Kwantificering van antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit in een tumorsferoïde model: aanvraag voor ontdekking van geneesmiddelen

Een van de meest effectieve gerichte kankertherapieën is gebaseerd op antilichamen zoals het anti-HER2-antilichaam trastuzumab. De kankerbestrijdende werking van trastuzumab omvat antilichaamafhankelijke celgemedieerde cytotoxiciteit, ADCC, door natural killer- of NK-cellen. Inzicht in mechanismen die de gevoeligheid van kankercellen reguleren voor anti-groeifactorreceptor-antilichaamtherapie, met speciale aandacht voor ADCC, kan cruciaal zijn voor de ontwikkeling van nieuwe, efficiëntere behandelingsmodaliteiten.

3D-modellen zoals sferoïden van kankercellen bleken superieur in het voorspellen van immuunresponsen van tumoren op verschillende antikankertherapieën. Daarom hebben we een ADCC-sferoïde model opgezet met behulp van de NK92 natural killer-cellijn, GFP-expressieve JIMT-1 borstcarcinoomcellen en trastuzumab. We zetten het ADCC-testsysteem op door de anti-HER2-positieve JIMT-1-borstcarcinoomcellen te induceren om driedimensionale clusters te vormen die sferoïden worden genoemd.

De JIMT-1-cellijn die in de experimenten wordt gebruikt, brengt het groen fluorescerende eiwit stabiel tot expressie. We beginnen het experiment met het voorbereiden van de plaat met 96 putjes voor de vorming van sferoïden. Om een U-vormige en celafstotende bodem te creëren, smeert u de plaat met 96 putjes in met een oplossing van 0,5% agarose in PBS.

Incubeer de plaat ongeveer 30 tot 45 minuten bij kamertemperatuur. In de tussentijd, trypsinisatie en telling JIMT-1 cellen voor cel seeding. Was de cellen met twee milliliter steriele PBS.

Voeg twee milliliter trypsine-EDTA toe aan de kolf en plaats de kolf 10 minuten terug in een CO2-incubator. Tik na de incubatie op de kolf om te controleren of de JIMT-1-cellen zijn losgekomen. Stop de vertering met twee milliliter JIMT-1-media en verzamel de celsuspensie in een buis van 50 milliliter.

Tel de cellen met Trypan Blue in een Burker-kamer en pas het celaantal aan naar 20.000 cellen per ml. Zaai de cellen in de plaat met 96 putjes door 100 microliter celsuspensie in elk putje te pipetteren voor de vorming van sferoïden. Laat de cellen tijdens de driedaagse incubatietijd bij 37 graden samenklonteren in een CO2-incubator.

Controleer regelmatig de grootte en vorm van sferoïden met een omgekeerde microscoop. Smeer op dag drie na de inductie van de sferoïden de zeefplaat met 96 putjes en een hoog gehalte in met een oplossing van Pluronic F-127 in DMSO. Coating is cruciaal om te voorkomen dat JIMT-1 EGFP-sferoïden zich aan het glasoppervlak of de plaat hechten.

Na een incubatietijd van 45 minuten bij kamertemperatuur de coatingoplossing opzuigen en de putjes twee keer wassen met DMEM F12 serumvrije media. Breng de sferoïden in drievoud over naar de zeefplaat met 96 putjes en een hoge inhoud met behulp van een pipet van één milliliter. Voeg sunitinib toe aan de putjes met een concentratie van 40 micromolaire in 10 microliter per putje en pipetteer verse JIMT-1-media in de controleputjes om het volume te verhogen.

Incubeer de plaat gedurende een uur in een CO2-incubator op 37 graden. Terwijl de incubatie van de voorbehandelde sferoïden aan de gang is, verzamelt u de NK92-cellen uit de kolf in een buis van 15 milliliter. Tel de cellen met Trypan Blue in een Burker-kamer en pas het celaantal aan om een effector-tot-doelverhouding van 20 op 1 te bereiken.

Kleur de NK-cellen met een 10-micromolaire oplossing van CellTracker Blue en plaats ze gedurende een uur in een CO2-incubator op 37 graden. Om het teveel aan kleurstof te wassen, centrifugeert u de NK-cellen twee keer bij 150 RCF gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de cellen vervolgens in verse JIMT-1-media.

Voeg de gekleurde NK-cellen toe aan de beoogde JIMT-1 EGFP-sferoïden door 55 microliter per putje te pipetteren, samen met anti-HER2-antilichaam trastuzumab. Verdun trastuzumab in JIMT-1-media tot een concentratie van 10 microgram per ml. Voeg de 110 microliter verse JIMT-1-media toe aan de controleputten en incubeer de plaat gedurende 24 uur in een CO2-incubator bij 37 graden.

Als gevolg hiervan is het totale volume van de behandeling dat voor de ADCC wordt toegevoegd 110 microliter en is de uiteindelijke sunitinibconcentratie 20 micromol per liter. Om apoptotische celdood na de behandelingen te detecteren en te meten, kleurt u de sferoïden gedurende één uur met een Annexine V Alexa Fluor 647-conjugaat in JIMT-1-media. Nadat de experimentele stappen zijn voltooid, brengt u de plaat over naar het analyseapparaat met een hoog gehalte.

De plaat wordt 24 uur na de toevoeging van de NK-factoren aan de doelcellen in beeld gebracht. Voor beeldvorming gebruiken we de high-content analyzer en een beeldanalysesoftware. Selecteer het type van de microtiterplaat in de lijst met platen met behulp van de optie Plaattype.

Gebruik een zeefplaat met 96 putjes en een hoog gehalte. Selecteer twee piekautofocus als de tests die worden uitgevoerd in platen met 10x objectief met 0.3 numerieke apertuur, met behulp van respectievelijk de autofocus- en objectiefopties. Kies de confocale modus met de optie OptiMode en pas Binning 2 toe op het gebruik van de Binning-optie.

Voor beeldvorming van sferoïden selecteert u de juiste kanalen met behulp van de optie Kanaalselectie. Om de EGFP-getransfundeerde JIMT-1-cellen te detecteren, kiest u EGFP met een integratietijd van 200 milliseconden, 50% laservermogen, een stapelhoogte van twee micrometer, een excitatie van 488 nanometer en emissiegolflengten van 500, 550 nanometer. En om apoptotische cellen te detecteren, gebruikt u Alexa 647 met een integratietijd van 100 milliseconden, 50% laservermogen, een stapelhoogte van 10 micrometer, een excitatie van 640 nanometer, emissiegolflengten van 650, 760 nanometer.

Om de NK-cellen in de sferoïden te visualiseren, kiest u het volgende kanaal, DAPI met een integratietijd van 100 milliseconden, 50% laservermogen, een stapelhoogte van twee micrometer, een excitatie van 405 nanometer en een emissiegolflengte van 435, 418 nanometer. Selecteer in de optie Lay-outselectie Z-stapels, aangezien cellen in de sferoïden de neiging hebben zich op verschillende brandpuntsvlakken van de microscoop te bevinden. 10 vlakken met een afstand van 10 micrometer zijn voldoende om het hele sferoïde gebied te bestrijken.

Stel de waarden van het eerste vlak en het laatste vlak in op respectievelijk 0 micrometer en 90 micrometer. Voordat met de meting wordt begonnen, kunnen met de Snapshot-functie voorbeeldfoto's worden gemaakt om de juiste instellingen te controleren. Stel het aantal putten en velden in voor beeldvorming met behulp van de optie Gedefinieerde lay-out.

Identificeer de sferoïden aan de hand van de EGFP-fluorescentie- of JIMT-1-cellen met behulp van de optie Fijn textuurgebied en filter ze uit op grootte. Verwijder randobjecten met behulp van de module Populatie selecteren. Aangezien de annexine-positieve cellen op de perifere sferoïden verschijnen, meet u de annexine-intensiteit in de apoptotische ring.

Stel in de module Regio selecteren de buitenrand in op min 90. Druk de waarden van de annexine-intensiteit uit als gemiddelde intensiteit. Zoals aangegeven door Annexine V-kleuring, veroorzaakte toevoeging van NK-cellen en trastuzumab aan de JIMT-1-cellen celdood in de tumorsferoïden.

Annexine-positieve apoptotische cellen ontstonden in de perifere zone van de sferoïden. Bij afwezigheid van trastuzumab veroorzaakten NK-cellen echter geen apoptose van tumorcellen. Om onderscheid te maken tussen de directe of ADCC-gemedieerde effecten van trastuzumab, werd trastuzumab-Fab2 zonder FC-regiobindend vermogen in deze studie gebruikt als negatieve controle.

Aangezien trastuzumab-Fab2 in dit model niet effectief was, wordt tumorceldood waarschijnlijk gemedieerd via ADCC. Bovendien verminderde voorbehandeling met sunitinib de Annexine V-kleuring in de sferoïden, wat de door sunitinib geïnduceerde ADCC-resistentie bevestigde en de preventie van apoptotische celdood in JIMT-1-sferoïden die samen met NK-cellen en trastuzumab waren geïncubeerd, aan het licht bracht. Deze gegevens bevestigden het cytoprotectieve effect van sunitinib in het ADCC-model en dringen aan op voorzichtigheid met betrekking tot de mogelijke combinaties van op ADCC gebaseerde immunotherapieën en sunitinib.

Samenvattend kan onze HCS-test geschikt zijn voor de identificatie van ADCC-stimulerende verbindingen.