Name: Visualisatie van monocarboxylaten en andere relevante metabolieten in het ex vivo Drosophila-larvale brein met behulp van genetisch gecodeerde sensoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Ontdek hoe je metaboliettransport visualiseert in Drosophila-larvenhersenen met FRET-sensoren. Deze methode onthult energiedynamiek in neuronen en gliacellen voor neurowetenschappelijk onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken alle leden van het Sierralta Lab. Dit werk werd ondersteund door FONDECYT-Iniciación 11200477 (naar AGG) en FONDECYT Regular 1210586 (naar JS). UAS-FLII12Pglu700μδ6 (glucosesensor) werd vriendelijk geschonken door Pierre-Yves Plaçais en Thomas Preat, CNRS-Parijs.

1. Behoud van vliegenstam en larvale synchronisatie
<ol><li>Om deze experimenten uit te voeren, gebruikt u vliegenculturen die bij 25 °C zijn gekweekt op standaard Drosophila-voedsel dat bestaat uit 10% gist, 8% glucose, 5% tarwebloem, 1,1% agar, 0,6% propionzuur en 1,5% methylparabenen.</li>
	<li>Gebruik de volgende lijnen om dit protocol te volgen: w1118 (experimentele controleachtergrond), OK6-GAL4 (driver voor motorneuronen), repo-GAL4 (driver voor alle gliacellen), CG-GAL4 (driver voor vetlichamen), UAS-Pyronic (pyruvaatsensor), UAS-FLII12Pglu700μδ6 (glucosesensor), UAS-Laconic (lactaatsensor), UAS-GCaMP6f (calciumsensor), UAS-AT1.03NL (ATP-sensor) en UAS-Chk RNAi GD1829. Alle lijnen die sensoren of RNAi tot expressie brengen, bevinden zich in de w1118 genetische achtergrond.</li>
	<li>Om gesynchroniseerde zwervende larven van de derde instar te verkrijgen, plaatst u 300 vliegen (3-5 dagen oud, 100 mannetjes, 200 maagdelijke vrouwtjes) van het gewenste genetische kruis in de legkamer, die een petrischaal van 60 mm bevat bedekt met 1% agarose in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Plaats een druppel vloeibare/romige gist (1,5 cm diameter) in het midden van de plaque om vliegen aan te moedigen eieren te leggen (Figuur 1).</li>
	<li>Houd de vliegen 3 dagen op 25 °C en vervang de agarose petrischaal tweemaal daags door een verse en vers opgeloste gist.</li>
	<li>Laat de vliegen op de vierde dag 4 uur eieren leggen voordat u de petrischaal vervangt. Verwijder deze tandplak. Laat de vliegen vervolgens gedurende 3 uur eieren leggen in een nieuwe agaroseplaquette met vers opgeloste gist. Gebruik deze larven in de experimenten.</li>
	<li>Verwijder na 3 uur de plaque met de eieren en plaats deze gedurende 24 uur in een broedmachine van 25 °C.</li>
	<li>Verzamel 50 tot 100 pas uitgekomen larven van deze plaque (0 uur na het uitkomen van de larven) en plaats ze in een plastic flacon met standaardvoer. Om de larven goed te laten eten, moet u ervoor zorgen dat het voedsel gemalen en zacht is. Gebruik de larven 96 uur na de overdracht.</li>
</ol>2. Maak de glazen dekglaasjes met poly-L-lysine
<ol><li>Voer deze stap 1 uur voor de larvale dissectie uit. Plaats in een celkweekplaat met 6 putjes glazen dekglaasjes van 25 mm (de diameter van de te gebruiken deksels is afhankelijk van de opnamekamer die in de microscoop beschikbaar is).</li>
	<li>Plaats een druppel (300 μL) poly-L-lysine in het midden van elk dekglaasje gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Was elk dekglaasje 3x met gedestilleerd water en vervolgens 2x met een zoutoplossing zonder Ca2+ (dezelfde oplossing die wordt gebruikt om de larven te ontleden, zie stap 3.2). Installeer de deksels in de opnamekamer en vul deze met Ca2+-vrije zoutoplossing. OPMERKING: Hoewel de hersenen van de larven zich rechtstreeks aan de glazen dekglaasjes kunnen hechten, is de hechting zwak en bewegen of verplaatsen de hersenen af en toe tijdens het experiment vanwege de continue stroom van zoutoplossing. De toevoeging van de poly-L-lysinestap vermindert het risico op bewegingen of zelfs hersenverlies als gevolg van de wasbeurten.</li>
</ol>3. Ontleed het ventrale zenuwkoord (VNC) en de vetlichamen (FB's)
<ol><li>Verzamel de zwervende larven van de derde instar uit de gewenste genetische kruising (uit stap 1.7) en was ze 3x grondig met gedestilleerd water.</li>
	<li>Plaats de larven in een glazen dissectieschaal met 750 μL nominaal nul Ca2+ ijskoude zoutoplossing bestaande uit 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 4 mM MgCl2, 5 mM trehalose, 5 mM HEPES en 35 mM sucrose (pH = 6,7, gemeten met een pH-meter en aangepast met 1 M NaOH en HCl 37% v/v). OPMERKING: Het instellen van de pH op 6.7 is van cruciaal belang omdat, zoals eerder opgemerkt, het transport van monocarboxylaat sterk afhankelijk is van de pH van de oplossing. Bovendien komt 6,7 overeen met de pH in de hemolymfe van een derde instar-larve17,18.</li>
	<li>Plaats de larve onder een stereomicroscoop en maak met een tang een dwarse snede over de achterkant van het achterlijf.</li>
	<li>Duw met de pincet tegen de kaak terwijl je de larven binnenstebuiten keert.</li>
	<li>Observeer het ventrale zenuwkoord (VNC) naast de kaak. Verwijder voorzichtig de denkbeeldige schijven en de resterende hersen-caudale weefsels.</li>
	<li>Scheid de VNC met de centrale hersenen en oogkwabben van de rest van het weefsel door de zenuwen door te snijden. Breng de VNC over, pak het met een pincet op van de resterende zenuwen en plaats het in de opnamekamer met de Ca2+-vrije opnameoplossing (dezelfde oplossing uit stap 3.2). De VNC's hechten zich onmiddellijk aan de dekglaasjes.</li>
	<li>Om interferentie van de resterende zenuwen te voorkomen, bevestigt u ze met een pincet aan de onderkant van het dekglaasje (de zenuwen zullen ook fluorescerend zijn, afhankelijk van de gebruikte aandrijflijn) (Figuur 2).</li>
	<li>Om experimenten uit te voeren in vetlichamen (FB's) die het transport van glucose of monocarboxylaat meten in een andere reeks experimenten, gaat u verder met het isoleren van de weefsels volgens de stappen 3.1-3.4. Zodra de larven binnenstebuiten zijn gekeerd, observeer dan dat de FB een wit, bilateraal, plat weefsel is.</li>
	<li>Plaats de geïsoleerde FB's die de FRET-sensoren tot expressie brengen (verkregen uit een genetische kruising met behulp van de juiste drivers) in de registratiekamer met de registratieoplossing zonder Ca2+. OPMERKING: De FB is zeer hydrofoob (het heeft de neiging om op het oppervlak van de oplossing te drijven) en uiterst kwetsbaar voor manipulatie met een pincet, het moet met zorg worden behandeld. Elke ruwe behandeling van dit weefsel zal later resulteren in dode cellen (met een verminderde fluorescentie van de sensoren).</li>
	<li>Plaats de opnamekamer met VNC's/FB's op de microscooptafel.</li>
</ol>4. Beeldvorming van levende cellen
<ol><li>Om beelden te verkrijgen van de weefselexpressiesensoren, gebruikt u een rechtopstaande fluorescentiemicroscoop die is gekoppeld aan een emissiesplitsingssysteem en een CCD-camera. Schakel het verlichtingssysteem van de microscoop 30 minuten voor aanvang van een experiment in. OPMERKING: Hier gebruiken we een Spinning Disk-fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een 20x/0.5 wateronderdompelingsobjectief om zowel VNC's als FB's te observeren. Figuur 2 toont ook het gebruik van een 40x/0.8 wateronderdompelingsobjectief.</li>
	<li>Om GCaMP6f-fluorescentie te visualiseren, stelt u de excitatie - en emissiegolflengten in op respectievelijk 488 nm en 540 nm. Stel voor laconieke/pyronische/ATP/glucosesensoren de excitatiegolflengte in op 440 nm en de emissiegolflengten op 488 nm (mTFP, CFP) en 540 nm (Venus, YFP).</li>
	<li>Verkrijg elke 2 s afbeeldingen van 512 x 512 pixels voor GCaMP6f en elke 10-30 s voor laconieke/pyronische/ATP/glucosesensoren. Bepaal de optimale belichting tot de lichtbron en observeer de kwaliteit van het verkregen beeld. Om dit protocol te volgen, moet u ervoor zorgen dat de beelden een belichting van 300 ms hebben voor laconieke en pyronale sensoren en 100-150 ms voor de glucose- en ATP-sensoren. OPMERKING: De blootstelling kan variëren, afhankelijk van het gebruik van een confocale of normale fluorescentiemicroscoop.</li>
	<li>Zodra de opnamekamer in de tafel van de microscoop is geïnstalleerd, plaatst u het onderdompelingsobjectief in water voorzichtig en zorgt u ervoor dat het objectief tijdens het experiment ondergedompeld blijft. Houd de kamertemperatuur op 25 °C.</li>
	<li>Sluit de registratiekamer aan op een perfusiesysteem en houd de weefsels badend in de opnameoplossing die 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,5 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, 5 mM trehalose, 5 mM HEPES en 35 mM sucrose, pH 6,7 bevat (gemeten met een pH-meter en afgesteld met NaOH en HCl).</li>
	<li>Handhaaf een constante stroom van 3 ml/min opnameoplossing door het weefsel met behulp van de zwaartekracht, gekoppeld aan een peristaltische pomp met lage flux om de vloeistof uit de kamer te extraheren terwijl het volume constant blijft. Om de vereiste stroom te bereiken, plaatst u de oplossingshoudende buisjes (plastic buisjes van 50 ml) 25 cm boven de microscooptafel. OPMERKING: Deze door zwaartekracht aangedreven stroming wordt gebruikt om weefselbeweging veroorzaakt door peristaltische pompen te voorkomen, waardoor later een nauwkeurigere beeldanalyse mogelijk is.</li>
	<li>Laat de opnameoplossing vóór elke stimulatie 5-10 minuten stromen om een stabiele basislijn van fluorescentie van de sensoren te verkrijgen. Wijzig de duur indien nodig om deze basislijn te verkrijgen.</li>
	<li>Vervang de stromende oplossing gedurende 5 minuten door de stimulatieoplossing om de VNC/FB's te stimuleren (met glucose, pyruvaat of lactaat in de concentratie beschreven voor elk experiment opgelost in zoutoplossing; zie elke afbeelding). OPMERKING: De duur van de stimulatie kan worden gevarieerd afhankelijk van de behoeften van het experiment (glucosepulsen kunnen bijvoorbeeld worden verhoogd tot 10 minuten om een plateau in neuronen te bereiken, zoals eerder gemeld16).</li>
	<li>Om de osmolariteit in de stimulatieoplossing te behouden, corrigeert u de sucroseconcentratie (een koolhydraat dat niet kan worden gemetaboliseerd door de Drosophila-hersenen ) volgens de concentratie van het toegevoegde monocarboxylaat of glucose.</li>
	<li>Vervang de oplossingen met behulp van een eenvoudig systeem van kleppen. Pas op dat u de microscooptafel niet verplaatst.</li>
	<li>Stel de VNC bloot aan 80 μM picrotoxine (PTX, continu stromend) om neuronale activiteit te stimuleren. Deze procedure verhoogt de frequentie van Ca2+ oscillaties, waardoor het mogelijk wordt om veranderingen in metabolisch relevante moleculen (bijv. intracellulair ATP) waar te nemen.</li>
	<li>Was aan het einde van elk experiment het volledige stroomsysteem, inclusief de buizen en de opnamekamer, grondig gedurende ten minste 10 minuten met de zoutoplossing en nog eens 10 minuten met gedestilleerd water om elk spoor van de gebruikte oplossingen te verwijderen.</li>
</ol>5. Beeldverwerking en data-analyse
<ol><li>Om de verkregen beelden te verwerken, gaat u verder met de stappen die worden weergegeven in afbeelding 3.</li>
	<li>Importeer de afbeelding (Laconic) in de ImageJ-software. De afbeelding heeft twee weergaven van het monster: de linker is het mTFP-signaal en de rechter is het Venus-signaal. Selecteer een gebied met de cellen die moeten worden geanalyseerd en scheid deze afbeeldingen (mTFP en Venus) in een nieuw venster. Zorg ervoor dat deze afbeeldingen exact hetzelfde gebied bevatten.</li>
	<li>Open de registratieplug-in en corrigeer de kleine drift van het weefsel die normaal wordt waargenomen in het experiment met het functiestijve lichaam. Voer dit uit in beide afbeeldingen (mTFP en Venus).</li>
	<li>Selecteer ten minste 10 interessegebieden (ROI's) in het cytosol van de corresponderende 10 cellen in het mTFP-signaal (488 nm) en breng de selecties over naar het Venusbeeld (540 nm).</li>
	<li>Selecteer twee of drie ROI's in de buurt van de cellen die worden geanalyseerd, maar zonder waarneembaar signaal (altijd binnen de VNC of het geanalyseerde weefsel, zie figuur 3). Dit zijn de ROI's op de achtergrond.</li>
	<li>Met de ROI's geselecteerd in beide afbeeldingen, verkrijgt u de gemiddelde grijswaarde van elk signaal met behulp van de functiemeting. Breng de gegevens over naar een gegevensblad en trek de gemiddelde achtergrondwaarde voor elk signaal af.</li>
	<li>Bepaal de mTFP-fluorescentieverhouding over Venus (voor laconiek en pyronic). Deze waarde wordt anders berekend dan de andere FRET-sensoren die hier worden beschreven (waar de verhouding meestal YFP/CFP is), omdat zowel Laconic als Pyronic hun FRET-efficiëntie verminderen wanneer ze aan hun respectievelijke substraten worden gebonden.</li>
	<li>Normaliseer de gegevens door elke geregistreerde waarde te delen door de basislijn. Bereken in een apart gegevensblad de basislijn door de gemiddelde waarde van de mTFP/Venus-ratio gedurende de 2 minuten voorafgaand aan de stimulus te nemen.</li>
	<li>Bereken voor de glucose- en ATP-metingen met behulp van FRET-gebaseerde sensoren de YFP/CFP-verhouding en normaliseer de gegevens zoals beschreven in stap 5.8.</li>
</ol>

Monitoring van het transport van hersenmetabolieten in Drosophila met behulp van FRET-sensoren

<ol><li>Vergara, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+energy+homeostasis+principle%3A+neuronal+energy+regulation+drives+local+network+dynamics+generating+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Computational+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The energy homeostasis principle: neuronal energy regulation drives local network dynamics generating behavior.</a> Frontiers in Computational Neuroscience. 13 (49), 1-18 (2019).</li>
<li>Pulido, C., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+pools+are+a+major+hidden+resting+metabolic+burden+of+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle pools are a major hidden resting metabolic burden of nerve terminals.</a> Science Advances. 7 (49), 1-9 (2021).</li>
<li>Benton, D., Parker, P. Y., Donohoe, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+supply+of+glucose+to+the+brain+and+cognitive+functioning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biosocial+Science%22%5BJournal%5D)">The supply of glucose to the brain and cognitive functioning.</a> Journal of Biosocial Science. 28 (4), 463-479 (1996).</li>
<li>Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar+for+the+brain%3A+the+role+of+glucose+in+physiological+and+pathological+brain+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function.</a> Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).</li>
<li>Boumezbeur, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+blood+lactate+to+brain+energy+metabolism+in+humans+measured+by+dynamic+13C+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The contribution of blood lactate to brain energy metabolism in humans measured by dynamic 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (42), 13983-13991 (2010).</li>
<li>Baltan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+lactate+serve+as+an+energy+substrate+for+axons+in+good+times+and+in+bad%2C+in+sickness+and+in+health%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Brain+Disease%22%5BJournal%5D)">Can lactate serve as an energy substrate for axons in good times and in bad, in sickness and in health.</a> Metabolic Brain Disease. 30 (1), 25-30 (2015).</li>
<li>Barros, L. F., Weber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CrossTalk+proposal%3A+an+important+astrocyte-to-neuron+lactate+shuttle+couples+neuronal+activity+to+glucose+utilization+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">CrossTalk proposal: an important astrocyte-to-neuron lactate shuttle couples neuronal activity to glucose utilization in the brain.</a> The Journal of Physiology. 596 (3), 347-350 (2018).</li>
<li>Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fueling+thought%3A+Management+of+glycolysis+and+oxidative+phosphorylation+in+neuronal+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fueling thought: Management of glycolysis and oxidative phosphorylation in neuronal metabolism.</a> The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2235-2246 (2018).</li>
<li>Koveal, D., Diaz-Garcia, C. M., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+biosensors+for+neuronal+metabolism+and+the+challenges+of+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent biosensors for neuronal metabolism and the challenges of quantitation.</a> Current Opinion in Neurobiology. 63, 111-121 (2020).</li>
<li>Imamura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+ATP+levels+inside+single+living+cells+with+fluorescence+resonance+energy+transfer-based+genetically+encoded+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15651-15656 (2009).</li>
<li>Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLUT1+and+GLUT9+as+major+contributors+to+glucose+influx+in+HepG2+cells+identified+by+a+high+sensitivity+intramolecular+FRET+glucose+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).</li>
<li>San Martin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+FRET+lactate+sensor+and+its+use+to+detect+the+Warburg+effect+in+single+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells.</a> PloS One. 8 (2), 1-13 (2013).</li>
<li>San Martin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mitochondrial+flux+in+single+cells+with+a+FRET+sensor+for+pyruvate%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Imaging mitochondrial flux in single cells with a FRET sensor for pyruvate.</a> PloS One. 9 (1), 1-9 (2014).</li>
<li>Placais, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulated+energy+metabolism+in+the+Drosophila+mushroom+body+is+the+trigger+for+long-term+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Upregulated energy metabolism in the Drosophila mushroom body is the trigger for long-term memory.</a> Nature Communications. 8, 1-14 (2017).</li>
<li>Mann, K., Deny, S., Ganguli, S., Clandinin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+activity%2C+metabolism+and+behaviour+across+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coupling of activity, metabolism and behaviour across the Drosophila brain.</a> Nature. 593 (7858), 244-248 (2021).</li>
<li>Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+using+a+FRET+glucose+sensor+reveals+glucose+delivery+to+all+cell+types+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain.</a> Journal of Insect Physiology. 106 (1), 55-64 (2018).</li>
<li>Gonzalez-Gutierrez, A., Ibacache, A., Esparza, A., Barros, L. F., Sierralta, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+lactate+levels+depend+on+glia-derived+lactate+during+high+brain+activity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Neuronal lactate levels depend on glia-derived lactate during high brain activity in Drosophila.</a> Glia. 68 (6), 1213-1227 (2020).</li>
<li>Geistlinger, K., Schmidt, J. D. R., Beitz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+monocarboxylate+transporters+accept+and+relay+protons+via+the+bound+substrate+for+selectivity+and+activity+at+physiological+pH%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+Nexus%22%5BJournal%5D)">Human monocarboxylate transporters accept and relay protons via the bound substrate for selectivity and activity at physiological pH.</a> PNAS Nexus. 2 (2), 1-8 (2023).</li>
<li>Pasco, M. Y., Leopold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sugar-induced+insulin+resistance+in+Drosophila+relies+on+the+lipocalin+Neural+Lazarillo%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">High sugar-induced insulin resistance in Drosophila relies on the lipocalin Neural Lazarillo.</a> PloS One. 7 (5), 1-8 (2012).</li>
<li>McMullen, E., Weiler, A., Becker, H. M., Schirmeier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+carbohydrate+transport+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Plasticity of carbohydrate transport at the blood-brain barrier.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 14, 1-15 (2020).</li>
<li>Delgado, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaski%2C+a+novel+Drosophila+lactate%2Fpyruvate+transporter+required+in+glia+cells+for+survival+under+nutritional+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Chaski, a novel Drosophila lactate/pyruvate transporter required in glia cells for survival under nutritional stress.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).</li>
<li>Stilwell, G. E., Saraswati, S., Littleton, J. T., Chouinard, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Drosophila+seizure+model+for+in+vivo+high-throughput+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development of a Drosophila seizure model for in vivo high-throughput drug screening.</a> European Journal of Neuroscience. 24 (8), 2211-2222 (2006).</li>
<li>Lerchundi, R., Huang, N., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+changes+in+astrocytic+and+neuronal+adenosine+triphosphate+using+two+different+variants+of+Ateam%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of changes in astrocytic and neuronal adenosine triphosphate using two different variants of Ateam.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14 (80), 1-13 (2020).</li>
<li>Baeza-Lehnert, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-canonical+control+of+neuronal+Energy+Status+by+the+Na%28%2B%29+Pump%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Non-canonical control of neuronal Energy Status by the Na(+) Pump.</a> Cell Metabolism. 29 (3), 668-680 (2019).</li>
<li>Mattila, J., Hietakangas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+carbohydrate+energy+metabolism+in+Drosophilamelanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of carbohydrate energy metabolism in Drosophilamelanogaster.</a> Genetics. 207 (4), 1231-1253 (2017).</li>
<li>De Backer, J., Grunwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+glia+in+cellular+and+systemic+metabolism%3A+insights+from+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">A role for glia in cellular and systemic metabolism: insights from the fly.</a> Current Opinion in Insect Science. 53 (100947), 1-8 (2022).</li>
<li>Loganathan, S., Ball, H., Manzo, E., Zarnescu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+glucose+uptake+in+Drosophila+models+of+TDP-43+proteinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring glucose uptake in Drosophila models of TDP-43 proteinopathy.</a> Journal of Visualized Experiments. (174), e62936(2021).</li>
<li>Dienel, G., Rothman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+calibration+of+genetically+encoded+metabolite+biosensors+must+account+for+metabolite+metabolism+during+calibration+and+cellular+volume%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">In vivo calibration of genetically encoded metabolite biosensors must account for metabolite metabolism during calibration and cellular volume.</a> Journal of Neurochemistry. , (2023).</li>
<li>Gandara, L., Durrieu, L., Behrensen, C., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+toolkit+for+the+analysis+of+metabolic+changes+in+Drosophila+provides+new+insights+into+metabolic+responses+to+stress+and+malignant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A genetic toolkit for the analysis of metabolic changes in Drosophila provides new insights into metabolic responses to stress and malignant transformation.</a> Scientific Reports. 9, 1-11 (2019).</li>
<li>Gandara, L., Durrieu, L., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+FRET+sensors+in+intact+organs%3A+Applying+spectral+unmixing+to+acquire+reliable+signals%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Metabolic FRET sensors in intact organs: Applying spectral unmixing to acquire reliable signals.</a> BioRxiv. , (2023).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende of financiële belangen te hebben.

Het gebruik van het Drosophila-model voor de studie van het hersenmetabolisme is relatief nieuw26, en het is aangetoond dat het meer kenmerken deelt met het metabolisme van zoogdieren dan verwacht, dat voornamelijk in vitro is bestudeerd in primaire neuronculturen of hersenplakjes. Drosophila blinkt uit in in vivo experimenten dankzij de batterij van genetische hulpmiddelen en genetisch gecodeerde sensoren die beschikbaar zijn en waarmee onderzoekers in realtime...

De hersenen hebben een hoge energiebehoefte vanwege de hoge kosten van het herstellen van ionengradiënten in neuronen veroorzaakt door het genereren en verzenden van neuronale elektrische signalen, evenals synaptische transmissie 1,2. Lang werd gedacht dat aan deze hoge energievraag werd voldaan door de continue oxidatie van glucose om ATP3 te produceren. Specifieke transporters bij de bloed-hersenbarrière brengen de glucose in het bloed over naar de hersenen. Constante glykemische niveaus zorgen ervoor dat de hersenen een constante toevoer van glucose krijgen4. Interessant is dat er steeds meer experimenteel bewijs is dat moleculen die zijn afgeleid van het glucosemetabolisme, zoals lactaat en pyruvaat, een belangrijke rol spelen in de energieproductie van dehersencellen5,6. Er is echter nog steeds enige discussie over hoe belangrijk deze moleculen zijn voor de energieproductie en welke cellen in de hersenen ze produceren of gebruiken 7,8. Het gebrek aan geschikte moleculaire instrumenten met de hoge temporele en ruimtelijke resolutie die nodig is voor deze taak is een belangrijk probleem dat heeft verhinderd dat deze controverse volledig werd opgelost.
De ontwikkeling en toepassing van verschillende gemanipuleerde fluorescerende metabole sensoren hebben geresulteerd in een opmerkelijke toename van ons begrip van waar en hoe metabolieten worden geproduceerd en gebruikt, evenals hoe de metabole fluxen optreden tijdens basale en hoge neuronale activiteit9. Genetisch gecodeerde metabole sensoren op basis van Förster-resonantie-energieoverdracht (FRET)-microscopie, zoals ATeam (ATP), FLII12Pglu700μδ6 (glucose), Laconic (lactaat) en Pyronic (pyruvaat), hebben bijgedragen aan ons begrip van het energiemetabolisme van de hersenen 10,11,12,13. Vanwege de hoge kosten en geavanceerde apparatuur die nodig is om experimenten uit te voeren op levende dieren of weefsels, zijn de resultaten in gewervelde modellen echter nog steeds voornamelijk beperkt tot celculturen (gliacellen en neuronen).
Het opkomende gebruik van het Drosophila-model om deze sensoren tot uitdrukking te brengen, heeft aangetoond dat belangrijke metabolische kenmerken bij verschillende soorten behouden blijven en dat hun functie gemakkelijk kan worden aangepakt met deze tool. Wat nog belangrijker is, het Drosophila-model heeft licht geworpen op hoe glucose en lactaat/pyruvaat worden getransporteerd en gemetaboliseerd in de hersenen van vliegen, het verband tussen monocarboxylaatconsumptie en geheugenvorming, en de opmerkelijke demonstratie van hoe toename van neurale activiteit en metabole flux elkaar overlappen 14,15,16,17. De hier gepresenteerde methode voor het meten van monocarboxylaat-, glucose- en ATP-niveaus met behulp van genetisch gecodeerde FRET-sensoren die tot expressie worden gebracht in het larvale brein, stelt onderzoekers in staat meer te weten te komen over hoe de hersenen van Drosophila energie gebruiken, die kan worden toegepast op de hersenen van andere dieren.
We laten zien dat deze methode effectief is voor het detecteren van lactaat en glucose in gliacellen en neuronen, en dat een monocarboxylaattransporter (Chaski) betrokken is bij de import van lactaat in gliacellen. We demonstreren ook een eenvoudige methode voor het bestuderen van metabolietveranderingen tijdens verhoogde neuronale activiteit, die gemakkelijk kan worden geïnduceerd door badtoepassing van een GABA A-receptorantagonist. Ten slotte laten we zien dat deze methodologie kan worden gebruikt om monocarboxylaat- en glucosetransport te meten in andere metabolisch significante weefsels, zoals vetlichamen.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>CCD Camera ORCA-R2</td><td>Hamamatsu</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Cell-R Software</td><td>Olympus</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>CG-GAL4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>7011</td><td>Vetelijver driver</td></tr><tr><td>Dumont # 5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>DV2-emissiesplitssysteem</td><td>Photometrics</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Glas dekvlakjes (25 mm diameter)</td><td>Marienfeld</td><td>111650</td><td>Duitsland</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software</td><td>Versie 8,0,2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>National Institutes of Health</td><td>Versie 1,53t</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>LUMPlanFl 40x/0.8 water immersie objectief</td><td>Olympus</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Methylparabeen</td><td>Sigma</td><td>H5501</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>OK6-GAL4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td></td><td>Motor neuron driver</td></tr><tr><td>Picrotoxine</td><td>Sigma</td><td>P1675S</td><td>VOORZICHTIG-Dodelijk bij inslikken</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Propionzuur</td><td>Sigma</td><td>P1386</td><td></td></tr><tr><td>Repo-GAL4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>7415</td><td>Gliacellen driver (alle)</td></tr><tr><td>Natriumlactaat</td><td>Sigma</td><td>71718</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Spinning Disk fluorescentiemicroscoop BX61WI</td><td>Olympus</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Trehalose</td><td>US Biological</td><td>T8270</td><td></td></tr><tr><td>UAS-AT1.03NL&nbsp;</td><td>Kyoto Drosophila Stock Center</td><td>117012</td><td>ATP sensor</td></tr><tr><td>UAS-Chk RNAi GD1829</td><td>Vienna Drosophila Resource Center</td><td>v37139</td><td>Chk RNAi lijn</td></tr><tr><td>UAS-FLII12Pglu700md6&nbsp;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>93452</td><td>Glucose sensor</td></tr><tr><td>UAS-GCaMP6f&nbsp;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>42747</td><td>Calcium sensor</td></tr><tr><td>UAS-Laconic</td><td>Sierralta Lab</td><td>-</td><td>Lactaat sensor</td></tr><tr><td>UAS-Pyronic</td><td>Pierre Yves Placais/Thomas Preat</td><td>-</td><td>CNRS-Parijs</td></tr><tr><td>UMPlanFl 20x/0.5 water immersie objectief</td><td>Olympus</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisatie van monocarboxylaten en andere relevante metabolieten in het ex vivo drosophila-larvale brein met behulp van genetisch gecodeerde sensoren

Visualizing Monocarboxylates and Other Relevant Metabolites in the Ex Vivo Drosophila Larval Brain Using Genetically Encoded Sensors

De hoge energiebehoefte van de hersenen als gevolg van elektrische activiteit is een van hun meest onderscheidende kenmerken. Aan deze eisen wordt voldaan door de productie van ATP uit glucose en zijn metabolieten, zoals de monocarboxylaten, lactaat en pyruvaat. Het is nog onduidelijk hoe dit proces wordt gereguleerd of wie de belangrijkste spelers zijn, met name in Drosophila.
Met behulp van genetisch gecodeerde Förster-resonantie-energieoverdrachtssensoren presenteren we een eenvoudige methode voor het meten van het transport van monocarboxylaten en glucose in gliacellen en neuronen in een ex-vivo Drosophila-larvale hersenpreparaat. Het protocol beschrijft hoe een larvale hersenen die een van de sensoren tot expressie brengen, kunnen worden ontleed en op een glazen dekglaasje kunnen worden geplakt. 
We presenteren de resultaten van een heel experiment waarin lactaattransport werd gemeten in larvale hersenen door eerder geïdentificeerde monocarboxylaattransporters in gliacellen uit te schakelen. Verder laten we zien hoe we de neuronale activiteit snel kunnen verhogen en metabolietveranderingen in het actieve brein kunnen volgen. De beschreven methode, die alle nodige informatie biedt, kan worden gebruikt om andere levende weefsels van Drosophila te analyseren.

Gedurende maximaal 1 uur maakt deze procedure het mogelijk om gemakkelijk intracellulaire veranderingen in de fluorescentie van monocarboxylaat- en glucosesensoren te meten. Zoals te zien is in figuur 4, reageren laconieke sensoren in zowel gliacellen als motorneuronen aan het begin van de puls met een vergelijkbare snelheid op 1 mM-lactaat, maar motorneuronen bereiken een hogere toename ten opzichte van de basislijn tijdens de puls van 5 minuten, zoals eerder aangetoond17<...

Hier presenteren we een protocol om het transport van monocarboxylaten, glucose en ATP in gliacellen en neuronen te visualiseren met behulp van genetisch gecodeerde Förster-resonantie-energieoverdracht-gebaseerde sensoren in een ex-vivo Drosophila-larvale hersenpreparaat.

Visualisatie van monocarboxylaten en andere relevante metabolieten in het ex vivo Drosophila-larvale brein met behulp van genetisch gecodeerde sensoren

The high energy requirements of brains due to electrical activity are one of their most distinguishing features. These requirements are met by the ...

De hersenen zijn een weefsel met een hoog energieverbruik dat vooral glucose als brandstof gebruikt. Aan de andere kant suggereren experimentele gegevens dat andere metabolieten zoals ketonlichamen en monocarboxylaten nuttig kunnen zijn als energiebronnen. Er is echter nog steeds een debat gaande over welke hersencellen de producenten en primaire consumenten zijn.Van lactaat is aangetoond dat het een relevante metaboliet is bij gewervelde dieren om hersenactiviteit in vivo te stimuleren. Onze groep en anderen hebben in Drosophila het belang aangetoond van monocarboxylaatmoleculen om de hoge energiebehoefte in neuronen te voeden, evenals de behoefte aan glia-afgeleide lactaat- en ketonlichamen bij geheugenvorming. We hebben monocarboxylaattransporters in de hersenen van Drosophila beschreven en vastgesteld dat de overdracht van lactaat van gliacellen naar neuronen noodzakelijk is om de neurale activiteit te behouden tijdens perioden met veel vraag.Het belangrijkste voordeel is dat het mogelijk is om de intracellulaire dynamiek van glucose en zijn metabolieten, zoals lactaat, pyruvaat en ATB, in gliacellen en neuronen te bepalen tijdens basale en hoge neurale activiteit. Daarnaast om de overdracht van deze moleculen in andere levende weefsels, zoals de vetlichamen, te meten. Het gebruik van de Drosophila als in vivo model voor de studie van het energiemetabolisme van de hersenen met behulp van een eenvoudige opstelling.Dit zal het mogelijk maken om stofwisselingsziekten te modelleren of om de energiehuishouding in de normale hersenen of tijdens de ontwikkeling van neurodegeneratieve ziekten beter te begrijpen.

visualizing-monocarboxylates-other-relevant-metabolites-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates a method for in vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors in flies. It outlines the steps for preparing the flies for microscopy, conducting olfactory conditioning, and visualizing odor-induced calcium influx.

In Vivo Calcium Imaging Using Synaptically Localized Calcium Sensors in Drosophila melanogaster

Source: Ishimoto, H. et. al., Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila. J. Vis. Exp. (2018) This video demonstrates calcium imaging to study Drosophila brain responses to neuropeptides. Neurons expressing a fluorescent calcium indicator reveal intracellular calcium dynamics and functional responses to signaling molecules.

Ex Vivo Calcium Imaging to Study Drosophila Brain Responses to Neuropeptides

Dit document toont het gebruik van een snelle scanning confocale microscoop om het celgedrag rechtstreeks via puparium. Bij het verlaten van het popstadium intact, kan deze methode waarneming en meting van dynamische celprocessen in een stadium van Drosophila ontwikkeling die moeilijk rechtstreeks te bestuderen.

Imaging Door de Pupal zaak van<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Hier we illustreren hoe enkel molecuul foto-geactiveerde lokalisatie microscopie kan worden uitgevoerd op de motorische zenuw-terminal van een levende Drosophila melanogaster derde instar larve.

In Vivo Single-molecuul volgen bij de Terminal van de presynaptische motorische zenuw Drosophila

Dit witboek beschrijft een protocol voor ex vivo calcium beeldvorming van de hersenen van Drosophila . Bij deze methode, kunnen natuurlijke of synthetische verbindingen worden toegepast op de buffer voor het testen van hun vermogen om bepaalde neuronen in de hersenen activeren.

Ex Vivo Calcium Imaging voor het visualiseren van hersenen reacties op endocriene signalering in Drosophila

Presenteren we een protocol voor het meten van zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring in Drosophila melanogaster larvale en volwassen hersenen. Een metabole analyzer wordt gebruikt met een aangepast en geoptimaliseerd protocol. Micro-weefsel beperkingen werden zijn een essentieel onderdeel van dit protocol en ontworpen en gemaakt speciaal voor hun gebruik in deze analyse.

Metabole analyse van Drosophila melanogaster Larval en volwassen hersenen

Hier presenteren we een protocol waarmee pre-en/of postsynaptisch calcium kan worden gevisualiseerd in de context van Drosophila leren en geheugen. In vivo calcium beeldvorming met behulp van Synaptisch gelokaliseerde calcium sensoren wordt gecombineerd met een klassieke olfactorische conditionerings paradigma zodanig dat de Synaptische plasticiteit onderliggende dit type associatief leren kan worden bepaald.

In vivo optische calcium beeldvorming van leren-geïnduceerde synaptische plasticiteit in Drosophila melanogaster

We presenteren een methode die specifiek is afgestemd op het beeld van de hele hersenen van volwassen Drosophila tijdens gedrag en als reactie op stimuli. Het hoofd is gepositioneerd om optische toegang tot de hele hersenen mogelijk te maken, terwijl de vlieg zijn benen en de antennes kan bewegen, de punt van de proboscis en de ogen zintuiglijke stimuli kunnen ontvangen.

Volwassen Drosophila melanogaster voorbereiden op whole brain imaging tijdens gedrags- en stimulireacties

In het vroege Drosophila-embryo zijn veel organellen beweeglijk. In principe kunnen ze live worden afgebeeld via specifieke fluorescerende sondes, maar de eierschaal voorkomt directe toepassing op het embryo. Dit protocol beschrijft hoe dergelijke sondes via micro-injectie kunnen worden geïntroduceerd en vervolgens bulk organelbeweging kan worden geanalyseerd via deeltjesbeeld velocimetrie.

Visualisatie van cytoskeletafhankelijke handel in lipidenbevattende organellen in drosophila-embryo's

Een calciumbeeldvormingsbenadering maakt het mogelijk om smaakgeïnduceerde reacties in de hersenen van wakkere vliegen vast te leggen terwijl een oplossing op het labellum wordt aangebracht. Primaire smaakresponsen in Drosophila melanogaster worden als voorbeeld gebruikt, maar dit protocol kan worden aangepast om stroomafwaartse neuronen of andere soorten te bestuderen.

In vivo Calciumbeeldvorming van smaakgeïnduceerde neurale reacties bij volwassen Drosophila

We presenteren calciumbeeldvormingsprotocollen voor een Drosophila-larvale olfactorische neuron, met behulp van een topische weefsellijm voor immobilisatie. Deze methode verbetert de stabiliteit en maakt betrouwbare in- en ex-vivo-experimenten mogelijk. Aangepaste R-scripts analyseren calciumsignalen en bieden een efficiënt platform voor gedetailleerd neurofysiologisch onderzoek.

In-vivo en ex-vivo calciumbeeldvorming van een reukcircuitneuron in de larve van de Drosophila melanogaster met een derde instar

Ontdek hoe je metaboliettransport visualiseert in Drosophila-larvenhersenen met FRET-sensoren. Deze methode onthult energiedynamiek in neuronen en gliacellen voor neurowetenschappelijk onderzoek.

Visualisatie van monocarboxylaten en andere relevante metabolieten in het ex vivo Drosophila-larvale brein met behulp van genetisch gecodeerde sensoren (Video) | JoVE Journal

Visualisatie van monocarboxylaten en andere relevante metabolieten in het ex vivo Drosophila-larvale brein met behulp van genetisch gecodeerde sensoren

Meer video's verkennen