporteren. Wanneer een klein venster wordt geopend, stelt u de framesnelheid in op 0.3 FPS en drukt u vervolgens op OK om de video op te slaan als een AVI-bestand. Drie tot vier weken oude geënte aardappelplanten met ten minste drie tot vier volledig ontwikkelde bladeren werden gebruikt voor digitale microscopische analyse.
Hetzelfde gebied op het geïnoculeerde blad werd met tussenpozen van 15 minuten waargenomen om het optreden en de uitbreiding van de laesie in de loop van de tijd te bepalen. Na 14 uur observatie was er geen laesie zichtbaar. Ongeveer 90 minuten later werd een zichtbare laesie geregistreerd.
De laesie begon twee uur later uit te zetten en bleef zich de volgende acht en een half uur uitbreiden.
Overzicht
Deze studie onderzoekt de snelheid van de initiatie van geprogrammeerde celdood in aardappelplanten door middel van een continu beeldvormingsprotocol om geïnoculeerde bladeren te observeren. De methode maakt een nauwkeurige timing van littekenvorming mogelijk, wat inzicht geeft in de dynamiek van de hypersensitieve respons bij covert resistance.
Belangrijkste componenten van de studie
Onderzoeksgebied
- Initiatie van celdood
- Hypersensitieve respons
- Plantbiologie
Achtergrond
- Geprogrammeerde celdood is een essentieel afweermechanisme in planten.
- De studie maakt gebruik van aardappelplanten als modelsysteem.
- Het vaststellen van het tijdstip van celdood kan het begrip van plantimmuniteit verbeteren.
Gebruikte methoden
- Continue beeldvorming van geïnoculeerde bladeren
- Gebruik van aardappelplanten als biologisch model
- Microscopische analyse voor real-time observatie van laesieontwikkeling
Belangrijkste resultaten
- Laesies werden zichtbaar ongeveer 90 minuten na de initiële inoculatie.
- De uitbreiding van de laesies werd gevolgd over een periode van 8,5 uur.
- De methode maakt high-resolution time-lapse-registratie van de ziekteprogressie mogelijk.
Conclusies
- Dit protocol kwantificeert op effectieve wijze de inductiesnelheid van celdood in aardappelplanten.
- Het biedt een waardevol instrument voor verder onderzoek naar plantafweer tegen pathogenen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Precieze kwantificering van de initiatie van celdood in plantensystemen maakt robuuste hypothesetesten mogelijk voor genetische en moleculaire determinanten van de hypersensitieve respons. Digitale microscopie met een hoge resolutie ondersteunt de voorspellende betrouwbaarheid bij het identificeren van componenten die geprogrammeerde celdood moduleren, wat een directe impact heeft op vroege ontdekking en target-validatie in de plantbiotechnologie. Deze mogelijkheid versterkt beslissingen over de portfolio door een snelle, reproduceerbare beoordeling van de functie van kandidaatgenen in ziekterelateerde systemen mogelijk te maken.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt onderzoek mogelijk naar genetische en moleculaire factoren die de initiatie van celdood beïnvloeden.
- Ondersteunt de functionele validatie van resistentiegenen en componenten van signaalpaden.
- Faciliteert mechanische risicoreductie door genperturbatie te koppelen aan fenotypische uitkomsten.
- Verbetert het voorspellend vertrouwen voor het verder ontwikkelen van kandidaat-targets in pijplijnen voor ziekteresistentie bij planten.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt gestandaardiseerde, kwantitatieve beelduitvoer voor assay-ontwikkeling.
- Maakt reproduceerbare meting van de initiatie- en expansiesnelheden van laesies mogelijk.
- Ondersteunt schaalbaarheid en hergebruik van het platform in verschillende pathosystemen met minimale protocolaanpassingen.
- Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening van verbindingen of genetische factoren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt fenotypische resultaten uit met ziekte-relevante mechanismen van geprogrammeerde celdood.
- Waarborgt continuïteit van genetische ontdekking tot preklinische validatie in plantmodellen.
- Ondersteunt de risico-gecorrigeerde voortgang van resistentiekenmerken of genbewerkingen in pijplijnen voor gewasverbetering.
- Biedt mechanisch inzicht voor de ontwikkeling van translationele biomarkers in onderzoek naar plantverdediging.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit digitale microscopieprotocol is geïntegreerd in het vroege continuüm van ontdekking tot validatie, waardoor snelle hypothesetoetsing en functionele beoordeling van kandidaatgenen of behandelingen in plantensystemen mogelijk wordt.
- Discovery Biology: Ondersteunt het testen van de nulhypothese voor genfunctie bij de initiatie van celsterfte.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve gegevens over de timing en expansie van laesies voor assay-gereedheid.
- Analytics: Biedt tijdopgeloste metingen om genetische of behandelcondities te vergelijken.
- Translational Research: Slaat een brug tussen discovery-bevindingen en preklinische validatie in ziekterelevante plantmodellen.
- Enterprise Reuse: Biedt een flexibele, kosteneffectieve imaging-workflow die aanpasbaar is aan meerdere pathosystemen.
Operationele en Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, schaalbare en reproduceerbare imaging-outputs.
- Strategische waarde: Maakt geïnformeerde go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiënte portfolio-uitbreiding mogelijk.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van genetische of moleculaire interventies in plant-R&D.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in plantenweefselkweek en het bedienen van digitale microscopie.
- Vereist toegang tot gecontroleerde groeikamers en infrastructuur voor time-lapse beeldvorming.
- Vereist cross-team standaardisatie van beeldvormingsintervallen en analyseparameters.
- Aanpasbaar aan verschillende plantensoorten en pathosystemen met kleine aanpassingen in het protocol.
- Afhankelijk van consistente omgevingsomstandigheden voor reproduceerbare resultaten.
