Name: Subretinale toediening van van menselijke embryonale stamcellen afgeleide fotoreceptorvoorlopercellen bij RD10-muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Leer subretinale injectietechnieken voor stamceltherapie bij netvliesdegeneratie met behulp van rd10-muizen. Dit protocol genereert fotoreceptorvoorlopercellen in 32 dagen voor visieherstel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee en Yingying Chung voor het verlenen van technische assistentie voor de voorbereiding van de dag 32 hESC-afgeleide fotoreceptorvoorlopers na cryopreservatie. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de National Medical Research Council Young Investigator Research Grant Award (NMRC/OFYIRG/0042/2017) en National Research Foundation 24th Competitive Research Program Grant (CRP24-2020-0083) aan HGT.

De in vivo experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en het protocol dat is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van SingHealth (IACUC) en de Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Statement voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en oogheelkundig onderzoek. De pups werden immuunonderdrukt van P17 (pre-transplantatie) tot P30 (post-transplantatie) door ze drinkwater te geven dat ciclosporine bevatte (260 g/L).
1. Bereiding van dag 32 hESC-afgeleide fotoreceptorvoorlopercellen na cryopreservatie
<ol><li>Voorwarm fotoreceptordifferentiatiemedium (PRDM) in een waterbad van 37 °C.</li>
	<li>Haal een cryovial met dag 32 hESC-afgeleide fotoreceptorvoorlopercellen uit vloeibare stikstof. Bewaren op droogijs.</li>
	<li>Ontdooi de cryovial bij 37 °C in een waterbad gedurende 3-5 min. Resuspendeer de dag 32 cellen in 1 ml PRDM en centrifugeer op 130 x g gedurende 4 min.</li>
	<li>Verwijder het supernatans en resuspendeer de cellen in 1 ml PRDM.</li>
	<li>Verwijder 10 μL van het mengsel om de cellen te tellen. Meng cellen met 0,2% trypan blue volgens de instructies van de fabrikant. Pipetteer het celmengsel in het glaasje van de celtelkamer. Bepaal het aantal cellen en de levensvatbaarheid door middel van een geautomatiseerde celteller.</li>
	<li>Ga verder met de volgende stap wanneer de levensvatbaarheid van de cel hoger is dan 70%. Centrifugeer de resterende celsuspensie bij 130 x g gedurende 4 min. Verwijder het supernatans en resuspendeer de celpellet in PRDM in een concentratie van 3 x 105 cellen/μl voor transplantatie.</li>
	<li>Let op zichtbare celklonten. Resuspendeer de celklonten herhaaldelijk met behulp van een pipetpunt van 10 μl in het microfugebuisje totdat er geen zichtbare celklonten meer worden waargenomen. Laad in de 33G-injectiespuit om te kijken of de celoplossing door de naald wordt geëxtrudeerd.</li>
</ol>2. Subretinale afgifte van de hESC's bij rd10-muizen
<ol><li>Voorbereiding van de dieren<ol><li>Verdoof de muis (P20, man/vrouw, 3-6 g) met een combinatie van ketamine (20 mg/kg lichaamsgewicht) en xylazine (2 mg/kg lichaamsgewicht) in een tuberculinespuit van 1 ml die via intraperitoneale benadering aan een naald van 27 G is bevestigd. Dien een subcutane injectie van buprenorfine (0,05 mg/kg) toe aan de muis als preventieve pijnstiller.</li>
		<li>Na toediening van de anesthesie een druppel van 1% tropicamide en 2,5% fenylefrine voor pupilverwijding. Breng een oogheelkundige gel aan op het hoornvlies om uitdroging van het oog en anesthesiegerelateerde cataract te voorkomen.</li>
		<li>Plaats de muis in een lege kooi totdat hij volledig verdoofd is. Beoordeel het juiste verdovingsniveau door in de voetzool te knijpen en bevestig of het dier niet reageert op de harde kneep.</li>
		<li>Wanneer de muis volledig verdoofd is, legt u het dier op een warm kussen van 38 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Subretinale afgifte van de cellen<ol><li>Om een 1-poorts trans-vitreale pars plana-benadering te gebruiken, zoals hier gedaan, voert u subretinale injectie uit in een steriele omgeving. Gebruik een rechtopstaande operatiemicroscoop met een direct lichtpad om de injectie uit te voeren.</li>
		<li>Bereid de glazen spuit van 10 μl voor door de naaldnaaf te verwijderen. Monteer de 33G stompe naald op de glazen spuit. Pak het metalen naafdeksel en zet de naald voorzichtig vast op de spuit.</li>
		<li>Spoel met gedestilleerd water om te controleren op tekenen van lekkage en doorgankelijkheid van de naald. Leeg de spuit en leg deze voorzichtig aan de zijkant.</li>
		<li>Leg de verdoofde muis op een kussen, met het behandeloog recht omhoog naar het objectief van de microscoop. Breng de 0,5% proparacaïnehydrochloride aan en wacht 30 s. Breng 150 μL oogheelkundige gel aan op het oog en plaats er een rond afdekglaasje op.</li>
		<li>Voer een ruw onderzoek van het oog uit door het hoornvlies, de iris, de pupil, de lens en het bindvlies te observeren. Visualiseer via de pupil de fundus van het muizenoog door het brandpuntsvlak aan te passen. Pas het hoofd aan totdat het optische hoofd zich in het midden van de pupil bevindt en minimaliseer de beweging van het hoofd door het op de juiste manier op het kussen te plaatsen.</li>
		<li>Tik meerdere keren zachtjes met de hESC's op de basis van de buis om een uniforme celsuspensie te krijgen. Met behulp van de 10 μL glazen microliterspuit met een 33G stompe naald, zuigt u 2 μL cellen/media op. Trek de cellen vlak voor de injectie op om celzetting/klontering in de spuit te voorkomen.</li>
		<li>Maak met een wegwerpnaald van 30 G een sclerectomiewond 2 mm achter de limbus. Houd de hoek van de naald op ~45° om te voorkomen dat u de lens aanraakt. Zodra de punt van de naald in het oog is gevisualiseerd, trekt u de naald voorzichtig terug. Gooi de naald na gebruik weg in de scherpe bak om prikletsel door de naald te voorkomen.</li>
		<li>Neem de glazen spuit en steek de stompe naald in de sclerectomiewond. Zonder de lens aan te raken, beweegt u de stompe naald naar voren totdat deze het tegenoverliggende netvlies van de ingangswond bereikt. Zorg ervoor dat het injectiegebied vrij is van grote bloedvaten in het netvlies om bloedingen te voorkomen.</li>
		<li>Penetreer voorzichtig het netvlies totdat een druktak op de sclera wordt gezien. Houd het stompe uiteinde van de naald evenwijdig aan de sclera om lekken van de cellen in de glasachtige ruimte te voorkomen.</li>
		<li>Injecteer langzaam 2 μl celsuspensie of PRDM-media (controle) in de subretinale ruimte terwijl de injectiespuit zachtjes wordt aangedrukt. Bij een succesvolle injectie moet op de injectieplaats een zichtbare bleb (d.w.z. een verhoogd netvlies met de celsuspensie/media erin) worden gevormd. OPMERKING: Tijdens de injectie mag slechts lichte druk worden uitgeoefend om scheuren in het netvlies en verstopping van de cellen aan de punt van de naald te voorkomen.</li>
		<li>Wacht na het bevestigen van de bleb 10 seconden om de cellen tot rust te laten komen. Trek de naald voorzichtig terug uit het oog.</li>
	</ol></li>
	<li>Intraoperatieve optische coherentietomografie (OCT) scannen van de bleb (optioneel)<ol><li>Positioneer het muizenoog om de vlek onder de microscoop te visualiseren door het hoofd langzaam te bewegen. Zet de positie vast door het hoofd voorzichtig vast te houden. Er is geen extra pupilverwijding nodig. Verwijder het afdekglaasje en de gel niet op het oog. Het geeft een duidelijk optisch medium om de bleb te visualiseren.</li>
		<li>Voer de intra-operatieve OCT uit met behulp van de ingebouwde iOCT-functie van de operatiemicroscoop.</li>
		<li>Druk op de Kubus optie op het OCT-scherm en plaats het scangebied op de bleb door op de pijltoetsen te drukken. Pas de OCT aan door Centrering en Focus te verschuiven voor de beste OCT-kwaliteit. Druk op Capture/Scan om de OCT-scan van het bliepgebied te verkrijgen. Bekijk de afbeeldingen om de kwaliteit van de scans te controleren.</li>
	</ol></li>
	<li>Terugwinning<ol><li>Verwijder het afdekglaasje en reinig de gel van het oog met gaasje. Breng na de injectie één keer antibiotische zalf aan om infectie te voorkomen.</li>
		<li>Laat het dier herstellen van de anesthesie onder een warm licht totdat het weer voldoende bij bewustzijn is om de sternale lighouding te behouden en terug te keren naar de thuiskooi. Controleer het dier ten minste 3 dagen na de injectie op tekenen van ontsteking, infectie en angst. NOTITIE: Het warme licht van 150 W moet ten minste 30 cm van de dierenkooi verwijderd zijn en voorzichtigheid is geboden om brandwonden te voorkomen.</li>
		<li>Dien een subcutane injectie met buprenorfine (0,05 mg/kg) 8 uur toe gedurende 1 dag of volgens de aanbeveling van de dierenarts. Als een ontsteking of infectie van het oog wordt waargenomen, raadpleeg dan een dierenarts voor een passende behandeling.</li>
	</ol></li>
	<li>Reiniging en sterilisatie van de instrumenten<ol><li>Spoel de 10 μL glazen microliter spuit en de 33G stompe naald 10x door met 100% ethanol. Spoel de ethanol weg door de spuit met gedestilleerd water te laten knipperen.</li>
		<li>Demonteer de glazen spuit en de naald. Droog de spuit af om deze te bewaren.</li>
	</ol></li>
</ol>

Revitaliserend zicht: stamceltherapie voor netvliesdegeneratie

Hwee Goon Tay is mede-oprichter van Alder Therapeutics AB. Andere auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

De subretinale injectie is gebruikt voor celsuspensietransplantatie voor de behandeling van RPE en netvliesaandoeningen 23,25,26,27,28,31,40. Deze aanpak is zeer essentieel in knaagdierstudies, niet alleen voor celtransplantatie en gentherapiebenaderingen, maar ook om nieuwe therapeutische v...

Erfelijke netvliesaandoeningen en leeftijdsgebonden maculadegeneratie leiden tot verlies van fotoreceptorcellen en uiteindelijk blindheid. De retinale fotoreceptor is de buitenste segmentlaag van het netvlies die bestaat uit gespecialiseerde cellen die verantwoordelijk zijn voor fototransductie (d.w.z. omzetting van licht in neuronale signalen). De staaf- en kegelvormige fotoreceptorcellen grenzen aan de retinale gepigmenteerde laag (RPE)1. Fotoreceptorcelvervangingstherapie om het celverlies te compenseren is een opkomende en zich ontwikkelende therapeutische benadering. Embryonale stamcellen (ESC's)2,3,4, geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's)-afgeleide RPE-cellen en retinale voorlopercellen (RPC's)4,5,6,7,8 werden gebruikt om de beschadigde fotoreceptorcellen te herstellen. Subretinale ruimte, een besloten ruimte tussen het netvlies en de RPE, is een aantrekkelijke locatie om deze cellen af te zetten ter vervanging van beschadigde fotoreceptorcellen, RPE en Mueller-cellen vanwege de nabijheid 9,10,11.
Gen- en celtherapieën hebben de subretinale ruimte gebruikt voor regeneratieve geneeskunde voor verschillende netvliesaandoeningen in preklinische studies. Dit omvat de levering van functionele kopieën van het gen of genbewerkingstools in de vorm van anti-sense oligonucleotidetherapie12,13 of CRISPR/Cas9 of basenbewerking via adeno-geassocieerd virus (AAV) gebaseerde strategie 14,15,16, implantatie van materialen (bijv. RPE-blad, retinale protheses 17,18,19) en gedifferentieerde stamcel-afgeleide retinale organoïden 20,21,22 voor de behandeling van netvlies- en RPE-gerelateerde ziekten. Klinische onderzoeken met hESC-RPE31 in de subretinale ruimte voor de behandeling van RPE65-geassocieerde Leber congenitale amaurosis (LCA)23,24, CNGA3-gekoppelde achromatopsie25, MERTK-geassocieerde retinitis pigmentosa26, choroïderemie 27,28,29,30 zijn een effectieve aanpak gebleken. Directe injectie van cellen in de buurt van het beschadigde gebied verbetert de kans op celvestiging in het juiste gebied, synaptische integratie en uiteindelijke visuele verbetering aanzienlijk.
Hoewel subretinale injectie in menselijke modellen en modellen met grote ogen (d.w.z. varken 32,33,34,35, konijn 36,37,38,39,40 en niet-menselijke primaat 41,42,43) is vastgesteld, is een dergelijke injectie in het muizenmodel nog steeds een uitdaging vanwege de beperking van de oogbolgrootte en de enorme lens die het oog van de muis bezet 44,45,46. Genetisch gemodificeerde modellen zijn echter alleen direct beschikbaar bij kleine dieren en niet bij grote dieren (d.w.z. konijnen en niet-menselijke primaten), daarom vestigt subretinale injectie bij muizen de aandacht om nieuwe therapeutische benaderingen bij genetische aandoeningen van het netvlies te onderzoeken. Er worden drie belangrijke benaderingen gebruikt om cellen of AAV's in de subretinale ruimte af te leveren, namelijk de transcorneale route, de transsclerale route en de pars plana-route (zie figuur 2). Transcornea- en transsclerale routes worden in verband gebracht met cataractvorming, synechiae, choroïdale bloedingen en reflux van de injectieplaats 11,44,45,47,48,49. We hebben de pars plana-benadering toegepast als een directe visualisatie van het injectieproces en de injectieplaats kan in realtime onder de microscoop worden bereikt.
We hebben onlangs een methode beschreven die menselijke embryonale stamcellen (hESC's) kan differentiëren tot fotoreceptorvoorlopercellen onder xenovrije, chemisch gedefinieerde omstandigheden met behulp van recombinant humaan netvlies-specifieke laminine-isovorm LN523. Aangezien LN523 aanwezig bleek te zijn in het netvlies, veronderstelden we dat de extracellulaire matrixniche van het menselijk netvlies in vitro zou kunnen worden gerecapituleerd en daardoor fotoreceptordifferentiatie van de hESC's zou kunnen ondersteunen36. Single-cell transcriptomische analyse toonde aan dat fotoreceptor-voorlopercellen die co-expressie cone-rod homeobox en recoverine tot expressie brachten, na 32 dagen werden gegenereerd. Een retinale degeneratie 10 (rd10) mutant muismodel dat autosomaal humane retinitis pigmentosa nabootst, werd gebruikt om de werkzaamheid van de dag 32 hESC-afgeleide fotoreceptorvoorlopercellen in vivo te evalueren. De hESC-afgeleide fotoreceptorvoorlopercellen werden geïnjecteerd in de subretinale ruimte van rd10-muizen op P20, waar fotoceptordisfunctie en degeneratie aan de gang zijn36. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de bereiding van de post-cryopreserveerde hESC-afgeleide fotoreceptorvoorlopercellen en levering in de subretinale ruimte van rd10-muizen . Deze methode kan ook worden gebruikt om AAV's, celsuspensies, peptiden of chemicaliën toe te dienen in de subretinale ruimte bij muizen.

<table><tbody><tr><td>0.3% Tobramycin</td><td>Novartis</td><td>NDC &nbsp;0078-0813-01</td><td>Tobrex (3.5 g)</td></tr><tr><td>0.3% Tobramycin en 0.1% Dexamethason</td><td>Novartis</td><td>NDC 0078-0876-01</td><td>Tobradex (3.5 g)</td></tr><tr><td>0.5% Proparacaine hydrochloride</td><td>Alcon</td><td>NDC 0998-0016-15</td><td>0.5% Alcaine (15 mL)</td></tr><tr><td>1 mL Tuberculinespuit</td><td>Turemo</td><td>SS01T2713</td><td></td></tr><tr><td>1% Tropicamide</td><td>Alcon</td><td>NDC 0998-0355-15</td><td>1% Mydriacyl (15 mL)</td></tr><tr><td>2.5% Fenylephrine hydrochloride</td><td>Alcon</td><td>NDC 0998-0342-05</td><td>2.5% Mydfrin (5 mL)</td></tr><tr><td>24-wells weefselkweekplaat</td><td>Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>30 G Wegwerpnaald</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>33 G, 20 mm lengte stompe naalden</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>Automatische celteller</td><td>NanoEnTek</td><td>Model: Eve</td><td></td></tr><tr><td>B27 zonder Vitamine A</td><td>Life Technologies</td><td>12587001</td><td>2%36</td></tr><tr><td>Buprenorfine</td><td>Ceva</td><td></td><td>Vetergesic vet (0.3 mg/mL)</td></tr><tr><td>CKI-7</td><td>Sigma</td><td>C0742</td><td>5 &micro;M36</td></tr><tr><td>Cyclosporine</td><td>Novartis</td><td></td><td>260 g/L in drinkwater</td></tr><tr><td>Day 32 hESC-afgeleide fotoreceptor voorlopercellen</td><td>DUKE-NUS Medical School</td><td></td><td>Humane embryonale stamcellen worden gedurende 32 dagen gedifferentieerd. Zie protocol in Ref 36.</td></tr><tr><td>Gaas</td><td>Winner Industries Co. Ltd.</td><td>1SNW475-4</td><td></td></tr><tr><td>Glasgow Minimum Essential Medium</td><td>Gibco</td><td>11710&ndash;035</td><td></td></tr><tr><td>hESC-cellijn H1</td><td>WiCell Research Institute</td><td>WA01</td><td></td></tr><tr><td>Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-02-50</td><td>10 ng/mL36</td></tr><tr><td>Human ciliary neurotrophic factor (CNTF)</td><td>Prospec-Tany Technogene</td><td>CYT-272</td><td>10 ng/mL36</td></tr><tr><td>Ketamine hydrochloride (100 mg/mL)</td><td>Ceva Sant&eacute; Animale</td><td>KETALAB03</td><td></td></tr><tr><td>LN-521</td><td>Biolamina</td><td>LN521-02</td><td>1 &micro;g36</td></tr><tr><td>mFreSR</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5854</td><td></td></tr><tr><td>Microliter glas spuit (10 mL)</td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td></td></tr><tr><td>N-[N-(3,5-difluorofenylacetyl-L-alanyl)]-S-fenylglycine t-butylester (DAPT)</td><td>Selleckchem</td><td>S2215</td><td>10 &micro;M36</td></tr><tr><td>N-2 supplement</td><td>Life Technologies</td><td>A13707-01</td><td>1%36</td></tr><tr><td>Niet-essentiële aminozuren (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140&ndash;050</td><td>1x36</td></tr><tr><td>NutriStem XF Media</td><td>Satorius</td><td>05-100-1A</td><td></td></tr><tr><td>Operatiemicroscoop</td><td>Zeiss</td><td>OPMI LUMERA 700</td><td>Met ingebouwde iOCT-functie</td></tr><tr><td>PRDM (Fotoreceptordifferentiatiemedium, 50 ml)</td><td>DUKE-NUS Medical School</td><td></td><td>Zie samenstelling van media36. Basismedium, 10 &micro;M DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 &micro;M Retinoic acid, 2% B27 en 1% N2. Basismedium: 1x GMEM, 1 mM natriumpyruvaat, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Niet-essentiële aminozuren (NEAA).</td></tr><tr><td>Pyruvet</td><td>Gibco</td><td>11360&ndash;070</td><td>1 mM36</td></tr><tr><td>Rd10 muizen</td><td>Jackson Laboratory</td><td>B6.CXB1-Pde6brd10/J muizen</td><td>Geslacht: man/vrouw, Leeftijd: P20 (injectie), Gewicht: 3-6 g&nbsp;</td></tr><tr><td>Retinoic acid</td><td>Tocris Bioscience</td><td>0695/50</td><td>0.5 &micro;M36</td></tr><tr><td>Ronde deksels (12 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Sigma</td><td>S4317</td><td>0.5 &micro;M36</td></tr><tr><td>Vidisic Gel (10 g)</td><td>Dr. Gerhard Mann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine hydrochloride (20 mg/mL)</td><td>Troy Laboratories</td><td>LI0605</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985&ndash;023</td><td>0.1 mM36</td></tr></tbody></table>

subretinale toediening van van menselijke embryonale stamcellen afgeleide fotoreceptorvoorlopercellen bij rd10-muizen

Sub-Retinal Delivery of Human Embryonic Stem Cell Derived Photoreceptor Progenitors in rd10 Mice

Regeneratie van fotoreceptorcellen met behulp van menselijke pluripotente stamcellen is een veelbelovende therapie voor de behandeling van zowel erfelijke als verouderende netvliesaandoeningen in een vergevorderd stadium. We hebben aangetoond dat de menselijke recombinante retina-specifieke laminine-isovormmatrix in staat is om de differentiatie van menselijke embryonale stamcellen (hESC's) naar fotoreceptorvoorlopercellen te ondersteunen. Bovendien heeft subretinale injectie van deze cellen ook gedeeltelijk herstel aangetoond in de rd10-modellen voor knaagdieren en konijnen. Het is bekend dat subretinale injectie een gevestigde methode is die is gebruikt om farmaceutische verbindingen af te leveren aan de fotoreceptorcellen en de retinale gepigmenteerde epitheliale (RPE) laag van het oog vanwege de nabijheid van de doelruimte. Het is ook gebruikt om adeno-geassocieerde virale vectoren in de subretinale ruimte af te leveren om netvliesaandoeningen te behandelen. De subretinale afgifte van farmaceutische verbindingen en cellen in het muizenmodel is een uitdaging vanwege de beperking in de grootte van de muizenoogbol. Dit protocol beschrijft de gedetailleerde procedure voor de voorbereiding van hESC-afgeleide fotoreceptor-voorlopercellen voor injectie en de subretinale toedieningstechniek van deze cellen in genetische retinitis pigmentosa-mutant, rd10-muizen . Deze aanpak maakt celtherapie mogelijk op het doelgebied, met name de buitenste nucleaire laag van het netvlies, waar ziekten optreden die leiden tot degeneratie van fotoreceptoren.

De glazen spuit van 10 μl is geassembleerd volgens de instructies van de fabrikant (afbeelding 1) en de stompe naald die wordt gebruikt om de celsuspensie/media toe te dienen, is weergegeven in afbeelding 1B. Verschillende benaderingen voor subretinale injectie worden geïllustreerd in figuur 2. In dit protocol beschrijven we de pars plana-benadering (Figuur 2C). De stompe naald die op een glazen spuit w...

We beschrijven een gedetailleerd protocol voor de bereiding van post-gecryopreserveerde hESC-afgeleide fotoreceptor-voorlopercellen en de subretinale afgifte van deze cellen in rd10-muizen .

Subretinale toediening van van menselijke embryonale stamcellen afgeleide fotoreceptorvoorlopercellen bij RD10-muizen

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal ...

Mijn onderzoek richt zich op de ontwikkeling van stamceltherapie voor gevorderde stadia van netvliesaandoeningen die fotoreceptordegeneratie veroorzaken. Het doel van ons onderzoek is om het verlies van fotoreceptoren bij patiënten te vervangen door klinisch veilige en functionele fotoreceptorvoorlopercellen met als doel hun gezichtsscherpte te verbeteren of zelfs hun gezichtsvermogen te herstellen. Het belangrijkste preklinische model zijn muizen, maar hun kleine oogbol maakt het een uitdaging om materialen te injecteren, vooral onder het netvlies.Het ontwikkelen van de vaardigheid om succesvolle subretinale injecties uit te voeren, vereist geduld en doorzettingsvermogen. We hebben met succes een lamininebasis ontwikkeld voor de receptordifferentiatiemethode die in staat is om in 32 dagen fotoreceptorvoorlopercellen te genereren. De subretinale transplantaties van deze fotoreceptor voorlopercellen celsuspensies in de knaagdieren resulteerden in synaptische connectiviteit tussen de gaten en het transplantaat in de ogen.Dit heeft geleid tot een gedeeltelijk visueel herstel. Onze aanpak is eenvoudig, de juiste visualisatie helpt de chirurg om de naald naar het interessegebied te hanteren.

sub-retinal-delivery-human-embryonic-stem-cell-derived-photoreceptor

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Deze chirurgische techniek illustreert de injectie van gentherapievectoren en stamcellen in de subretinale ruimte van de muis oog.

Subretinale Injectie van gentherapievectoren en stamcellen in de Mouse Eye

Celtransplantatie vertegenwoordigt een strategie voor de behandeling van netvliesdegeneratie die wordt gekenmerkt door fotoreceptorverlies. Hier beschrijven we een methode voor verrijking van transplanteerbare fotoreceptoren en hun subretinale enting in volwassen muizen.

Subretinale transplantatie van MACS gezuiverde fotoreceptor precursor cellen in de volwassen muis retina

Hier presenteren we een door de gemeenschap geaccepteerd protocol in multimedia-formaat voor het subretinaal injecteren van een bolus RPE-cellen bij ratten en muizen. Deze aanpak kan worden gebruikt voor het bepalen van reddingspotentieel, veiligheidsprofielen en overlevingscapaciteiten van getransplanteerde RPE-cellen bij implantatie in diermodellen van retinale degeneratie.

Presterende Subretinal Injecties in Knaagdieren om retinale pigment epitheel cellen leveren in Suspension

Subretinal injectie is veel toegepast in preklinische studies van stamcel substitutietherapie voor leeftijdsgebonden maculaire degeneratie. In dit gevisualiseerde artikel beschrijven we een minder riskant, reproduceerbaar zijn en juist gewijzigd subretinal injectietechniek via de trans-scleral-benadering te leveren van cellen in de ogen van de rat.

Ontwikkeling van een verfijnde Protocol voor Trans-scleral Subretinal transplantatie van menselijke retinale Pigment epitheliale cellen in de ogen van de Rat

Retinale pigment epitheliale cellen kunnen dienen als een cel-vervangende therapie voor de geavanceerde vorm van droge leeftijdsgebonden Macula degeneratie. Dit protocol beschrijft de generatie van een grote-eyed model van geografische atrofie en subretinal transplantatie van menselijke embryonale stamcellen cel afkomstige retinale pigment epitheliale cellen in dit model van ziekte.

Subretinal transplantatie van menselijke embryonale stamcellen afgeleid-retinale Pigment epitheliale cellen in een grote-eyed Model van geografische atrofie

Beschrijven we een methode om ingenieur een retinale weefsel samengesteld van retinale pigment epitheliale cellen afgeleid van menselijke pluripotente stamcellen gekweekt op de top van menselijke vruchtwater membranen en de voorbereiding voor de transplantatie in diermodellen.

Transplantatie-geschikt retinale Pigment epitheel Tissue Engineering afgeleid van menselijke embryonale stamcellen

Hier wordt een chirurgische techniek gepresenteerd voor het transplanteren van van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) afgeleid netvliesweefsel in de subretinale ruimte van een groot diermodel.

Subretinale transplantatie van menselijk embryonaal stamcel-afgeleid retinaal weefsel in een katachtig groot diermodel

Dit protocol presenteert een transpupillaire zichtgeleide transsclerale benadering om veilig en nauwkeurig subretinale cellulaire transplantaten af te leveren, met een laag aantal chirurgische complicaties, bij muizenontvangers met of zonder retinale degeneratie.

Transpupilgeleide transsclerale transplantatie van subretinale transplantaten in een muismodel voor retinale degeneratie

Een methode wordt beschreven voor de menselijke retinoblastoom tumoren verspreiden in muizen. Tumorcellen worden rechtstreeks geïnjecteerd in de ogen van het immuunsysteem van deficiënte muizen. Secundaire tumoren zijn met succes gebruik van beide cellen direct geoogst van menselijke tumoren en beschaafde tumorspheres.

Oprichting en Voortplanting van Human Retinoblastoom Tumoren in het immuunsysteem van deficiënte muizen

Stamceltransplantatie in een In vitro Gesimuleerde ischemie / reperfusie model

Leer subretinale injectietechnieken voor stamceltherapie bij netvliesdegeneratie met behulp van rd10-muizen. Dit protocol genereert fotoreceptorvoorlopercellen in 32 dagen voor visieherstel.

Subretinale toediening van van menselijke embryonale stamcellen afgeleide fotoreceptorvoorlopercellen bij RD10-muizen

Meer video's verkennen