Name: Intacte korte, tussenliggende en lange skeletspiervezels verkregen door enzymatische dissociatie van zes achterpootspieren van muizen: voorbij flexor digitorum brevis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T12:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Leer een methode voor enzymatische dissociatie van intacte korte, tussenliggende en lange skeletspiervezels uit zes achterpootspieren van muizen. Dit protocol ondersteunt fysiologisch onderzoek naar excitatie-contractiekoppeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs spreken hun dank uit aan professor Robinson Ramírez van UdeA voor hulp met dieren en enkele foto's en aan Carolina Palacios voor technische ondersteuning. Johan Pineda van Kaika heeft ons geholpen met het instellen van de kleuren- en fluorescentiecamera's. Shyuan Ngo, van de Universiteit van Queensland, was zo vriendelijk het manuscript te proeflezen. Deze studie werd gefinancierd door de CODI-UdeA (2020-34909 vanaf 22 februari 2021 en 2021-40170 vanaf 31 maart 2022, SIU), en Planning Office-UdeA (E01708-K en ES03180101), Medellín, Colombia, aan JCC. Financiers namen niet deel aan het verzamelen en analyseren van gegevens, het schrijven of indienen van manuscripten.

Enzymatische isolatie en karakterisering van spiervezels van muizen met variabele lengte

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.

Als aanvulling op de modellen die beschikbaar zijn voor het bestuderen van de biologie van volwassen skeletspieren, demonstreren we hier de succesvolle enzymatische dissociatie van een reeks muisspieren met korte, tussenliggende en lange vezels. Deze vezels maken het mogelijk om de generaliseerbaarheid van de MT-II-kinetiek van de Ca2+ -transiënten in skeletspieren aan te tonen. Verder werden de vezeltypen in de intacte, hele spieren geclassificeerd. Aangezien de FDB de meest gebruikte spier is voor fysiologis...

De volwassen skeletspier van zoogdieren is een multifunctioneel weefsel. Het reguleert sterk het metabolisme, is de belangrijkste bron van warmteproductie en zijn dynamische eigenschappen geven het een sleutelrol bij de ademhaling, beweging van lichaamssegmenten of verplaatsing van het ene punt naar het andere 1,2,3. Skeletspieren zijn ook relevant voor de pathofysiologie van veel ziekten, waaronder erfelijke en chronische aandoeningen, zoals myopathieën, dystrofieën of sarcopenie, evenals veel niet-spierchronische aandoeningen, zoals cardiometabole ziekten 3,4,5,6,7,8.
De ex vivo studie van de structurele en functionele eigenschappen van rijpe skeletspieren in de context van gezondheid en ziekte is voornamelijk mogelijk geweest door middel van twee experimentele modellen: hele spieren en geïsoleerde vezels. In de 20eeeuw maakten onderzoekers gebruik van de eigenschappen van de hele, intacte extensor digitorum longus (EDL), soleus, tibialis anterior en gastrocnemius-spieren van verschillende kleine soorten als cruciale modellen om meer te weten te komen over motoreenheden, vezeltypen en dynamische eigenschappen zoals kracht en kinetiek van samentrekking en ontspanning 9,10,11,12,13,14,15,16. De komst van meer verfijnde celbiologische studies verplaatste het gebied echter in de richting van de studie van enkele spiervezels. Baanbrekend werk maakte vervolgens de isolatie mogelijk van intacte flexor digitorum brevis (FDB) vezels van ratten door enzymatische dissociatie voor latere karakterisering 17,18,19. Hoewel FDB-vezels ook kunnen worden verkregen door handmatige dissectie20, hebben het gemak en de hoge doorvoer van enzymatische dissociatie van muizenspieren, naast hun geschiktheid voor een verscheidenheid aan experimentele benaderingen, ervoor gezorgd dat het laatste model de afgelopen twee decennia op grote schaal is gebruikt.
De korte FDB-vezels zijn geschikt voor elektrofysiologische en andere biofysische studies, biochemische, metabole en farmacologische analyses, elektronen- en fluorescentiemicroscopie-experimenten, transfectie voor celbiologische benaderingen, of als bron van stamcellen in myogenesestudies 5,21,22,23,24,25,26,27,28, 29,30,31,32. Het gebruik van alleen FDB-vezels in spierexperimenten verkleint echter de reikwijdte van onderzoek naar vezelsoorten en beperkt de hoeveelheid biologisch materiaal die beschikbaar is voor sommige methodologische technieken of voor het verkrijgen van meer informatie van één dier. Deze beperkingen belemmeren een duidelijke correlatie van cellulaire fysiologische verschijnselen met eerdere biochemische en dynamische studies die zijn uitgevoerd in verschillende hele, intacte spieren (bijv. EDL, soleus, peronei).
Door deze beperkingen te overwinnen, slaagden sommige groepen erin om de langere EDL- en soleusspieren 24,33,34,35,36,37,38,39,40 te dissociëren, waardoor de deur werd geopend om de methode verder uit te breiden naar andere relevante spieren. Het gebruik van EDL- en soleusvezels is echter nog steeds schaars, waarschijnlijk vanwege het gebrek aan methodologische details om ze als intacte vezels te krijgen. Hier beschrijven we in detail hoe je vezels van verschillende lengtes en typen kunt isoleren uit zes spieren: drie daarvan zijn al beschreven (FDB, EDL en soleus) en drie daarvan zijn voor het eerst met succes gedissocieerd (extensor hallucis longus [EHL], peroneus longus [PL] en peroneus digiti quarti [PDQA]). De resultaten van het huidige werk bevestigen dat het model van enzymatisch gedissocieerde vezels geschikt is voor een breed scala aan studies en toekomstige correlaties met eerder gepubliceerde gegevens, waardoor de beschikbaarheid van modellen voor volwassen skeletspierstudies toeneemt.

<table><tbody><tr><td>Reagenten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Absolute ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Merck</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamid</td><td>Gibco BRL</td><td>15512-015</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfaat</td><td>Panreac</td><td>141138.1610</td><td></td></tr><tr><td>Anti myosine I antilichaam</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4276</td><td>Primair antilichaam</td></tr><tr><td>Anti myosine II antilichaam</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8421</td><td>Primair antilichaam</td></tr><tr><td>Anti myosine IIA antilichaam</td><td>American Type Culture Collection</td><td>SC-71</td><td>Primair antilichaam. Afkomstig van HB-277 hybridoma</td></tr><tr><td>Anti myosine IIB antilichaam</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>BF-F3-c&nbsp;</td><td>Primair antilichaam</td></tr><tr><td>Bis-acrylamid</td><td>AMRESCO</td><td>0172</td><td></td></tr><tr><td>Rundserumalbumine</td><td>Thermo Scientific</td><td>B14</td><td></td></tr><tr><td>Bradford reagens</td><td>Merck</td><td>1.10306.0500</td><td></td></tr><tr><td>Broomfenolblauw</td><td>Carlo Erba</td><td>428658</td><td></td></tr><tr><td>Calciumcarbonaat</td><td>Merck</td><td>102066</td><td></td></tr><tr><td>Calciumdichloride (CaCl2)</td><td>Merck</td><td>2389</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>319988</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type 2</td><td>Worthington</td><td>CLS-2/LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Consul-Mount</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990440</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Briljantblauw R 250&nbsp;</td><td>Merck</td><td>112553</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>AMRESCO</td><td>0281</td><td></td></tr><tr><td>Edetanzuur (EDTA</td><td>AMRESCO</td><td>0322</td><td></td></tr><tr><td>Eosine Y</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Panreac&nbsp;</td><td>1423291211</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Panreac</td><td>151340.1067</td><td></td></tr><tr><td>Geitenserum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxyline</td><td>Thermo Scientific</td><td>6765015</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>AMRESCO</td><td>0511</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma Aldrich</td><td>861405</td><td></td></tr><tr><td>Imidazool</td><td>AMRESCO</td><td>M136</td><td></td></tr><tr><td>Isopentaan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Laminine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Mag-Fluo-4, AM</td><td>Invitrogen</td><td>M14206</td><td>Alleen bereid in DMSO. Pluronic zuur is niet vereist en mag niet worden gebruikt om vezeldeterioratie te voorkomen.</td></tr><tr><td>Mercaptoethanol</td><td>Applichem</td><td>A11080100</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Protokimica</td><td>MP10043</td><td></td></tr><tr><td>Muizen</td><td>Meerdere</td><td>Meerdere</td><td>Voor dit manuscript gebruikten we alleen C57BL/6 muizen. Echter, sommige voorlopige resultaten hebben aangetoond dat het protocol goed werkt voor Swiss Webster muizen van dezelfde leeftijd en gewicht.</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tetramethylethaan-1,2-diamine (TEMED)</td><td>Promega</td><td>V3161</td><td></td></tr><tr><td>N-benzyl-p-tolueen sulfonamide (BTS)</td><td>Tocris</td><td>1870</td><td></td></tr><tr><td>Optimale snijverbinding (OCT)</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>Secundair antilichaam</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-11001</td><td>Geit anti-muis IgG (H+L) Cross-Adsorbed secundair antilichaam, Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaat</td><td>Panreac&nbsp;</td><td>1323631209</td><td></td></tr><tr><td>TRIS 0,5 M, pH 6,8&nbsp;</td><td>AMRESCO</td><td>J832</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethaan</td><td>AMRESCO</td><td>M151</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AMRESCO</td><td>M143</td><td></td></tr><tr><td>Materiaal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissectiekamer</td><td>Op maat gemaakt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelaaide glazen</td><td>Erie Scientific</td><td>5951PLUS</td><td></td></tr><tr><td>Experimentele badkamer</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-27NE2</td><td>Narrow Bath Chamber with Field Stimulation, ensembled op een verwarmd platform PH-6</td></tr><tr><td>Fijne pincetten</td><td>World Precision Instruments</td><td>500338, 500230</td><td></td></tr><tr><td>Fijne schaar</td><td>World Precision Instruments</td><td>Vannas Scissors 501778</td><td></td></tr><tr><td>Glazen Pasteur pipetten</td><td>Meerdere</td><td></td><td>Met vuur gepolijste punten</td></tr><tr><td>Glazen flesjes met dop</td><td>Meerdere</td><td></td><td>2-3 mL volume</td></tr><tr><td>Operatieschaar</td><td>World Precision Instruments</td><td>501223-G</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>SL 8R</td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>Digitale camera</td><td>Zeiss</td><td>Erc 5s en Axio 305</td><td>Axio 305, gekoppeld aan de Stemi 508 stereoscoop, werd gebruikt om foto's te maken tijdens dissectie; terwijl Erc 5s of Axio 208, gekoppeld aan de Axio Observer A1 microscoop, werden gebruikt om afbeeldingen te maken van de geïsoleerde vezels en de immunofluorescentie-assays</td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Molecular Devices</td><td>1550A Digidata</td><td></td></tr><tr><td>Elektroforese kamer</td><td>Bio Rad</td><td>Mini-Protean IV</td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerde microscoop gekoppeld aan fluorescentie</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer A1</td><td>Gekoppeld aan een geschikte lichtbron, filters en objectieven voor fluorescentie</td></tr><tr><td>Fotomultiplier</td><td>Horiba</td><td>R928 tube, Hamamatsu, in een D104 fotometer, Horiba</td><td>Gekoppeld aan de laterale poort van de fluorescentiemicroscoop</td></tr><tr><td>Stereoscoop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 508</td><td></td></tr><tr><td>Stimulator&nbsp;</td><td>Grass Instruments&nbsp;

intacte korte, tussenliggende en lange skeletspiervezels verkregen door enzymatische dissociatie van zes achterpootspieren van muizen: voorbij flexor digitorum brevis

Intact Short, Intermediate, and Long Skeletal Muscle Fibers Obtained by Enzymatic Dissociation of Six Hindlimb Muscles of Mice: Beyond Flexor Digitorum Brevis

Skeletspiervezels verkregen door enzymatische dissociatie van muizenspieren zijn een bruikbaar model voor fysiologische experimenten. De meeste artikelen gaan echter over de korte vezels van de flexor digitorum brevis (FDB), die de reikwijdte van de resultaten met betrekking tot vezeltypes beperkt, de hoeveelheid beschikbaar biologisch materiaal beperkt en een duidelijk verband belemmert tussen cellulaire fysiologische verschijnselen en eerdere biochemische en dynamische kennis die in andere spieren is verkregen.
Dit artikel beschrijft hoe intacte vezels kunnen worden verkregen uit zes spieren met verschillende vezeltypeprofielen en lengtes. Met behulp van C57BL/6 volwassen muizen tonen we het protocol voor spierdissectie en vezelisolatie en demonstreren we de geschiktheid van de vezels voor Ca2+ transiënte studies en hun morfometrische karakterisering. De vezeltypesamenstelling van de spieren wordt ook gepresenteerd. Wanneer ze gedissocieerd zijn, worden alle spieren intact, levende vezels die langer dan 24 uur stevig samentrekken. FDB gaf korte (<1 mm), peroneus digiti quarti (PDQA) en peroneus longus (PL) gaven intermediair (1-3 mm), terwijl extensor digitorum longus (EDL), extensor hallucis longus (EHL) en soleus-spieren lange (3-6 mm) vezels vrijgaven.
Bij opname met de snelle kleurstof Mag-Fluo-4 vertoonden Ca2+ transiënten van PDQA-, PL- en EHL-vezels de snelle, smalle kinetiek die doet denken aan de morfologie type II (MT-II), waarvan bekend is dat deze overeenkomt met type IIX- en IIB-vezels. Dit komt overeen met het feit dat deze spieren meer dan 90% van type II-vezels bevatten in vergelijking met FDB (~80%) en soleus (~65%). Als we verder gaan dan FDB, demonstreren we voor het eerst de dissociatie van verschillende spieren, waardoor vezels ontstaan die een bereik van lengtes tussen 1 en 6 mm overspannen. Deze vezels zijn levensvatbaar en geven snelle Ca2+ transiënten, wat aangeeft dat de MT-II kan worden gegeneraliseerd naar IIX en IIB snelle vezels, ongeacht hun spierbron. Deze resultaten vergroten de beschikbaarheid van modellen voor volwassen skeletspierstudies.

Sarcoplasmatische Ca2+ concentratie tijdens een spiertrekkingen Om de haalbaarheid van fysiologische experimenten in de set van gedissocieerde vezels aan te tonen en om onze eerdere bevindingen over excitatie-contractiekoppeling (ECC) en vezeltypes uit te breiden, werden Ca2+ transiënten verworven in vezels van alle spieren. Ten eerste vertoonden FDB (n = 5) en EDL (n = 7) eenCa 2+-kinetiek die bekend staat als morfologietype II (MT-II). Dit zijn snelle, stekelige sign...

We beschrijven een protocol om enzymatisch gedissocieerde vezels van verschillende lengtes en typen te verkrijgen uit zes spieren van volwassen muizen: drie daarvan zijn al beschreven (flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) en drie van hen zijn voor het eerst met succes gedissocieerd (extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

Intacte korte, tussenliggende en lange skeletspiervezels verkregen door enzymatische dissociatie van zes achterpootspieren van muizen: voorbij flexor digitorum brevis

Skeletal muscle fibers obtained by enzymatic dissociation of mouse muscles are a useful model for physiological experiments. However, most papers deal ...

In deze studie beschrijven we een methode om vezels van verschillende lengtes en typen te isoleren uit zes achterpootspieren van muizen. Ook testten we de geschiktheid van de vezels voor fysiologische experimenten die te maken hadden met de studie van het excitatie-contractiekoppelingsmechanisme. Jarenlang was het verkrijgen van lange spiervezels een uitdaging, waardoor de reikwijdte van veel onderzoeken in het veld werd beperkt.Nu laten we zien dat het mogelijk is om magere vezels te verkrijgen met muisflexoren, extensoren en evertors met lengtes tot zes millimeter. Door bijvoorbeeld vezels uit zes verschillende spieren te verkrijgen, hebben we kunnen aantonen dat de calciumtransiënte kinetiek die bekend staat als morfologie type II, kan worden gegeneraliseerd naar type IIB en IIX, ongeacht de locatie of functie van hun spierbron. Wij zijn van mening dat het model van enzymatisch geïsoleerde vezels geschikt is voor een verscheidenheid aan experimentele benaderingen met verschillende soorten technologieën die ons in staat stellen mechanistische vragen te beantwoorden binnen het bereik van biochemie, fysiologie, biofysica, celbiologie en moleculaire biologie.

intact-short-intermediate-long-skeletal-muscle-fibers-obtained

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Myo-mechanische analyse van geïsoleerde Skeletal Muscle

We beschrijven een methode om direct te meten spierkracht, spierkracht, contractiele kinetiek en vermoeidheid van geïsoleerde skeletspieren in...

Ex Vivo Beoordeling van contractiliteit, vermoeidheid en alternantie in geïsoleerde skeletspieren

This video demonstrates the isolation of single myofibres from harvested murine Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle. The isolated myofibres can be cultured to study myofiber-associated muscle stem cell activity.

Myofiber Isolation: A Technique to Obtain Single Myofibers from Harvested Mouse Extensor Digitorum Longus (EDL) Muscle

We presenteren gedetailleerde protocollen voor het uitvoeren van Small-angle röntgendiffractie experimenten met behulp van intact muis skeletspieren. Met de brede beschikbaarheid van transgene muismodellen voor menselijke ziekten, kan dit experimentele platform een nuttig testbed vormen om de structurele basis van genetische spierziekten te...

Röntgendiffractie van intact Murine skeletspieren als een instrument voor het bestuderen van de structurele basis van spierziekte

Hier stellen we een methode voor om efficiënt te verkrijgen enkele spiervezels in de vroege postnatale ontwikkelingsstadia van homozygoot mutant Lamin Δ8-11 muis model, een zeer ernstig model voor Emery-Dreifuss spierdystrofie (EDMD).

Single Myofiber isolatie en cultuur van een Murine Model van Emery-Dreifuss Spierdystrofie in de vroege post-natale ontwikkeling

Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor mitochondriale isolatie van de skeletspieren van muizen en de daaropvolgende analyse van ademhaling door oxygen consumption rate (OCR) met behulp van op microplaten gebaseerde respirometrische assays. Deze pijplijn kan worden toegepast om de effecten van meerdere omgevings- of genetische interventies op het mitochondriale metabolisme te bestuderen.

Isolatie van mitochondriën uit de skeletspieren van muizen voor respirometrische assays

De skeletspierfunctie kan worden beoordeeld door de contractiliteit van geïsoleerde spiervezels te kwantificeren, traditioneel met behulp van bewerkelijke benaderingen met een lage doorvoer. Hier beschrijven we een op optica gebaseerde, high-throughput methode om de contractiliteit van hydrogel-ingebedde spiervezels te kwantificeren. Deze aanpak heeft toepassingen voor geneesmiddelenscreening en therapeutische ontwikkeling.

High-throughput contractiele metingen van hydrogel-ingebedde intacte muisspiervezels met behulp van een op optica gebaseerd systeem

Dit protocol heeft tot doel interstitiële extracellulaire blaasjes (SkM-EV's) van skeletspieren te isoleren en te zuiveren uit spierweefsel van knaagdieren door middel van mechanische onthechting, enzymatische dissociatie, filtratie en differentiële ultracentrifugatie. Het toont consistentie en betrouwbaarheid. De geïsoleerde SkM-EV's geven inzicht in spierhomeostase en -ziekten, met mogelijke toepassingen als diagnostische biomarkers of therapeutische voertuigen.

Enzymatische isolatie van interstitiële extracellulaire blaasjes van skeletspieren

Dit protocol biedt een gestandaardiseerde methode voor het isoleren en verrijken van primaire myoblasten uit volwassen en neonatale muisskeletspieren via weefseldissociatie, sequentiële filtratie, preplating en gedefinieerde kweekcondities, waardoor de opbouw en het onderhoud van satellietcel-afgeleide myoblastkweken mogelijk is voor latere experimentele toepassingen.

Isolatie van skeletspiersatellietcellen voor in vitro myogenesestudies

Dit protocol beschrijft de isolatie van intacte enkele spiervezels uit de oxidatieve soleus en het vestigen van sterk gezuiverde myoblastculturen afkomstig van deze vezels. De geoptimaliseerde procedure levert betrouwbaar ongeveer 300–500 intacte myovezels per muis op, waardoor downstream moleculaire en cellulaire analyses mogelijk zijn.

Isolatietest voor één vezel voor de beoordeling van oxidatieve myovezelgedrag

Leer een methode voor enzymatische dissociatie van intacte korte, tussenliggende en lange skeletspiervezels uit zes achterpootspieren van muizen. Dit protocol ondersteunt fysiologisch onderzoek naar excitatie-contractiekoppeling.

Intacte korte, tussenliggende en lange skeletspiervezels verkregen door enzymatische dissociatie van zes achterpootspieren van muizen: voorbij flexor digitorum brevis (Video) | JoVE Journal

Intacte korte, tussenliggende en lange skeletspiervezels verkregen door enzymatische dissociatie van zes achterpootspieren van muizen: voorbij flexor digitorum brevis

Meer video's verkennen