ABCG5/G8-kristallisatie in een lipidenbicelle-omgeving voor röntgenkristallografie
25 augustus 2023
Dit protocol beschrijft een opstelling voor de kristallisatie van de steroltransporter ABCG5/G8. ABCG5/G8 wordt gereconstitueerd tot bicelles voor kristallisatie met hangende druppels. Het protocol vereist geen gespecialiseerde materialen of substraten, waardoor het toegankelijk en gemakkelijk aan te passen is in elk laboratorium voor het bepalen van de eiwitstructuur door middel van röntgenkristallografie.
Hallo, mijn team bestudeert het type eiwitverlies dat zich uitstrekt over het celmembraan, en we kijken naar de relatie met de geneeskunde en biologie. In het bijzonder kijken we naar een bepaald eiwit dat ATP nodig zou hebben om zijn functie aan te sturen, en dan heet het, de naam ATP-bindende cassettetransporter. In het bijzonder kijken we naar hun fundamentele structuur-functierelatie, en gebruiken die vervolgens om veel chronische ziekten te begrijpen, met name hart- en vaatziekten.
Vanwege de complexiteit van het zuiveren van de membraaneiwitten en hun stabiliteit bij natuurlijke temperaturen, is het verkrijgen van 3D-eiwitkristallen de grootste uitdaging in het veld, en het beperkt ook de toepassingen voor het ontdekken van geneesmiddelen. Ons team heeft methoden ontwikkeld in cryo-EM en röntgenkristallografie voor de structurele studies van membraantransporteiwitten. En eerder loste ons lab ook de kristalstructuur op van het eerste menselijke ABCG5/G8 obligate heterodimeer, zowel in apo- als cholesterolgebonden toestanden.
Onze resultaten kunnen een doorbraak betekenen in de ontdekking van geneesmiddelen met kleine moleculen of de herbestemming van geneesmiddelen. Het verkrijgen van 3D-eiwitkristallen kan ook weekexperimenten mogelijk maken voor de cokristallisatie van eiwit- en ligandcomplexen. Ons laboratorium heeft als doel de moleculaire basis te bepalen van lipideherkenning en -translocatie door ATP-afhankelijke lipidetransporteiwitten.
En we streven er ook naar om nieuwe methoden in de ontwikkeling van geneesmiddelen te ontwikkelen voor het bestuderen van de moleculaire dynamica en structurele aspecten van ABC-transporters.
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het kristalliseren van de steroltransporter ABCG5/G8, waarbij bicellen worden gebruikt voor hanging-drop kristallisatie. De aanpak is ontworpen om eenvoudig en aanpasbaar te zijn voor diverse laboratoriumomgevingen, wat de bepaling van de proteïnestructuur via röntgendiffractie faciliteert.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Structurele Biologie
- Membraantransporteiwitten
Achtergrond
- ABCG5/G8 is een ATP-bindende cassette-transporter die betrokken is bij lipidentransport.
- Het begrijpen van de structuur ervan is cruciaal voor inzichten in chronische ziekten, in het bijzonder cardiovasculaire aandoeningen.
- Uitdagingen bij het zuiveren van membraaneiwitten belemmeren inspanningen voor geneesmiddelenontwikkeling.
- Eerdere studies hebben de kristalstructuur van ABCG5/G8 in verschillende toestanden opgehelderd.
Doel van de studie
- Om de structurele basis van lipide-herkenning en translocatie door ABC-transporters te onderzoeken.
- Om nieuwe methodologieën te ontwikkelen voor geneesmiddelenontdekking met betrekking tot membraantransporteiwitten.
- Om cocrystallisatie-experimenten mogelijk te maken voor het bestuderen van eiwit-ligandinteracties.
Gebruikte methoden
- Chemische modificatie van eiwitfracties via reductieve methylering.
- Gebruik van nikkel-NTA-kolommen voor eiwitzuivering.
- Bereiding van een B-cel-stockoplossing voor kristallisatie.
- Hanging drop-dampdiffusiemethode voor de opzet van de kristallisatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle kristallisatie van ABCG5/G8 werd waargenomen binnen één tot twee weken.
- Kristallen die geschikt waren voor dataverzameling hadden doorgaans afmetingen van 50 microns bij 100 microns bij 2 microns.
- De methodologie maakt verdere studies naar lipidinteracties en geneesmiddelenontwikkeling mogelijk.
- De resultaten dragen bij aan het begrip van de structuur-functierelatie van ABC-transporters.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van de ABCG5/G8-structuur.
- De bevindingen kunnen bijdragen aan vorderingen in de geneesmiddelenontwikkeling voor gerelateerde ziekten.
- Toekomstig werk zal zich richten op het onderzoeken van de dynamiek van lipidentransportmechanismen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
Hoge-resolutie structurele elucidatie van ABCG5/G8 in een lipidische bicelle-omgeving pakt een kritiek knelpunt aan in de geneesmiddelenontdekking voor membraaneiwitten. Deze aanpak vergroot het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie en ondersteunt mechanische risicobeperking voor transporter-gerichte portfolio's. Betrouwbare kristallisatie van ABC-transporters maakt structuurgebaseerd ligandontwerp mogelijk en versnelt besluitvorming in de vroege screeningsfase.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & target-validatie
- Maakt onderzoek naar ATP-afhankelijke lipidentransportmechanismen op atomaire resolutie mogelijk.
- Ondersteunt functionele validatie van targets door de natuurlijke eiwitconformatie in bicelle-omgevingen te behouden.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie voor transporttargets die betrokken zijn bij chronische ziekten.
- Biedt structurele sjablonen voor hypothese-gestuurde portfolio-triage.
Screening & Assayontwikkeling
- Levert gevalideerde proteïnekristallen die geschikt zijn voor ligand-soaking en co-kristallisatiestudies.
- Standaardiseert de preparatie van membraanproteïnen voor reproduceerbare downstream screening-workflows.
- Maakt kwantitatieve beoordeling van proteïne-ligandinteracties mogelijk via röntgendiffractie.
- Ondersteunt schaalbare assay-ontwikkeling voor verbindingenbibliotheken gericht op transporters.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Stemt structurele inzichten af op ziekterelevante transporterfuncties in cardiovasculair onderzoek.
- Zorgt voor continuïteit van moleculaire ontdekking tot preklinische validatie van transportermodulatoren.
- Vermindert het translationele risico door biomarker- en mechanistische studies te informeren.
- Maakt rationeel ontwerp van preklinische modellen mogelijk op basis van structuur-functie-relaties van transporters.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze op bicellen gebaseerde kristallisatiemethode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie tot lead-identificatie en preklinisch onderzoek.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden voor de functie van ABC-transporters.
- Screening: Levert reproduceerbare, hoogwaardige kristallen voor screenings op basis van structuur en ligandevaluatie.
- Analytics: Maakt kwantitatieve structurele uitlezingen mogelijk om ligand-gebonden en apo-toestanden te vergelijken.
- Translationeel Onderzoek: Slaat een brug tussen moleculaire structuur en ziekte-relevante transporteractiviteit en biomarker-afstemming.
- Bedrijfsmatige Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor het kristalliseren van diverse membraaneiwitten in drug discovery-pipelines.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van transporter-targets.
- Operationele waarde: Standaardiseert de kristallisatie van membraaneiwitten voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en verbetert de kapitaalefficiëntie in programma's die gericht zijn op transporters.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van transporter-targets en de verdere ontwikkeling van structureel geleide assets mogelijk.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in zuiveringstechnieken voor membraaneiwitten en kristallisatietechnieken.
- Vereist toegang tot analytische infrastructuur voor röntgendiffractie en eiwitkarakterisering.
- Maakt standaardisatie van bicelle-preparatie en kristallisatieprotocollen tussen teams noodzakelijk.
- Aanpassing kan nodig zijn voor verschillende transporterfamilies of lipidensamenstellingen.
- Eiwitstabiliteit en opbrengst kunnen de doorvoer en schaalbaarheid in sommige systemen beperken.
