Name: Bereiding van een eencellige suspensie uit halsslagaders van muizen voor eencellige sequencing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T13:25:00.000+00:00
Duration: 4 min 21 s
Description: Leer een tweestaps celverdrijvingsprotocol voor muizenhalsslagaders om hoogwaardige eencellige suspensies te verkrijgen. Deze methode verbetert celviabiliteit en ondersteunt cardiovasculair onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Natural Science Foundation of China (82070450 aan C.T. en 82170466 aan L.Z.) en de fellowship van China Postdoctoral Science Foundation (7121102223 aan F.L.).

Alle hieronder beschreven dierproeven zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van Soochow University.
1. Reagentia en materiaalvoorbereiding
<ol><li>Gebruik 1x PBS zonder calcium en magnesium en 2,5 E/ml heparinenatriumzout om de perfusieoplossing te bereiden. Bewaren bij 4 °C en bij gebruik voorkoelen op ijs.</li>
	<li>Bereid dissociatiereagens A dat 125 CDU/ml collagenase II en 60 E/ml DNase I bevat door 1250 CDU/ml collagenase II en 3000 E/ml DNase I te verdunnen met HBSS. Bewaren bij 4 °C tot gebruik.</li>
	<li>Bereid dissociatiereagens B met een eindconcentratie van 0,12% trypsine door 1 ml 0,25% EDTA-vrij trypsine (zonder fenolrood) te verdunnen tot 1 ml 1x PBS. Bewaren bij 4 °C tot gebruik.</li>
	<li>Bereid 10 ml 1,5% FBS en 10 ml 5% FBS in 1x PBS. Gebruik 1,5% FBS om de halsslagaders te bundelen en bewaar het voor gebruik op ijs. Gebruik 5% FBS om de spijsvertering te neutraliseren en bewaar bij kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>Koop de experimentele materialen, waaronder spuiten van 1 ml, spuiten van 20 ml met naalden van 26 G, celkweekplaten met zes putjes, centrifugebuisjes van 1,5 ml, steriele celzeven van 40 μm en ijscontainers.</li>
</ol>2. Voorbereiding van de apparatuur
<ol><li>Steriliseer alle chirurgische apparatuur, inclusief een stereoscopische microscoop, ontleedschaar, micro-ontleedschaar en pincet met fijne punt.</li>
	<li>Schakel de geautomatiseerde celteller in en houd deze op RT.</li>
	<li>Zet het waterbad van tevoren aan op 37 °C.</li>
	<li>Koel de microcentrifuge voor gebruik af tot 4 °C.</li>
</ol>3. Isolatie van de halsslagader van de muis
<ol><li>Verdoof de muis met 1,25% tribroomethanol door middel van intraperitoneale injectie (0,24 ml voor elke 10 g lichaamsgewicht) en draai de muis om om te controleren of er na 3 minuten een oprichtende reflex is. Euthanaseer vervolgens de muis door cervicale dislocatie en leg hem op zijn rug. Spray de huid van de muis in met 75% alcohol.</li>
	<li>Gebruik een gesteriliseerde ontleedschaar om de huid te openen en de borstholte bloot te leggen. Snijd het diafragma open.</li>
	<li>Blijf omhoog snijden naar de onderkaak en verwijder voorzichtig overtollig bindweefsel en vet, waardoor de halsslagader bloot komt te liggen.</li>
	<li>Snijd de inferieure vena cava van de muis door om het bloed uit de gesloten bloedsomloop te laten stromen.</li>
	<li>Injecteer langzaam en continu 20 ml voorgekoelde perfusieoplossing in de linker hartkamer met een spuit. OPMERKING: Als de perfusie succesvol is, zullen bloedrijke organen zoals de lever, milt en nieren grijswit worden.</li>
	<li>Verwijder al het vet en bindweefsel rond de halsslagader met een micro-ontleedschaar onder een stereoscopische microscoop. NOTITIE: Deze stap moet langzaam en voorzichtig worden uitgevoerd om schade aan de halsslagader te voorkomen.</li>
	<li>Isoleer de halsslagader van de muis, was met 1x PBS om het bloed opnieuw te spoelen en breng over naar platen met zes putjes die 1,5% FBS op ijs bevatten.</li>
</ol>4. Vertering van de halsslagader tot eencellige suspensie
<ol><li>Gebruik een micro-ontleedschaar om de halsslagader in de lengterichting te ontleden en leg plat in een andere celkweekplaat met 6 putjes die 1 ml 1,5% FBS op ijs bevat.</li>
	<li>Spoel de intima voorzichtig met 1,5% FBS om het resterende bloed te verwijderen. OPMERKING: Het spoelen moet voorzichtig en langzaam zijn om beschadiging van endotheelcellen te voorkomen.</li>
	<li>Knip elke halsslagader in ongeveer 2 mm2 stukjes weefsel met behulp van een microontleedschaar in 1,5% FBS.</li>
	<li>Breng deze weefselstukjes over in een centrifugebuis van 1,5 ml met tips van 1 ml met een brede boring, centrifugeer op 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om de weefsels naar de bodem te laten zinken.</li>
	<li>Gooi het supernatans weg en resuspendeer de weefsels in 500 μl dissociatiereagens A.</li>
	<li>Plaats de tube gedurende 1 uur in een waterbad van 37 °C. Pipetteer voorzichtig met een pipet van 1 ml om de 10 minuten.</li>
	<li>Voeg 500 μL 5% FBS toe aan de tube en meng goed met een pipet van 1 ml.</li>
	<li>Filtreer de celsuspensie door een steriele celzeef van 40 μm in een nieuwe centrifugebuis van 1,5 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 400 x g.</li>
	<li>Verwijder het supernatans voorzichtig en resuspendeer de celpellet in 200 μl dissociatiereagens B.</li>
	<li>Plaats in een waterbad van 37 °C en verteer nog eens 5 minuten. Pipetteer tijdens de spijsvertering elke 2 minuten voorzichtig om volledig te dissociëren in een eencellige suspensie.</li>
	<li>Gebruik 200 μL 5% FBS om de verteringsreactie te beëindigen en centrifugeer op 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Gooi het supernatans weg en resuspendeer de celpellet in 100 μL 1x PBS op ijs.</li>
</ol>5. Onderzoek naar celsuspensie en sequencing van eencellig RNA
<ol><li>Voeg 10 μL AO/PI-oplossing toe aan 10 μL eencellige suspensie en meng voorzichtig met een pipet van 20 μL.</li>
	<li>Pipetteer 20 μL van het mengsel in de kamer, schuif en wacht 1 minuut.</li>
	<li>Laad het glaasje in het geautomatiseerde celtellerinstrument.</li>
	<li>Selecteer de AO/PI-levensvatbaarheidstest en wacht op het kwaliteitsrapport.</li>
	<li>Gebruik een eencellige 3ʹ-reagenskit om eencellige gelkorrels te genereren in de emulsie op een eencellige controller en amplificeer het cDNA met streepjescode in een thermische cycler volgens het protocol van de fabrikant. OPMERKING: Hier werd Chromium Single Cell 3ʹReagens Kits v3 gebruikt.</li>
	<li>Voer sequencing uit op een sequencer met een paired-end 150 bp (PE150) leesstrategie. Gebruik een softwaretoepassing (Cell Ranger) om onbewerkte basisoproepbestanden te converteren naar fastq-bestanden met behulp van de mkfastq-pijplijn . Gebruik vervolgens de Count Pipeline van Cell Ranger voor het uitvoeren van uitlijning, filtering, barcodetelling en unieke moleculaire identificatie (UMI) tellen om feature-barcodematrices13 te genereren.</li>
	<li>Voer reductie en visualisatie van gegevensdimensionaliteit uit met het R-pakket Seurat14.<ol><li>Eerst leest de Read10X() functie van Seurat de uitvoer van de Cell Ranger pipeline in en gebruikt vervolgens de count matrix om een Seurat object te maken. Filter vervolgens de cellen uit met expressie van <200 of >4000 genen of een mitochondriale genverhouding die meer dan 10% was door de subset() -functie van Seurat.</li>
		<li>Gebruik NormalizeData () en FindVariableFeatures() om de gegevens te normaliseren en respectievelijk 2000 zeer variabele functies te identificeren.</li>
		<li>Voer een hoofdcomponentanalyse (PCA) uit op de geschaalde gegevens en cluster de cellen met dims = 30 en resolutie = 0,5. Gebruik ten slotte de functie RunUMAP () om de gegevenssets met één cel te visualiseren en FindAllMarkers() om elke clusterbiomarker te vinden.</li>
	</ol></li>
</ol>

Celvertering in twee stappen van de halsslagader van muizen

<ol><li>Lee, D. -Y., Chiu, J. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis+and+flow%3A+roles+of+epigenetic+modulation+in+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis and flow: roles of epigenetic modulation in vascular endothelium.</a> Journal of Biomedical Science. 26 (1), 56(2019).</li>
<li>Libby, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis.</a> Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 56(2019).</li>
<li>Jovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+applications%3A+A+brief+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview.</a> Clinical and Translational Medicine. 12 (3), e694(2022).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+reveals+cellular+heterogeneity+of+mouse+carotid+artery+under+disturbed+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discovery%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow.</a> Cell Death Discovery. 7 (1), 180(2021).</li>
<li>Rohlenova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+maps+endothelial+metabolic+plasticity+in+pathological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing maps endothelial metabolic plasticity in pathological angiogenesis.</a> Cell Metabolism. 31 (4), 862.e14-877.e14 (2020).</li>
<li>Ren, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+gained+from+single-cell+analysis+of+immune+cells+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Insights gained from single-cell analysis of immune cells in the tumor microenvironment.</a> Annual Review of Immunology. 39, 583-609 (2021).</li>
<li>Sun, H., Xu, X., Deng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+single+epithelial+cells+suspension+from+mouse+mammary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Preparation of single epithelial cells suspension from mouse mammary glands.</a> Bio-Protocol. 10 (4), e3530(2020).</li>
<li>Korin, B., Chung, J. -J., Avraham, S., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+single-cell+suspensions+of+mouse+glomeruli+for+high-throughput+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of single-cell suspensions of mouse glomeruli for high-throughput analysis.</a> Nature Protocols. 16 (8), 4068-4083 (2021).</li>
<li>Thomson, B., Quaggin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+single+cell+suspension+from+the+murine+iridocorneal+angle%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Preparation of a single cell suspension from the murine iridocorneal angle.</a> Bio-Protocol. 12 (10), e4426(2022).</li>
<li>Leale, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-stage+digestion+of+whole+murine+knee+joints+for+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage+Open%22%5BJournal%5D)">A two-stage digestion of whole murine knee joints for single-cell RNA sequencing.</a> Osteoarthritis and Cartilage Open. 4 (4), 100321(2022).</li>
<li>Hu, D., Yin, C., Mohanta, S. K., Weber, C., Habenicht, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Preparation of single-cell suspensions from mouse aorta.</a> Bio-Protocol. 6 (11), e1832(2016).</li>
<li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+lung+tissue+using+the+gentleMACS+dissociator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. 29, e1266(2009).</li>
<li>You, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+UMI-based+single-cell+RNA-seq+preprocessing+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Benchmarking UMI-based single-cell RNA-seq preprocessing workflows.</a> Genome Biology. 22 (1), 339(2021).</li>
<li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+integration+of+single-cell+data%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive integration of single-cell data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li>
<li>Depuydt, M. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microanatomy+of+the+human+atherosclerotic+plaque+by+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics.</a> Circulation Research. 127 (11), 1437-1455 (2020).</li>
<li>Gao, X. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+of+the+rat+carotid+arteries+uncovers+potential+cellular+targets+of+neointimal+hyperplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing of the rat carotid arteries uncovers potential cellular targets of neointimal hyperplasia.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 75152(2021).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+the+lumen+of+mouse+carotid+arteries+for+single-cell+multi-omics+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. 176, e63128(2021).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de bereiding van een hoogwaardige eencellige suspensie uit de halsslagader van wildtype muizen, waarin een tweestaps verteringsmethode werd geconstrueerd die het verteringsproces van collagenase/DNase en trypsine integreert. Na de kwaliteitscontrole van de eencellige suspensie stelden we vast dat deze voldeed aan de vereisten voor sequencing van één cel, met een levensvatbaarheid van cellen van meer dan 85% en een hoge celconcentratie. Bovendien werden verschillende celtypen in de halsslagader, waaronder VSMC's, fibroblasten, EC's en Mφ/DC's, met succes gedetecteerd na verwerking van eencellige gegevens.
De huidige methoden voor het bereiden van eencellige suspensies in de halsslagader zijn nog steeds schaars. Depuydt et al. verkregen een eencellige suspensie uit plaques van de menselijke halsslagader door collagenase, DNase, humaan albuminefractie V en flavopiridol te combineren bij 37 °C gedurende 30 min15. Na fluorescentie-geactiveerde celsortering identificeerden ze 14 verschillende celpopulaties, waaronder endotheelcellen, gladde spiercellen, mestcellen, B-cellen, myeloïde cellen en T-cellen15. Bovendien verteerden onderzoekers de halsslagaders van ratten met 0,25% trypsine-EDTA en 0,1% collagenase bij 37 °C en voerden ze met succes single-cell RNA-sequencinguit 16. Vijf celtypen, waaronder VSMC's, fibroblasten, EC's, overgangscellen en macrofagen, werden geïdentificeerd in zowel normale als experimentele halsslagaders16. Daarnaast is er ook een protocol opgesteld voor het verkrijgen van EC-verrijkte eencellige preparaten van de halsslagader17. Na voltooiing van de luminale enzymatische vertering, zal het spoelen van de halsslagader voldoende eencellige pellets verkrijgen voor scRNAseq en scATACseq17. Om de verteringstijd flexibel te regelen, ontwikkelden we een tweestaps verteringsmethode voor halsslagaders van muizen, waarbij de stappen van weefseldissociatie en eencellige suspensiebereiding worden gescheiden. Het proces begint met 125 CDU/ml collagenase II en 60 E/ml DNase I gedurende 1 uur, gevolgd door EDTA-vrij trypsine gedurende 5 minuten. Het is veelbetekenend dat we elke stap van de methode voor de vertering van andere bloedvatweefsels op de juiste manier kunnen wijzigen op basis van de kenmerken van bloedvaten.
Er zijn enkele beperkingen aan de beschreven methode. Ten eerste weten we niet of deze methode kan worden gebruikt voor primaire celkweek in vitro. Omdat de wand van de halsslagader dunner is en minder cellen heeft, is het een uitdaging om in vitro te kweken en uit te breiden. Ten tweede vereist dit protocol, in tegenstelling tot andere verteringsmethoden, zacht pipetteren om cellen tijdens de spijsvertering te dissociëren. Een schudwaterbad kan ook resulteren in een eencellige suspensie van goede kwaliteit. Ten derde, aangezien onze methode toepasbaar is op normale halsslagaders, moet nog worden onderzocht of deze geschikt is voor de vertering van halsslagaderplaque.
Tot slot hebben we een tweestaps verteringsmethode ontworpen om een hoogwaardige eencellige suspensie te verkrijgen uit de halsslagader van wildtype muizen. Dit protocol kan worden gebruikt om eencellige suspensies te bereiden voor andere vaten met kleine aanpassingen, waardoor het zeer nuttig is in cardiovasculair onderzoek.

Atherosclerose is een chronische ontstekingsziekte die gepaard gaat met risicofactoren zoals hoge bloeddruk, hyperlipidemie en hemodynamica. Bifurcaties van de halsslagader zijn vatbaar voor hemodynamische veranderingen en leiden tot de vorming van plaque in de halsslagader. De klinische presentatie van atherosclerose van de halsslagader kan acuut zijn, zoals beroerte en voorbijgaande cerebrale ischemie, of chronisch, zoals recidiverende voorbijgaande cerebrale ischemie en vasculaire dementie2. Mechanisch gezien is halsslagaderplaque het resultaat van de interactie tussen verschillende vaatwandcellen en verschillende bloedcellen onder pathologische omstandigheden. Daarom is het onthullen van de eencellige atlas van halsslagaders onder fysiologische en pathologische omstandigheden bijzonder belangrijk voor het voorkomen en behandelen van de ontwikkeling van halsslagaderplaques.
Single-cell RNA-sequencing is een van de krachtigste technologieën van biologisch onderzoek vanwege de ultrahoge resolutie en detectie van celheterogeniteit van hetzelfde celtype organismen 3,4. Onderzoekers hebben single-cell RNA-sequencing gebruikt om onderzoek te doen op vele gebieden, zoals hart- en vaatziekten5 en kanker6. Het snel en nauwkeurig scheiden van weefsels in afzonderlijke cellen is echter nog steeds een van de grootste uitdagingen. Enzymatische dissociatie is een veelgebruikte methode die voornamelijk collagenase, papaïne, trypsine, DNase en hyaluronidase omvat. In het bijzonder zijn collagenasen de belangrijkste enzymsoorten voor de vertering van eencellige cellen, voornamelijk hydrolyserende collageencomponenten in bindweefsels. Verschillende soorten collagenase zijn toepasbaar voor de dissociatie van verschillende weefsels, zoals de borstklier7, glomerulus8, iridocorneale hoek9, kniegewricht 10, aorta11 en long12. Vanwege de unieke fysiologische eigenschappen van verschillende weefsels, kan dissociatie met dezelfde methode veel problemen veroorzaken bij het verkrijgen van afzonderlijke cellen, zoals een lage levensvatbaarheid van cellen, een laag aantal cellen en groot celafval. Daarom is de uitvinding van verteringsmethoden voor verschillende weefsels essentieel voor het bereiden van hoogwaardige eencellige suspensies.
Dit protocol heeft tot doel een tweestaps celverteringsmethode te ontwikkelen om een eencellige suspensie van de halsslagader van wildtype muizen te bereiden. Volgens de kenmerken van de halsslagader hebben we collagenase/DNase gecombineerd met trypsine om een hoogwaardige eencellige suspensie van de halsslagader van de muis te verkrijgen, omdat collagenase collageen van de halsslagaderweefsels kan hydrolyseren, dat verder werd verteerd door trypsine tot een eencellige suspensie. Acridine oranje/propidiumjodide (AO/PI) dubbele fluorescentietelling werd gebruikt om de levensvatbaarheid en concentratie van cellen te detecteren, en er werd vastgesteld dat de eencellige suspensie voldeed aan de vereisten voor sequencing van één cel, met een levensvatbaarheid van cellen van meer dan 85% en een hoge celconcentratie. Na verwerking van eencellige gegevens werden vier celtypen, waaronder vasculaire gladde spiercellen (VSMC's), fibroblasten, endotheelcellen (EC's) en macrofagen en dendritische cellen (Mφ/DC's), geïdentificeerd in normale halsslagaders van muizen na vertering. De voordelen van dit protocol zijn dat: 1) meerdere celtypen in de halsslagader kunnen worden geïdentificeerd, 2) de levensvatbaarheid van de cellen goed behouden blijft en 3) het gemakkelijk kan worden herhaald zonder speciale apparatuur. Dit protocol is geschikt voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van eencellige multiomics van de halsslagaders van muizen. Dit protocol kan ook nuttig zijn bij de dissociatie van andere bloedvaten met de juiste aanpassingen.

<table><tbody><tr><td>0.25% EDTA-vrije trypsine</td><td>Beyotime</td><td>C0205</td><td>Verdun 1 mL van 0.25% EDTA-vrije trypsine tot 1 mL van 1x PBS.</td></tr><tr><td>0.9% NaCl zoutoplossing</td><td>Beyotime</td><td>ST341</td><td>Verdun de heparine-natriumoplossing tot een eindconcentratie van 10 mg/mL</td></tr><tr><td>1 mL spuiten</td><td>&nbsp;SKJYLEAN</td><td>sk-r009</td><td>Voor het uitvoeren van hartperfusie</td></tr><tr><td>1.5 mL centrifugebuizen</td><td>KIRGEN</td><td>KG2211W</td><td>Om het weefselstuk en de celsuspensie te centrifugeren</td></tr><tr><td>20 mL spuiten</td><td>SKJYLEAN</td><td>sk-r013</td><td>Voor het uitvoeren van hartperfusie</td></tr><tr><td>40 &micro;m celzeef</td><td>JETBIOFIL</td><td>css010040</td><td>Om onverteerde weefselfragmenten te filteren</td></tr><tr><td>AO/PI kit</td><td>Hengrui Biological</td><td>RE010212</td><td>Om te identificeren of de cel levend of dood is</td></tr><tr><td>Automatische celteller</td><td>Countstar</td><td>Mira FL</td><td>Om de celmorfologie en celviabiliteit van verteerde carotide vasculaire cellen te analyseren</td></tr><tr><td>Cell Ranger software</td><td>10&times; Genomics</td><td>3.0.2</td><td>Om Chromium single-cell RNA-seq-uitvoer te verwerken en clustering en genexpressieanalyse uit te voeren</td></tr><tr><td>Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3</td><td>10&times; Genomics</td><td>1000075</td><td>Om single-cell RNA-seq bibliotheken van single-cell suspensie voor te bereiden</td></tr><tr><td>Collageenase II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td>Verdun met HBSS tot een eindconcentratie van 125 CDU/mL</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I</td><td>Worthington</td><td>LS002140</td><td>Verdun met HBSS tot een eindconcentratie van 60 U/mL</td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum&nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30088.03</td><td>Beëindiging van de verteringsreactie</td></tr><tr><td>Hank's evenwichtige zout oplossing&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td>Bewaar bij kamertemperatuur</td></tr><tr><td>Heparine natriumzout</td><td>Solarbio Life Science</td><td>H8060</td><td>Verdun met 0.9% NaCl tot een eindconcentratie van 10 mg/mL</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002560</td><td>Toegepast voor het neerzetten van de weefsels en celpelletten</td></tr><tr><td>NovaSeq 6000&nbsp;</td><td>Illumina</td><td>N/A</td><td>Sequencer</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>Solarbio Life Science</td><td>P1000</td><td>Gebaat voor hartperfusie en herophanging van cellen</td></tr><tr><td>Seurat pakket - R</td><td>Satija Lab</td><td>3.1.2</td><td>Om dimensionaliteitsreductie, visualisatie en analyse van scRNA-sequencing data uit te voeren</td></tr><tr><td>Zes-wells cel kweek platen</td><td>NEST</td><td>703002</td><td>Plaats het vasculaire weefsel</td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>Jinghong</td><td>DK-S22</td><td>Houd de verteringstemperatuur op 37 &deg;C</td></tr></tbody></table>

bereiding van een eencellige suspensie uit halsslagaders van muizen voor eencellige sequencing

Preparation of a Single-Cell Suspension from Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Sequencing

Halsslagaders zijn belangrijke bloedvaten in de nek die bloed en zuurstof naar de hersenen voeren, maar halsslagaderstenose treedt op wanneer halsslagaders verstopt zijn door plaque. Het onthullen van de cellulaire samenstelling van de halsslagader op het niveau van één cel is essentieel voor de behandeling van atherosclerose van de halsslagader. Er is echter geen kant-en-klaar protocol voor de bereiding van eencellige suspensies uit halsslagaders. Om een geschikt protocol te verkrijgen voor de dissociatie van normale halsslagaders op het niveau van één cel met minder schade aan cellen, ontwierpen we een verteringsmethode in twee stappen door het verteringsproces van collagenase/DNase en trypsine te integreren. Acridine oranje/propidiumjodide (AO/PI) dubbele fluorescentietelling werd gebruikt om de levensvatbaarheid en concentratie van cellen te detecteren, en er werd vastgesteld dat de eencellige suspensie voldeed aan de vereisten voor sequencing van één cel, met een levensvatbaarheid van cellen van meer dan 85% en een hoge celconcentratie. Na verwerking van gegevens met één cel werd een mediaan van ~2500 transcripten per cel gedetecteerd in elke cel van de halsslagader. Met name een verscheidenheid aan celtypen van de normale halsslagader, waaronder vasculaire gladde spiercellen (VSMC's), fibroblasten, endotheelcellen (EC's) en macrofagen en dendritische cellen (Mφ/DC's), waren gelijktijdig detecteerbaar. Dit protocol kan worden toegepast om een eencellige suspensie van bloedvaten uit andere weefsels te bereiden met de nodige aanpassingen.

Dit protocol beschrijft een tweestaps celverteringsmethode voor het bereiden van een eencellige suspensie van halsslagaders van muizen (Figuur 1). Deze tweestaps celverteringsmethode combineert collagenase/DNase met trypsine om de vasculaire wand van de halsslagader van de muis effectief te dissociëren om hoogwaardige eencellige suspensies te verkrijgen voor sequencing van één cel. Na dissociatie werden de celconcentratie en cellevensvatbaarheid berekend door een geautomatiseerde celteller. Het heldere veld toonde de morfologie van halsslagadervasculaire cellen na vertering, en AOPI dual-fluorescentiekleuring detecteerde tegelijkertijd de levensvatbaarheid van de cellen (Figuur 2A,B). Met name in vergelijking met het gebruik van dissociatiereagens A alleen, kan halsslagaderweefsel grondiger worden gedissocieerd in combinatie met dissociatiereagens B. We vonden verder een levensvatbaar celgetal van negen slagaders, en de gemiddelde celdiameter voldeed aan de vereisten van eencellige sequencing na celvertering in twee stappen (Figuur 2C). Ondertussen werden in totaal 176.000 afzonderlijke cellen verzameld uit negen linker halsslagaders, en de meeste vasculaire vaten werden gedissocieerd in enkele cellen met een hoge levensvatbaarheid (Figuur 2C).
Na uitlijning, filtering, barcodetelling en UMI-telling werden de ruwe gegevens van single-cell sequencing geanalyseerd met het R-pakket Seurat. De verdeling van genen per cel, UMI per cel en mitochondriale lezingen per cel worden weergegeven in vioolplots (Figuur 3A-C). Met name werd een mediaan van ~ 2500 transcripten per cel gedetecteerd in elke halsslagadercel. Na het verwijderen van de cellen van lage kwaliteit werden 14.580 cellen gedetecteerd en gebruikt voor stroomafwaartse single-cell RNA-seq-analyse. Met behulp van 2000 variabele genen met vergelijkbare profielen, toonde ongecontroleerde Seurat-gebaseerde clustering vier hoofdceltypen, waaronder VSMC's (74,0%), fibroblasten (16,5%), EC's (6,5%) en Mφ/DC's (3,0%), in normale halsslagaders van muizen na spijsvertering (Figuur 3D-F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65863/65863fig01.jpg"> Figuur 1: Schematisch diagram van de spijsvertering van de halsslagader van muizen. Nadat de halsslagader van de muis was geïsoleerd en doorgesneden, werd 500 μL dissociatiereagens A toegevoegd om de halsslagader van de muis te dissociëren. Toen de celsuspensie werd gefilterd en gecentrifugeerd, werd 200 μL dissociatiereagens B toegevoegd voor verdere dissociatie om een eencellige suspensie te verkrijgen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65863/65863fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65863/65863fig02.jpg"> Figuur 2: Eencellig suspensiepreparaat uit de halsslagader van muizen . (A) De celmorfologie en cellevensvatbaarheid van halsslagadercellen na 1 uur vertering met dissociatiereagens A worden weergegeven in het heldere veldbeeld en de AOPI-kleuring. Kerncellen gekleurd met groene fluorescentie zijn levende cellen, terwijl cellen gekleurd met rode fluorescentie dode cellen zijn. Schaalbalk = 100 μm. (B) De celmorfologie en cellevensvatbaarheid van halsslagadercellen na celvertering in twee stappen worden weergegeven in het heldere veldbeeld en de AOPI-kleuring. Kerncellen gekleurd met groene fluorescentie zijn levende cellen, terwijl cellen gekleurd met rode fluorescentie dode cellen zijn. Schaalbalk = 100 μm. (C) De levensvatbaarheid van de cel, het totale aantal cellen, het aantal levensvatbare cellen en de gemiddelde celdiameter werden gemeten na celvertering in twee stappen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65863/65863fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65863/65863fig03.jpg"> Figuur 3: Standaard kwaliteitscontrole (QC) metriek voor scRNA-seq en het cellandschap van de halsslagader. (A) Vioolgrafieken die de verdeling van genen per cel (nFeature RNA) weergeven, (B) UMI per cel (nCount_RNA), en (C) mitochondriale lezingen per cel (procent mt) voor de scRNA-seq-gegevens. (D) Uniform manifold approximation and projection (UMAP) plot met de vier geïdentificeerde celtypen van de halsslagader. (E) Puntdiagram met de markeringen die elk type celcluster in paneel D definiëren. De grootte van elke cirkel geeft het celaandeel aan binnen de groep die elk transcript uitdrukt. De blauwe stippen duiden op genen met een hoge expressie en de grijze stippen op genen met een lage expressie. (F) Gestapelde staafdiagram die de relatieve abundantie weergeeft van de vier celtypen gedetecteerd door scRNA-seq van wildtype muizen (WT). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65863/65863fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Hier beschrijven we een tweestaps celverteringsprotocol voor het bereiden van een eencellige suspensie van de halsslagaders van muizen.

Bereiding van een eencellige suspensie uit halsslagaders van muizen voor eencellige sequencing

Carotid arteries are major blood vessels in the neck that supply blood and oxygen to the brain, but carotid stenosis occurs when carotid arteries are ...

Lage oplosbaarheid en de debriefing van grotere cellen zijn de belangrijkste problemen bij dissociatie van vasculaire weefsels. Onze tweetraps of verteringsmethode is zeer geschikt voor dissociatie van halsslagaderweefsel en kan worden gebruikt om eencellige vermoedens voor andere bloedvaten met kleine aanpassingen voor te bereiden, waardoor het zeer nuttig is bij cardiovasculair onderzoek. Dit protocol is geschikt voor het verkrijgen van meerdere celtypen in de halsslagader en kan gemakkelijk worden herhaald zonder speciale apparatuur.In de toekomst willen we celsubklassen die zijn ontdekt door eencellige ionensequencing gebruiken voor gerichte therapie van hart- en vaatziekten.

preparation-single-cell-suspension-from-mouse-carotid-arteries-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dissociëren cellen van specifiek weefsel soorten vereist specifieke parameters voor weefsel aggitation het verkrijgen van een hoog volume van levensvatbare, kweekbare cellen. De Miltenyi gentleMACS Dissociator optimaliseert deze taak met een eenvoudige, praktische protocol. In deze publicatie het gebruik van dit apparaat op nerual weefsel wordt uitgelegd.

Generatie van de Single-celsuspensies van Mouse Neural Tissue

The video demonstrates the preparation of a single-cell suspension of immune cells from a murine brain tissue. It involves enzymatic digestion to release cells from the brain tissue, followed by density gradient centrifugation to isolate the immune cells based on their densities to obtain the single-cell suspension.

Preparing a Single-Cell Suspension of Immune Cells from Murine Brain Tissue

Hier presenteren we een protocol om snel isoleren kwalitatief hoogwaardige kernen uit de verse of bevroren weefsel voor downstream massaal parallelle RNA sequencing. Wij omvatten wasmiddel-mechanische en hypotone-mechanische weefsel verstoring en cel lysis van de opties, die beide kunnen worden gebruikt voor isolatie van kernen.

Isolatie van volwassen ruggenmerg kernen voor Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

We bieden een protocol voor isolatie van Microglia uit verschillende ontleed gebieden van een volwassen muis hersen halfrond, gevolgd door semi-geautomatiseerde bibliotheek voorbereiding voor diepe eencellige RNA-sequencing van volledige lengte transcriptomes. Deze methode zal helpen om functionele heterogeniteit van Microglia in gezondheid en ziekte te verhelmaken.

Isolatie van regiospecifieke Microglia van één volwassen muis hersen halfrond voor diepe eencellige RNA-sequencing

Hier presenteerden we een multiplexed single cell mRNA sequencing methode om het profiel van genexpressie in de muis embryonale weefsels. De op droplet gebaseerde enkelvoudige cel mRNA-sequencing (scRNA-SEQ) methode in combinatie met multiplexing strategieën kan afzonderlijke cellen van meerdere monsters tegelijkertijd profiel, wat de kosten van de reagens aanzienlijk verlaagt en experimentele batch-effecten minimaliseert.

Multiplexed single cell mRNA sequentieanalyse van embryonale cellen van de muis

Het huidige protocol presenteert een snelle, efficiënte en zachte methode voor het isoleren van enkele cellen die geschikt zijn voor eencellige RNA-seq-analyse van een continu groeiende muizensnijtand, muizenkies en menselijke tanden.

Snelle isolatie van afzonderlijke cellen van muizen en menselijke tanden

We presenteren een methode voor het isoleren van endotheelcellen en kernen uit het lumen van muiscarotisslagaders die zijn blootgesteld aan stabiele of verstoorde stroomomstandigheden om eencellige omics-experimenten uit te voeren.

Isolatie van endotheelcellen uit het lumen van muisslagaders voor eencellige multi-omics-experimenten

Hier beschrijven we een protocol om een voldoende hoeveelheid enkele niet-cardiomyocyten met hoge levensvatbaarheid te isoleren uit een post-myocardinfarct (MI) muizenhart. Dit kan worden gebruikt voor daaropvolgende single-cell sequencing, flowcytometrie-analyse en primaire celcultuur.

Voorbereiding van een niet-cardiomyocytencelsuspensie voor single-cell RNA-sequencing van een post-myocardinfarct volwassen muizenhart

Hier presenteren we een protocol dat de voorbereiding van celkernen beschrijft. Na microdissectie en enzymatische dissociatie van hartweefsel in afzonderlijke cellen, werden de voorlopercellen bevroren, gevolgd door isolatie van zuivere levensvatbare cellen, die werden gebruikt voor single-nucleus RNA-sequencing en de single-nucleus assay voor transposase-toegankelijk chromatine met high-throughput sequencing-analyses.

Kernisolatie van hartvoorlopercellen van muizen voor epigenoom- en genexpressieprofilering met eencellige resolutie

Om muishersencorticale pericyten te verkrijgen die voldoen aan de eisen van scRNA-seq, presenteren we een kritisch geoptimaliseerd FACS-protocol gebaseerd op CD13/CD31⁻-selectie. Onze belangrijke verfijningen verbeteren de levensvatbaarheid van cellen en de integriteit van RNA aanzienlijk, waardoor betrouwbare transcriptomische profilering mogelijk wordt.

Isolatie van pericyten uit muiscorticaal weefsel met FACS voor single-cell sequencing

Hier presenteren we een protocol om hoogwaardige single-cell suspensies uit hele muishoornvliezen te verkrijgen via sequentiële vertering met collagenase A en trypsine. Deze methode levert levensvatbare individuele cellen met hoge RNA-integriteit op, waardoor ze compatibel zijn met downstream-toepassingen zoals single-cell RNA-sequencing en flowcytometriey.

Een protocol voor het oogsten van single-cel suspensie uit muizenhoornvliezen

Leer een tweestaps celverdrijvingsprotocol voor muizenhalsslagaders om hoogwaardige eencellige suspensies te verkrijgen. Deze methode verbetert celviabiliteit en ondersteunt cardiovasculair onderzoek.

Bereiding van een eencellige suspensie uit halsslagaders van muizen voor eencellige sequencing

Meer video's verkennen