Name: Isolatie van pure astrocyten en microglia uit het ruggenmerg van volwassen muizen voor in-vitrotests en transcriptomische onderzoeken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T12:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Leer astrocyten en microglia isoleren uit het ruggenmerg van volwassen muizen voor in-vitrotests en transcriptomisch onderzoek. Deze methode ondersteunt studies naar ruggenmergziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Castle Raley van de George Washington University Genomics Core voor RNA-analyses en Q2 Lab Solutions voor RNA-sequencing-analyses. Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Neurological Disorders and Stroke [subsidienummer F31NS117085] en de Vivian Gill Research Endowment aan Dr. Robert H. Miller. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com.

Alle dierverzorgings- en experimentele procedures werden uitgevoerd na goedkeuring van de Animal Care and Use Committee van de George Washington University School of Medicine and Health Sciences (Washington, DC, VS; IACUC#2021-004). De studie maakte gebruik van mannelijke en vrouwelijke C57BL/6J wild-type (WT) muizen in de leeftijd van 10 weken tot 5 maanden, die afkomstig waren van een commerciële leverancier (zie Tabel met materialen) en gehuisvest waren aan de George Washington University. Een overzicht van de protocolworkflow wordt weergegeven in figuur 1.
1. Voorbereiding van het ruggenmerg
<ol><li>Verdoof de dieren met Avertin (12,5 mg/ml 2,2,2-tribroomethanol en 2,5% 2-methyl-2-butanol in steriel water) (zie materiaaltabel). Bevestig de afwezigheid van een reactie op teen- en staartknijpen bij de muizen.</li>
	<li>Voer hartperfusie uit met koude 1x Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) om perifere mononucleaire bloedcellen te verwijderen.<ol><li>Leg het dier op een ondiepe bak en maak een zijdelingse incisie om de pleuraholte bloot te leggen. Steek een perfusienaald van 23 G die is aangesloten op een peristaltische pomp (zie Materiaaltabel) in de linker hartkamer en activeer de pomp. Zodra koude DPBS door het hart stroomt, maakt u een kleine incisie in het rechter atrium. OPMERKING: In deze stap wordt de voorkeur gegeven aan een snellere perfusiesnelheid om de levensvatbaarheid van de cel te verbeteren. Het bloed moet in minder dan 1 minuut worden weggespoeld. Het opruimen van de lever duidt op een succesvolle perfusie.</li>
	</ol></li>
	<li>Onthoofd het dier met een grote schaar en verwijder de wervelkolom14. Dompel het onder in koude 1x DPBS met Ca2+/Mg2+/0,2% glucose in een petrischaal op ijs voor weefselspoeling.</li>
	<li>Zorg er vanaf nu voor dat alle stappen in een steriele omgeving worden uitgevoerd. Gebruik hydraulische extrusie14 om het hele ruggenmerg te isoleren. Gebruik een naald van 18 G en een spuit van 10 ml gevuld met koude 1x DPBS met Ca2+/Mg2+/0,2% glucose. Breng het ruggenmerg over naar een petrischaal die op ijspakken is geplaatst en voldoende koude 1x DPBS met Ca2+/Mg2+/0,2% glucose bevat om het hele weefsel onder te dompelen.</li>
	<li>Verwijder de hersenvliezen voorzichtig onder een microscoop in een laminaire stroomkap. Breng het ruggenmerg over naar een lege petrischaal op ijspakken en snijd met een chirurgisch scalpel nr. 10 het hele ruggenmerg in secties van 2-3 mm.</li>
</ol>2. Enzymatische celdissociatie
<ol><li>Voeg enzymmix 1 en enzymmix 2 toe uit de in de handel verkrijgbare Adult Brain Dissociation Kit volgens het protocol van de fabrikant (zie materiaaltabel). Draai de enzymen meerdere keren in de schaal om een gelijkmatige coating van het ruggenmerg te garanderen en incubeer vervolgens gedurende 30 minuten bij 37 °C. Draai de schaal elke 5 minuten voorzichtig rond om klontering van het weefsel te voorkomen en een gelijkmatige verdeling van de reagentia te vergemakkelijken.</li>
	<li>Haal de schaal uit de incubator en voeg 350 μL 0,46 mg/ml DNAse I in Minimal Essential Medium (MEM) toe (zie Tabel met materialen). Meng door zachtjes te draaien.</li>
	<li>Voeg 1 ml koude DMEM/0,5% Fetal Bovine Serum (FBS) toe en meng door zachtjes rond te draaien. Breng de volledige inhoud onmiddellijk over in een tube van 5 ml.</li>
</ol>3. Mechanische celdissociatie
<ol><li>Gebruik een P1000-pipet om het weefsel drie keer voorzichtig te trituleren en zorg ervoor dat er elke keer stukjes weefsel worden opgezogen om het weefsel verder te dissociëren. Gebruik vervolgens een verstopte 9" glazen pasteurpipet en trituer nog vijf keer voorzichtig, zodat er tijdens het proces geen luchtbellen ontstaan.</li>
	<li>Zet de tube van 5 ml rechtop en laat het weefsel 30 seconden op de bodem bezinken. Zodra het weefsel is neergedaald, zuigt u het supernatans op met behulp van een P1000-pipet en voert u het door een filter van 30 μm in een conische buis van 15 ml.</li>
	<li>Voeg aan hetzelfde buisje van 5 ml met het resterende weefsel 1 ml koude DMEM/0,5% FBS toe. Gebruik een pasteurpipet om driemaal voorzichtig te tritugeren.</li>
	<li>Laat het weefsel 30 s op de bodem bezinken, haal het supernatans vervolgens door een filter van 30 μm en vang het op in hetzelfde buisje van 15 ml als voorheen. Herhaal stap 3.3 en stap 3.4 nog een keer.</li>
	<li>Centrifugeer de gefilterde celsuspensie bij 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT). Verwijder het resulterende supernatans voorzichtig en gooi het weg met behulp van een vacuümaspirator.</li>
</ol>4. Myeline verwijdering
<ol><li>Verwijder myeline met behulp van de puinverwijderingsoplossing (DRS) die wordt meegeleverd in de Adult Brain Dissociation Kit volgens het protocol van de fabrikant. Voeg na het verwijderen van het vuil 5 ml koude DMEM/0,5% FBS toe aan de celpellet en keer de buis voorzichtig drie keer om. Centrifugeer de celsuspensie bij 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT). OPMERKING: Als de cellen worden gebruikt voor in-vitro-onderzoeken en in kweek blijven, moet in plaats daarvan voorverwarmde DMEM/0,5% FBS worden gebruikt.</li>
	<li>Gooi het supernatans weg en resuspendeer de celpellet in 1 ml DPBS/0,5% FBS (koud voor RNA-onderzoek en warm voor in-vitrotesten ). Tel de cellen en beoordeel de levensvatbaarheid met behulp van Trypan Blue. OPMERKING: Celsuspensies van meerdere dieren kunnen worden gecombineerd om de celconcentratie te verhogen.</li>
	<li>Was de cellen door DPBS/0,5% FBS toe te voegen tot een totaal volume van 5 ml. Centrifugeer de suspensie bij 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatans weg met een pipet.</li>
</ol>5. Isolatie van microglia en astrocyten
<ol><li>Label de cellen met anti-CD11b- of anti-ACSA-2-microbeads volgens het protocol van de fabrikant (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Sorteer de cellen op positieve selectie met behulp van de MS-kolommen volgens de instructies van de fabrikant (zie Tabel met materialen). Centrifugeer na het sorteren de gesorteerde cellen gedurende 10 minuten bij 300 x g en gooi het supernatant weg.</li>
</ol>6. Plateren van cellen voor in-vitrotests
OPMERKING: Als cellen niet worden geplateerd en onmiddellijk worden gebruikt voor RNA-analyse, gaat u verder met stap 8.
<ol><li>Resuspendeer de cellen in 1 ml warme DMEM/0,5% FBS. Tel de cellen en beoordeel hun levensvatbaarheid met behulp van een hemacytometer (zie Tabel met materialen).</li>
	<li>Pas de celconcentratie aan tot 75.000 cellen per 50 μL. Voeg 50 μL van de celsuspensie toe aan elk met Poly-L-lysine gecoat dekglaasje11 in een plaat met 24 putjes.</li>
	<li>Incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C zodat de cellen zich aan het dekglaasje kunnen hechten.</li>
	<li>Voeg voorzichtig 450 μL warme DMEM/5% FBS/Penicilline-Streptomycine (Pen-Streptomycine, zie Materiaaltabel) toe aan elk putje.</li>
	<li>Vervang na 3 dagen de helft van het medium door 250 μL warme DMEM/5% FBS/Pen-Streptokokken. Vervang voor onderhoud de media om de 4-5 dagen volledig door 500 μL warme DMEM/5% FBS/Pen-Streptokokken.</li>
</ol>7. Immunohistochemie
OPMERKING: Het is het beste om immunohistochemische analyses uit te voeren na ten minste 3 dagen wanneer de media ten minste één keer zijn vervangen. Dit zorgt ervoor dat vuil is verwijderd en dat de cellen zich volledig aan het dekglaasje hebben gehecht.
<ol><li>Verwijder de media en label de cellen met anti-muis mAb O4 (1:100) (zie materiaaltabel) in warm DMEM/5% FBS/10% normaal geitenserum (NGS) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT) of bij 37 °C. OPMERKING: Sla deze stap over en ga verder met stap 7.3 als de cellen niet worden gelabeld met O4.</li>
	<li>Spoel de dekglaasjes voorzichtig af door ze driemaal in warme DMEM/5% FBS te dompelen. Voeg geit anti-muis 594 IgM (1: 300) (zie Materiaaltabel) toe in warme DMEM/5% FBS/10% NGS en incubeer bij RT gedurende 15 minuten in het donker. Spoel driemaal voorzichtig af met warme DMEM/5% FBS.</li>
	<li>Fixeer de cellen met koud 5% azijnzuur/methanol gedurende 15 minuten bij 4 °C. Was driemaal met 1x PBS en label vervolgens met het juiste antilichaam: anti-konijn GFAP (1: 500), anti-muis GFAP (1: 500) of anti-konijn Iba1 (1: 500) in 1% Triton-X100/10% NGS in 1x DPBS (zie Materiaaltabel). Incubeer gedurende 1 uur bij RT. OPMERKING: Bewaar dekglaasjes in het donker als ze al met O4 zijn bevlekt.</li>
	<li>Spoel drie keer voorzichtig met PBS. Etiket met het juiste secundaire antilichaam: anti-muis 594 IgG (1: 500), anti-konijn 488 IgG (1: 500) (zie materiaaltabel). Incubeer 30 minuten bij RT in het donker.</li>
	<li>Spoel drie keer voorzichtig met PBS. Tegenbeitsen met DAPI (1: 1000) gedurende 1 min bij RT. Spoel driemaal met PBS, voeg montagemedium toe (zie Materiaaltabel) en monteer dekglaasjes op de objectglaasjes.</li>
</ol>8. RNA-extractie
OPMERKING: Idealiter zouden er ten minste 100.000 cellen moeten zijn om voldoende RNA te extraheren voor analyse. Indien nodig kunnen cellen van 2-3 ruggenmerg worden gecombineerd.
<ol><li>Extraheer RNA met behulp van een in de handel verkrijgbare RNA-isolatiekit volgens het protocol van de fabrikant (zie Materiaaltabel). Laat voor elke wasstap met de RW1-wasbuffer die in de set zit, de cellen nog 2 minuten in de wasbuffer staan.</li>
	<li>Verwijder eventueel achtergebleven genoom-DNA met behulp van DNase I volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel). Incubeer met DNase bij RT gedurende 15 minuten en was daarna met RW1-buffer.</li>
	<li>Om de RNA-opbrengst te verhogen, incubeert u de monsters voorafgaand aan de elutie gedurende 10 minuten in RNAse-vrij water bij RT. Beoordeel de integriteit en hoeveelheid van RNA met behulp van een bioanalysator15 (zie Tabel met materialen).</li>
</ol>

Efficiënte extractie van astrocyten en microglia uit het ruggenmerg van volwassen muizen

<ol><li>Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nat Rev Neurosci. 7, 41-53 (2006).</li>
<li>Heithoff, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+are+necessary+for+blood-brain+barrier+maintenance+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain.</a> Glia. 69 (2), 436-472 (2021).</li>
<li>Badimon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+feedback+control+of+neuronal+activity+by+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Negative feedback control of neuronal activity by microglia.</a> Nature. 586, 417-423 (2020).</li>
<li>Yanuck, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+phagocytosis+of+neurons%3A+diminishing+neuronal+loss+in+traumatic%2C+infectious%2C+inflammatory%2C+and+autoimmune+CNS+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Microglial phagocytosis of neurons: diminishing neuronal loss in traumatic, infectious, inflammatory, and autoimmune CNS disorders.</a> Front Psychiatry. 10, 712(2019).</li>
<li>Xu, Y. J., Au, N. P. B., Ma, C. H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+phenotypic+diversity+of+microglia%3A+implication+for+microglia-based+therapies+for+alzheimer%E2%80%99s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional and phenotypic diversity of microglia: implication for microglia-based therapies for alzheimer’s disease.</a> Front Aging Neurosci. 14, 896852(2022).</li>
<li>Song, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial-oligodendrocyte+interactions+in+myelination+and+neurological+function+recovery+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Microglial-oligodendrocyte interactions in myelination and neurological function recovery after traumatic brain injury.</a> J Neuroinflammation. 19 (1), 246(2022).</li>
<li>Butler, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+phagocytosis+of+neurons+in+neurodegeneration%2C+and+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Microglial phagocytosis of neurons in neurodegeneration, and its regulation.</a> J Neurochem. 158 (3), 621-639 (2021).</li>
<li>Voskuhl, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+astrocytes+form+scar-like+perivascular+barriers+to+leukocytes+during+adaptive+immune+inflammation+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reactive astrocytes form scar-like perivascular barriers to leukocytes during adaptive immune inflammation of the CNS.</a> J Neurosci. 29 (37), 11511-11522 (2009).</li>
<li>Bordon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAFG+activity+in+astrocytes+drives+CNS+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">MAFG activity in astrocytes drives CNS inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 20, 205(2020).</li>
<li>Agalave, N. M., Lane, B. T., Mody, P. H., Szabo-Pardi, T. A., Burton, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+downstream+characterization+of+primary+microglia+and+astrocytes+from+adult+rodent+brain+and+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and downstream characterization of primary microglia and astrocytes from adult rodent brain and spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 340, 108742(2020).</li>
<li>Kerstetter, A. E., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+spinal+cord+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of spinal cord astrocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 814, 93-104 (2012).</li>
<li>Hersbach, B. A., Simon, T., Masserdotti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+direct+neuronal+reprogramming+of+mouse+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes.</a> J Vis Exp. (185), 64175(2022).</li>
<li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> J Neuroinflammation. 9, 147(2012).</li>
<li>Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydraulic+extrusion+of+the+spinal+cord+and+isolation+of+dorsal+root+ganglia+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents.</a> J Vis Exp. (119), e55226(2017).</li>
<li>Davies, J., Denyer, T., Hadfield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioanalyzer+chips+can+be+used+interchangeably+for+many+analyses+of+DNA+or+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Bioanalyzer chips can be used interchangeably for many analyses of DNA or RNA.</a> Biotechniques. 60 (4), 197-199 (2016).</li>
<li>Ahn, J. J., Islam, Y., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+specific+isolation+of+primary+astrocytes+and+microglia+from+adult+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type specific isolation of primary astrocytes and microglia from adult mouse spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 375, 109599(2022).</li>
<li>Pan, J., Wan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+comparison+of+FACS+and+MACS+isolation+of+enriched+microglia+and+astrocytes+from+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain.</a> J Immunol Methods. 486, 112834(2020).</li>
<li>Neuschulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+RNA+labeling+strategy+for+measuring+stress+response+upon+tissue+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">A single-cell RNA labeling strategy for measuring stress response upon tissue dissociation.</a> Mol Syst Biol. 19, 11147(2023).</li>
<li>CB, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+brain-all+cells%3A+a+comprehensive+protocol+to+isolate+all+principal+cns-resident+cell+types+from+brain+and+spinal+cord+of+adult+healthy+and+EAE+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">One brain-all cells: a comprehensive protocol to isolate all principal cns-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice.</a> Cells. 10 (3), 1-25 (2021).</li>
</ol>

Geen

Het isoleren van zuivere, levensvatbare primaire cellen is van het grootste belang voor het onderzoeken van de structuur en functie van specifieke celtypen. Bij de volwassen muis, met name in het ruggenmerg, brengt deze taak aanzienlijke uitdagingen met zich mee, omdat bestaande protocollen vaak niet zijn afgestemd op het volwassen ruggenmerg10,17. Dit protocol biedt een efficiënte en kosteneffectieve methode die van toepassing is op verschillende stroomafwaartse...

Astrocyten en microglia zijn veelzijdige gliacellen die een vitale rol spelen in het centrale zenuwstelsel (CZS), met verantwoordelijkheden zoals het reguleren van de neuronale functie, het bijdragen aan de ontwikkeling van het CZS, het onderhouden van de bloed-hersenbarrière en het deelnemen aan andere kritieke processen 1,2,3,4 . Naast hun rol bij het handhaven van de homeostase, spelen deze gliacellen ook een cruciale rol bij letsel- en herstelmechanismen. Microglia staan bekend om hun fagocytische, inflammatoire en migrerende eigenschappen na beledigingen of verwondingen 5,6,7. Astrocytenreacties bij ziekte zijn even divers en omvatten bijdragen aan ontstekingen, de vorming van glialittekens en het aantasten van de bloed-hersenbarrière 8,9. Hoewel ons begrip van de schadelijke en herstellende rol van microglia en astrocyten in het CZS is gegroeid, vereist de inherente heterogeniteit in zowel hun structuur als functie robuuste instrumenten om ze in verschillende contexten te bestuderen.
Om meer inzicht te krijgen in de rol van microglia en astrocyten in gezondheid en ziekte, is een gecombineerde aanpak van in vivo en in vitro onderzoek nodig. In vivo technieken maken gebruik van de ingewikkelde overspraak tussen gliacellen en neuronen in het CZS, terwijl in vitro methodologieën waardevol blijken te zijn bij het beoordelen van eencellige functies of reacties onder specifieke stimuli. Elke methode biedt unieke voordelen; In vitro studies zijn essentieel voor het begrijpen van de specifieke rollen van deze celtypen zonder directe of indirecte input van naburige cellen. Bovendien bieden in-vitrotests die gebruik maken van onsterfelijke cellijnen bepaalde voordelen, waaronder het vermogen om zich voor onbepaalde tijd te vermenigvuldigen, kostenefficiëntie en onderhoudsgemak. Het is echter belangrijk op te merken dat primaire cellen normale fysiologische reacties beter nabootsen in vergelijking met cellijnen. Deze fysiologische relevantie is cruciaal in functionele assays en transcriptomische analyses.
Een van de uitdagingen bij het verkrijgen van primaire cellen, met name uit het ruggenmerg van volwassen muizen, ligt in de hoeveelheid en levensvatbaarheid van de monsters. Het volwassen ruggenmerg, dat kleiner is dan de hersenen en een aanzienlijke hoeveelheid myeline bevat, vormt unieke moeilijkheden. Hoewel er verschillende gepubliceerde protocollen zijn die de isolatie van zuivere, levensvatbare gliacellen van neonatale dieren of de hersenen van volwassen muizen beschrijven 10,11,12,13, zijn deze methodologieën mogelijk niet geschikt voor het bestuderen van ziekten en verwondingen die specifiek zijn voor het ruggenmerg. In dit protocol bieden we een uitgebreide procedure om zuivere, levensvatbare microglia en astrocyten efficiënt te isoleren uit het ruggenmerg van volwassen muizen, waardoor stroomafwaartse toepassingen in celkweek en transcriptomische analyses worden vergemakkelijkt. Dit protocol is met succes gebruikt om deze cellen te isoleren van volwassen muizen in de leeftijd van 10 weken tot 5 maanden, wat het nut ervan in verschillende contexten aantoont, waaronder onderzoeken met voorwaardelijke knock-outmuizen, geneesmiddelreacties, ontwikkelingsonderzoek en leeftijdsgerelateerde modellen.

<table><tbody><tr><td>2,2,2-Tribromoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>24 well tissue culture plate</td><td>Avantor</td><td>10861-558</td><td></td></tr><tr><td>2-Methyl-2-butanol, 98%</td><td>Thermo Fisher</td><td>A18304-0F</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>45% glucose solution</td><td>Corning</td><td>25-037-CI</td><td></td></tr><tr><td>5 mL capped tubes</td><td>Eppendorf</td><td>30122305</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma-Adlrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Adult Brain Dissociation Kit</td><td>Miltenyi</td><td>103-107-677</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ACSA2 Microbead Kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-097-679</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Iba1</td><td>Wako</td><td>019-1974</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J wild-type (WT) mice&nbsp;</td><td>Jackson Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b (Microglia) MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-634</td><td></td></tr><tr><td>Celltrics 30 &micro;m filter</td><td>Sysmex Partec</td><td>04-004-2326</td><td></td></tr><tr><td>Counting Chamber (Hemacytometer)</td><td>Hausser Scientific Co</td><td>3200</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4527-40KU</td><td></td></tr><tr><td>Distilled water</td><td>TMO</td><td>15230001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher</td><td>11320074</td><td></td></tr><tr><td>DNase for RNA purification</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphate-buffered saline</td><td>Thermo Fisher</td><td>14040117</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Thermo Fisher</td><td>A5209401</td><td></td></tr><tr><td>GFAP antibody (mouse)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-33673</td><td>1:500</td></tr><tr><td>GFAP antibody (rabbit)</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse 594 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>a11032</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse 594 IgM</td><td>Invitrogen</td><td>a21044</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit 488 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>a11008</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Iba1 antibody (rabbit)</td><td>Wako</td><td>019-1974</td><td>1:500</td></tr><tr><td>MACS Separator</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex C/L Pump System</td><td>Thermo Fisher</td><td>77122-22</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Corning</td><td>15-015-CV</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Adlrich</td><td>439193</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000-10</td><td></td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>O4 Antibody</td><td>R&amp;D</td><td>MAB1326</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Plugged 9" glass pasteur pipette</td><td>VWR</td><td>14672-412</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10</td><td>Fisher scientific</td><td>22-079-683</td><td></td></tr><tr><td>Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm</td><td>Kawasumi</td><td>D3K2-23G</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie van pure astrocyten en microglia uit het ruggenmerg van volwassen muizen voor in-vitrotests en transcriptomische onderzoeken

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies

Astrocyten en microglia spelen een cruciale rol bij de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel, letselreacties en neurodegeneratieve ziekten. Deze zeer dynamische cellen vertonen snelle reacties op veranderingen in de omgeving en vertonen een aanzienlijke heterogeniteit in termen van morfologie, transcriptieprofielen en functies. Hoewel ons begrip van de functies van gliacellen bij gezondheid en ziekte aanzienlijk is verbeterd, blijft er behoefte aan in vitro, celspecifieke analyses die worden uitgevoerd in de context van beledigingen of verwondingen om verschillende celpopulaties volledig te karakteriseren. Het isoleren van cellen van de volwassen muis biedt verschillende voordelen ten opzichte van cellijnen of neonatale dieren, omdat het de analyse van cellen onder pathologische omstandigheden en op specifieke tijdstippen mogelijk maakt. Bovendien maakt de focus op ruggenmergspecifieke isolatie, met uitzondering van betrokkenheid van de hersenen, onderzoek mogelijk naar ruggenmergpathologieën, waaronder experimentele auto-immuunencefalomyelitis, ruggenmergletsel en amyotrofische laterale sclerose. Dit protocol biedt een efficiënte methode voor het isoleren van astrocyten en microglia uit het ruggenmerg van volwassen muizen, waardoor onmiddellijke of toekomstige analyse wordt vergemakkelijkt met mogelijke toepassingen in functionele, moleculaire of proteomische stroomafwaartse studies.

De methoden die in dit protocol worden beschreven, maken het mogelijk om zuivere en levensvatbare microglia en astrocyten uit het ruggenmerg van volwassen muizen te isoleren, waardoor verschillende stroomafwaartse toepassingen mogelijk worden, waaronder in vitro functionele of histologische assays en RNA-analyse.
Een succesvolle isolatie voor in vitro studies zal resulteren in continue celproliferatie gedurende meerdere dagen. Volwassen cellen vertonen een langzamere prolifer...

Dit protocol schetst de isolatie van gezuiverde astrocyten en microglia uit het ruggenmerg van volwassen muizen, waardoor latere toepassingen zoals RNA-analyse en celkweek worden vergemakkelijkt. Het bevat gedetailleerde methoden en procedures voor celdissociatie die zijn ontworpen om zowel de kwaliteit als de opbrengst van geïsoleerde cellen te verbeteren.

Isolatie van pure astrocyten en microglia uit het ruggenmerg van volwassen muizen voor in-vitrotests en transcriptomische onderzoeken

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic ...

Ons onderzoek heeft tot doel specifieke celpopulaties in het centrale zenuwstelsel, met name het ruggenmerg, te karakteriseren met behulp van preklinische ziektemodellen. En we proberen te bepalen hoe deze cellen worden aangetast onder pathologische omstandigheden en op verschillende tijdstippen. Het kan een uitdaging zijn om cellen te analyseren, vooral in het centrale zenuwstelsel, omdat de cellen in de hersenen en het ruggenmerg een zeer complexe matrix vormen en alles zeer nauw met elkaar verbonden is, dus het kan moeilijk zijn om deze cellen te isoleren zonder het systeem te beschadigen.Ons protocol pakt beperkingen aan in bestaande methoden voor het bestuderen van ruggenmergaandoeningen door levensvatbare microglia-astrocyten efficiënt te isoleren van het kleine myelinerijke ruggenmerg van volwassen muizen. Dit maakt in-vitro-onderzoek naar aan het ruggenmerg gerelateerde ziekten in stroomafwaartse analyse mogelijk, waarmee een cruciale onderzoekslacune wordt opgevuld. Dit protocol biedt verschillende voordelen, zoals het analyseren van astrocyten en microglia onder pathologische omstandigheden en op specifieke tijdstippen.Het richt zich ook op unieke wijze op het isoleren van gliacellen uit dit volwassen ruggenmerg alleen, met uitzondering van betrokkenheid van de hersenen. Dit stelt onderzoekers in staat om ruggenmergpathologieën op cellulair niveau te bestuderen.

isolation-pure-astrocytes-microglia-from-adult-mouse-spinal-cord-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In this video, we describe the method to obtain a pure preparation of astrocytes from newly born mice.

Astrocyte Isolation: A Method to Obtain Pure Preparation of Mouse Cortical Astrocytes

The video demonstrates a technique for isolating microglia from the cortex of an adult mouse brain. First, the cortex undergoes segmentation and homogenization to remove neurons and other glial cells, preserving microglia. Following that, the cell suspension is exposed to anti-myelin magnetic microbeads and a magnetic field, effectively separating microglia and myeloid cells from myelin debris and cells containing myelin.

Isolation of Microglia from the Cortex of an Adult Mouse Brain

Astrocyten zijn erkend als veelzijdige cellen die deelnemen in de fundamentele biologische processen die essentieel zijn voor de normale ontwikkeling van de hersenen en functies binnen het centraal zenuwstelsel repareren. Hier presenteren we een snelle procedure voor pure muis astrocyten culturen te verkrijgen om de biologie van deze belangrijke klasse van het centrale zenuwstelsel cellen te bestuderen.

Isolatie en Cultuur van de Muis Corticale Astrocyten

Een sleutel tot succesvolle onderzoek van microglia biologie is het behoud van microglia immunofunction ex vivo tijdens isolatie van CZS-weefsel. Isoleren microglia via roterende schudden resulteert in zeer zuivere en immunofunctional celculturen zoals beoordeeld door fluorescerende beeldvorming, immunocytochemie, en ELISA na microglia-activatie met de pro-inflammatoire stimuli lipopolysaccharide (LPS) en Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolatie van corticale Microglia met Conserven immunofenotype en functionaliteit van Muriene Pasgeborenen

De ontwikkeling van neuropatische pijn omvat pathologische veranderingen van het ruggenmerg gliacellen. Een betrouwbare gliale kweeksysteem afgeleid van volwassen ruggenmerg weefsel en is ontworpen voor het bestuderen van deze cellen in vitro ontbreekt. Daarom zien we hier hoe je primaire gemengde gliale culturen van volwassen muis ruggenmerg weefsel vast te stellen.

Voorbereiding van de primaire Mixed glialculturen van volwassen muis Spinal Cord Tissue

Een protocol voor de isolatie van primaire microglia vanuit lymfkliertest brains wordt gepresenteerd. Deze techniek helpt bij het bevorderen van het huidige begrip van neurologische aandoeningen. Dichtheid kleurovergang centrifugeren en magnetische scheiding worden gecombineerd om voldoende opbrengst van een zeer zuivere monster. Voorts schetsen we de stappen voor de karakterisering van microglia.

Karakterisering en isolatie van de primaire Microglia muis door dichtheid kleurovergang centrifugeren

We bieden een protocol voor isolatie van Microglia uit verschillende ontleed gebieden van een volwassen muis hersen halfrond, gevolgd door semi-geautomatiseerde bibliotheek voorbereiding voor diepe eencellige RNA-sequencing van volledige lengte transcriptomes. Deze methode zal helpen om functionele heterogeniteit van Microglia in gezondheid en ziekte te verhelmaken.

Isolatie van regiospecifieke Microglia van één volwassen muis hersen halfrond voor diepe eencellige RNA-sequencing

We hebben een methode ontwikkeld die menselijke astrocytenpopulaties verrijkt en isoleert van vers ingevroren weefsel voor gebruik in downstream moleculaire analyses.

Isolatie van volwassen menselijke astrocytenpopulaties uit versgevroren cortex met behulp van fluorescentie-geactiveerde kernensortering

Hier presenteren we een protocol om primaire microglia te isoleren en te zuiveren in diermodellen van demyeliniserende ziekten, met behulp van kolomvormige magnetisch geactiveerde celsortering.

Isolatie van primaire microglia van muizen door magnetisch geactiveerde celsortering in diermodellen van demyelinisatie

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol om sterk verrijkte culturen van astrocyten te genereren die zijn afgeleid van verschillende regio's van het centrale zenuwstelsel van postnatale muizen en hun directe omzetting in functionele neuronen door de geforceerde expressie van transcriptiefactoren.

Isolatie en directe neuronale herprogrammering van muisastryoten

Microglia worden beschouwd als enkele van de meest veelzijdige cellen in het lichaam, die in staat zijn tot morfologische en functionele aanpassing. Hun heterogeniteit en multifunctionaliteit maken het mogelijk om de homeostase van de hersenen te handhaven, terwijl ze ook in verband worden gebracht met verschillende neurologische pathologieën. Hier wordt een techniek beschreven voor het zuiveren van microglia van het ruggenmerg.

Snelle en efficiënte verrijking van microglia van het ruggenmerg van muizen

Leer astrocyten en microglia isoleren uit het ruggenmerg van volwassen muizen voor in-vitrotests en transcriptomisch onderzoek. Deze methode ondersteunt studies naar ruggenmergziekten.

Isolatie van pure astrocyten en microglia uit het ruggenmerg van volwassen muizen voor in-vitrotests en transcriptomische onderzoeken (Video) | JoVE Journal

Isolatie van pure astrocyten en microglia uit het ruggenmerg van volwassen muizen voor in-vitrotests en transcriptomische onderzoeken

Meer video's verkennen