Chemische affiniteit-gebaseerde isolatie van extracellulaire blaasjes uit biovloeistoffen voor proteomics en fosfoproteomics-analyse
27 oktober 2023
Dit protocol biedt gedetailleerde beschrijvingen voor de efficiënte isolatie van extracellulaire blaasjes in de urine met behulp van gefunctionaliseerde magnetische kralen. Bovendien omvat het latere analyses, waaronder western blotting, proteomics en phosphoproteomics.
We werken aan de ontdekking van extracellulaire biomarkers op basis van blaasjes. Een belangrijke stap is om ze efficiënt en selectief te isoleren. EVtrap, dat is gebaseerd op scheiding op basis van magnetische kralen, kan ons echt helpen door een hoge doorvoer te bieden, gemakkelijk te gebruiken, in het bijzonder gemakkelijk voor klinische toepassingen.
We hebben dit protocol gebruikt voor het ontdekken van eiwitten en de fosfoproteïne-biomarkers voor verschillende ziekten zoals borstkanker, nierkanker en de ziekte van Parkinson. Deze biomarker is afgeleid van biofluïdum. EV's kunnen mogelijk worden gebruikt voor vloeibare biopten, wat de klinische diagnose en de behandeling verder kan verbeteren.
Momenteel zijn ultracentrifugatie en precipitatie de meest gebruikte benadering voor extracellulaire blaasjesisolatie, maar die methoden zijn beperkt tot co-isolatie van verontreinigingen en ook een laag rendement. Onze EVtrap-methode zal dus een effectievere manier bieden om EV's te isoleren, wat een meer reproduceerbare en gevoelige methode mogelijk maakt en ook de stroomafwaartse analyse ten goede zal komen. We werken aan twee dingen.
Ten eerste gaan we door met het ontwikkelen van de methoden en protocollen voor EV-isolatie en een stroomafwaartse analyse, in het bijzonder een analyse op basis van massale back-up. Ten tweede onderzoeken we verschillende toepassingen op klinisch gebied vanwege het voordeel van de EVtrap.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de efficiënte isolatie van urinaire extracellulaire blaasjes (EV's) met behulp van gefunctionaliseerde magnetische beads. Daarnaast worden vervolganalyses gedetailleerd, zoals western blotting, proteomics en fosfoproteomics, die essentieel zijn voor de ontdekking van biomarkers.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Biomarker-ontdekking
- Extracellulaire vesikels
Achtergrond
- Extracellulaire blaasjes zijn belangrijk voor vloeibare biopsieën.
- Ze kunnen inzicht bieden in diverse ziekten.
- Efficiënte isolatie is cruciaal voor klinische toepassingen.
- Eiwitten en fosfo-eiwitten uit biofluïda zijn potentiële biomarkers.
Doel van de studie
- Om de ontdekking van biomarkers te versnellen.
- Om EV's efficiënt en selectief te isoleren.
- Om de klinische diagnose en behandeling te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Isolatie van urinaire extracellulaire blaasjes met behulp van magnetische kraaltjes.
- Western blotting voor eiwitanalyse.
- Proteomics en fosfoproteomics voor biomarkeridentificatie.
- High-throughput methoden voor klinische toepassingen.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle isolatie van EV's uit biofluïda.
- Identificatie van eiwitten en fosfoproteïnen die gekoppeld zijn aan ziekten.
- Aangetoond potentieel voor toepassingen in vloeibare biopsieën.
- Facilitering van de ontdekking van biomarkers voor kanker en de ziekte van Parkinson.
Conclusies
- Het protocol verhoogt de efficiëntie van de EV-isolatie.
- Het ondersteunt de ontdekking van klinisch relevante biomarkers.
- Potentieel om diagnostische en therapeutische strategieën te verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Efficiënte en selectieve isolatie van extracellulaire vesikels (EV's) uit biofluïda is een kritiek omslagpunt voor proteomics-gestuurde biomarker-ontdekking in biofarmaceutische R&D. Dit protocol met magnetische beads op basis van chemische affiniteit maakt een reproduceerbare EV-isolatie met een hoog rendement mogelijk, wat direct bijdraagt aan kwantitatieve proteomische en fosfoproteomische analyses die essentieel zijn voor vroege ziektedetectie en targetvalidatie. De methode vergroot het voorspellend vertrouwen in translationele biomarker-pipelines en ondersteunt de risico-gecorrigeerde voortgang van het portfolio.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt robuuste analyse van ziekterelateerde eiwit- en fosfoproteïnesignaturen uit patiëntafgeleide biofluïda mogelijk.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door hoogwaardige EV-cargo te leveren voor downstream mechanistische studies.
- Faciliteert biologische risicoreductie door middel van reproduceerbare en kwantitatieve moleculaire profilering.
Screening & assayontwikkeling
- Levert gestandaardiseerde, hoogzuivere EV-preparaten die geschikt zijn voor kwantitatieve massaspectrometrie-workflows.
- Verbetert de reproduceerbaarheid en gevoeligheid van de assay door contaminanten te minimaliseren en de EV-opbrengst te maximaliseren.
- Maakt schaalbare preparatie van EV-monsters mogelijk voor high-throughput screening en hergebruik van het platform.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij translationele biomarkerstrategieën door realtime moleculaire momentopnamen uit klinische biofluïda vast te leggen.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door consistente analyse van het EV-proteoom en fosfoproteoom mogelijk te maken.
- Zorgt voor mechanische risicoreductie voor kandidaat-biomarkers voorafgaand aan de klinische ontwikkeling.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol voor de isolatie van EV's bevindt zich op het snijvlak van vroege ontdekking en translationeel onderzoek en slaat een brug tussen monsterpreparatie en kwantitatieve proteomics- en fosfoproteomics-analyse.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door toegang te bieden tot moleculaire cargo afgeleid van EV's.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve EV-monsters voor downstream assay-ontwikkeling en evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Ondersteunt high-throughput, statistisch robuuste meting van de abundantie van eiwitten en fosfoproteïnen over verschillende condities.
- Translationeel Onderzoek: Maakt biomarker-afstemming en continuïteit mogelijk van patiëntmonsters naar preklinische modellen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een gestandaardiseerde, schaalbare EV-isolatiecapaciteit voor diverse R&D-programma's.
Operationele & Zakelijke Impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de ontdekking van biomarkers.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare en schaalbare EV-isolatie voor proteomics-workflows.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen en de kapitaalefficiëntie door robuuste moleculaire profilering mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van biomarker- en therapeutische kandidaten.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in proteomics, phosphoproteomics en EV-biologie voor een optimale uitvoering en data-interpretatie.
- Vereist toegang tot scheidingssystemen op basis van magnetische beads en massaspectrometrieplatforms met een hoge resolutie.
- Noodzaakt tot standaardisatie van monsterbehandeling en analytische protocollen tussen teams voor reproduceerbaarheid.
- Aanpasbaar aan verschillende typen biofluïda, maar kan optimalisatie vereisen voor verschillende matrices.
- Kwantitatieve reproduceerbaarheid en sensitiviteit zijn afhankelijk van strikte naleving van het protocol en analytische kalibratie.
Veelgestelde vragen over biofarmaceutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:47
Extracellular Vesicle (EV) Isolation from Human Urine Samples Using the EVtrap Approach
3:39
Preparation of Dried Extracellular Vesicle (EV) Sample for Proteomics and Phosphoproteomics Analysis
6:31
Proteome/Phosphoproteome Analysis of the Extracellular Vesicle (EV) Samples Using LC‐MS/MS
