Name: Constipatie meten in een Drosophila-model van de ziekte van Parkinson (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T14:40:00.000+00:00
Duration: 3 min 20 s
Description: Leer een eenvoudige assay om constipatie te meten in een Drosophila melanogaster-model van de ziekte van Parkinson met alpha-synucleine. Deze methode helpt onderzoekers niet-motorische symptomen te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We erkennen Dr. Mel Feany van het Brigham and Women's Hospital en de Harvard Medical School voor het vriendelijke geschenk van de controle en alfa-synucleïne die Drosophila-lijnen tot expressie brengt. We erkennen de volgende bronnen van subsidie aan Dr. Olsen: NINDS K08, American Parkinson Disease Association George C. Cotzias Fellowship, Department of Defense Parkinson's Disease Early Investigator Award.

Vliegen die in deze test worden gebruikt: controle: nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+; alfa-synucleïne vliegt: nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha-synucleïne/+; 1 en 10 dagen na de eclosie; mannelijke en vrouwelijke (gepaard en ongepaarde) vliegen (zie Tabel met materialen).
1. Bereiding van het geverfde vliegenvoer
<ol><li>Meng blauwe zachte gelpasta kleurstof (zie Materiaaltabel) met gedestilleerd water in een verhouding van 1:1 (v/v). OPMERKING: Gebruik commerciële kleurstof voor levensmiddelen die alleen niet-opneembare kleurstoffen bevat, aangezien van sommige blauwe kleurstoffen is aangetoond dat ze neuroprotectieve effectenhebben21.</li>
	<li>Zet de flesjes vliegenvoer, bestaande uit standaard maïsmeel-agar (zie materiaaltabel), met tussenpozen van 10-15 seconden in de magnetron totdat het voedsel is gesmolten tot een vloeistof of brij. Laat voedsel niet overkoken.</li>
	<li>Voeg het kleurstofmengsel toe aan elke injectieflacon met voedsel om een uniforme kleur tussen de injectieflacons te verkrijgen. Meng het kleurstofmengsel erdoor tot het voedsel homogeen blauw is (Figuur 1). Voeg een hoeveelheid van het blauwe kleurstofmengsel toe, zodat de kleur van het voedsel verzadigd is en er geen kleurvariatie is tussen de injectieflacons. NOTITIE: Deze stap moet snel na het in de magnetron worden uitgevoerd, omdat het voedsel snel stolt. Als het voedsel stolt, zet u de injectieflacon opnieuw in de magnetron.</li>
	<li>Laat de flesjes met geverfd voedsel aan de lucht drogen totdat het stolt. Plaats tijdens het drogen een dunne papieren handdoek over de openingen van de injectieflacon om te voorkomen dat er verdwaalde vliegen in de injectieflacon terechtkomen.</li>
	<li>Zodra het voedsel is afgekoeld en gestold, brengt u de vliegen die voor het testen zullen worden gebruikt over naar het blauwe voedsel. OPMERKING: Voor smalle injectieflacons (25 mm) wordt aanbevolen om 9-14 vliegen aan elke injectieflacon toe te voegen. Voor brede injectieflacons (28,5 mm) wordt aanbevolen om 10-20 vliegen aan elke injectieflacon toe te voegen. Vliegen worden niet gescheiden door geslacht of paringservaring en omvatten een gemengde populatie van mannelijke en vrouwelijke vliegen, met zowel gepaarde als ongepaarde vrouwtjes.</li>
	<li>Incubeer de injectieflacons met vliegen een nacht bij 25 °C in een broedmachine.</li>
</ol>2. De vliegen in beeld brengen
OPMERKING: Deze stap is optioneel (Figuur 2).
<ol><li>De volgende ochtend (tijd 0), verdoven de representatieve vliegen met kooldioxide gedurende 60 s. Plaats de gulp zo dat de buikzijde naar boven wijst.</li>
	<li>Maak met behulp van een camera (zie Materiaaltabel) elk uur foto's van de vliegen om de hoeveelheid blauw voedsel in het spijsverteringsstelsel te visualiseren. OPMERKING: Deze vliegen mogen niet worden gebruikt voor het kwantitatieve deel van de test (stap 3), omdat anesthesie de resultaten kan beïnvloeden.</li>
	<li>Verdoof en beeld elk uur nieuwe vliegen.</li>
</ol>3. Uitvoeren van de constipatietest
<ol><li>Breng de resterende (niet-verdoofde) vliegen over in injectieflacons met standaard Drosophila-voer . Nummer elke injectieflacon.</li>
	<li>Laat de vliegen 60 minuten in de broedmachine bij 25 °C staan.</li>
	<li>Breng de vliegen na 60 minuten over in nieuwe injectieflacons met standaard Drosophila-voer . Begin met het vastleggen van gegevens vanaf de eerste set flacons.</li>
	<li>Trek een stippellijn over de lengte van de injectieflacon om het punt te markeren vanaf waar het tellen begint.</li>
	<li>Tel handmatig het aantal kleine, ronde stippen op de wand van elke flacon. Tel geen stippen op het voedsel of de flaconplug.</li>
	<li>Begin met het tellen van het aantal blauwe stippen op de wand van elke injectieflacon.</li>
	<li>Tel het aantal ondoorzichtige, kleurloze stippen op de wand van elke flacon. OPMERKING: Elke stip is uitwerpselen van vliegen, wat een combinatie is van urine en ontlasting22. Af en toe kan een vlieg over de uitwerpselen lopen en een spoor achterlaten, in welk geval alleen de oorspronkelijke stip telt, niet elke afzonderlijke markering in het spoor.</li>
	<li>Noteer de verhouding tussen blauwe stippen en het totale aantal stippen voor elke injectieflacon. OPMERKING: Het totale aantal stippen is het aantal blauwe stippen op de wand van een injectieflacon opgeteld bij het aantal kleurloze stippen op de wand van dezelfde flacon. Dit wordt gebruikt om het percentage blauwe ontlasting per uur te berekenen.</li>
	<li>Herhaal stap 3.2-3.8 nog zeven keer, waarbij u elk uur gegevens verzamelt gedurende een totaal van 8 uur.</li>
</ol>4. Data-analyse
<ol><li>Maak een grafiek van het percentage blauwe ontlasting per uur voor elke aandoening.</li>
	<li>Vergelijk de gegevens tussen de omstandigheden. OPMERKING: Statistische significantie kan op 3 manieren worden bepaald: door individuele tijdstippen tussen omstandigheden te vergelijken, door de helling van de lijn in de tijd te meten of door het gebied onder de curve te vergelijken.</li>
</ol>

Constipatie-assays bij Drosophila-vliegen

<ol><li>Kalia, L. V., Lang, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease.</a> Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).</li>
<li>Bloem, B. R., Okun, M. S., Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease.</a> Lancet. 397 (10291), 2284-2303 (2021).</li>
<li>Ball, N., Teo, W. P., Chandra, S., Chapman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+and+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurol%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease and the environment.</a> Front Neurol. 10, 218(2019).</li>
<li>Zhou, J., Li, J., Papaneri, A. B., Kobzar, N. P., Cui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neuron+challenge+test+for+early+detection+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">Dopamine neuron challenge test for early detection of Parkinson's disease.</a> NPJ Parkinsons Dis. 7 (1), 116(2021).</li>
<li>Ueki, A., Otsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+style+risks+of+Parkinson%27s+disease%3A+association+between+decreased+water+intake+and+constipation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol%22%5BJournal%5D)">Life style risks of Parkinson's disease: association between decreased water intake and constipation.</a> J Neurol. 251 (Suppl 7), vII18-vII23 (2004).</li>
<li>Houser, M. C., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut-brain+axis%3A+is+intestinal+inflammation+a+silent+driver+of+Parkinson%27s+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">The gut-brain axis: is intestinal inflammation a silent driver of Parkinson's disease pathogenesis.</a> NPJ Parkinsons Dis. 3, 3(2017).</li>
<li>Pfeiffer, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-motor+symptoms+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsonism+Relat+Disord%22%5BJournal%5D)">Non-motor symptoms in Parkinson's disease.</a> Parkinsonism Relat Disord. 22 (Suppl 1), (2016).</li>
<li>Klann, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Gut-brain+axis+and+its+relation+to+parkinson%27s+disease%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Gut-brain axis and its relation to parkinson's disease: A review.</a> Front Aging Neurosci. 13, 782082(2021).</li>
<li>Mukherjee, A., Biswas, A., Das, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+dysfunction+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Gut dysfunction in Parkinson's disease.</a> World J Gastroenterol. 22 (25), 5742-5752 (2016).</li>
<li>Yemula, N., Dietrich, C., Dostal, V., Hornberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+and+the+gut%3A+symptoms%2C+nutrition%2C+and+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease and the gut: symptoms, nutrition, and microbiota.</a> J Parkinsons Dis. 11 (4), 1491-1505 (2021).</li>
<li>Chen, S. J., Lin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microenvironmental+changes+as+a+potential+trigger+in+Parkinson%27s+disease+through+the+gut-brain+axis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Sci%22%5BJournal%5D)">Gut microenvironmental changes as a potential trigger in Parkinson's disease through the gut-brain axis.</a> J Biomed Sci. 29 (1), 54(2022).</li>
<li>Hawrysh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRKN%2Fparkin-mediated+mitophagy+is+induced+by+the+probiotics+Saccharomyces+boulardii+and+Lactococcus+lactis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">PRKN/parkin-mediated mitophagy is induced by the probiotics Saccharomyces boulardii and Lactococcus lactis.</a> Autophagy. 19 (7), 2094-2110 (2023).</li>
<li>Liu, W., Lim, K. L., Tan, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestine-derived+%CE%B1-synuclein+initiates+and+aggravates+pathogenesis+of+Parkinson%27s+disease+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Intestine-derived α-synuclein initiates and aggravates pathogenesis of Parkinson's disease in Drosophila.</a> Transl Neurodegener. 11 (1), 44(2022).</li>
<li>Rota, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constipation%2C+deficit+in+colon+contractions+and+alpha-synuclein+inclusions+within+the+colon+precede+motor+abnormalities+and+neurodegeneration+in+the+central+nervous+system+in+a+mouse+model+of+alpha-synucleinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Constipation, deficit in colon contractions and alpha-synuclein inclusions within the colon precede motor abnormalities and neurodegeneration in the central nervous system in a mouse model of alpha-synucleinopathy.</a> Transl Neurodegener. 8, 5(2019).</li>
<li>Diwakarla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATH434+reverses+colorectal+dysfunction+in+the+A53T+mouse+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">ATH434 reverses colorectal dysfunction in the A53T mouse model of Parkinson's disease.</a> J Parkinsons Dis. 11 (4), 1821-1832 (2021).</li>
<li>Ordonez, D. G., Lee, M. K., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-synuclein+Induces+mitochondrial+dysfunction+through+spectrin+and+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">α-synuclein Induces mitochondrial dysfunction through spectrin and the actin cytoskeleton.</a> Neuron. 97 (1), 108.e6-124.e6 (2018).</li>
<li>Olsen, A. L., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+%CE%B1-synuclein+promotes+neurodegeneration+characterized+by+a+distinct+transcriptional+program+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Glial α-synuclein promotes neurodegeneration characterized by a distinct transcriptional program in vivo.</a> Glia. 67 (10), 1933-1957 (2019).</li>
<li>Cognigni, P., Bailey, A. P., Miguel-Aliaga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+neurons+and+systemic+signals+couple+nutritional+and+reproductive+status+with+intestinal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Enteric neurons and systemic signals couple nutritional and reproductive status with intestinal homeostasis.</a> Cell Metab. 13 (1), 92-104 (2011).</li>
<li>Urquhart-Cronish, M., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-environment+interplay+in+Drosophila+melanogaster%3A+chronic+nutritional+deprivation+in+larval+life+affects+adult+fecal+output%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gene-environment interplay in Drosophila melanogaster: chronic nutritional deprivation in larval life affects adult fecal output.</a> J Insect Physiol. 69, 95-100 (2014).</li>
<li>Popovic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+dPerk+in+the+intestine+suppresses+neurodegeneration+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Blocking dPerk in the intestine suppresses neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Cell Death Dis. 14 (3), 206(2023).</li>
<li>Poteet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+actions+of+methylene+blue+and+its+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective actions of methylene blue and its derivatives.</a> PLoS One. 7 (10), e48279(2012).</li>
<li>Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+physiology+of+the+digestive+tract+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).</li>
<li>Schlichting, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neural+network+underlying+circadian+entrainment+and+photoperiodic+adjustment+of+sleep+and+activity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A neural network underlying circadian entrainment and photoperiodic adjustment of sleep and activity in Drosophila.</a> J Neurosci. 36 (35), 9084-9096 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Er zijn verschillende stappen in dit protocol die zullen helpen bij de succesvolle voltooiing van de test. Ten eerste is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de tijdsintervallen tussen elke ronde voor elke injectieflacon gedurende het hele experiment consistent zijn. Door de flacons met nummers te labelen, vermijdt u de noodzaak van lange genotypebeschrijvingen, wat tijd bespaart. Bovendien is het van cruciaal belang dat de methode voor het tellen van ontlasting22 gedurende het hele experiment consistent blijft. Hoewel blauwe ontlasting zichtbaar is op het voedsel en de injectieflaconstop, is kleurloze ontlasting dat niet. Tel daarom de blauwe stippen op het voer of de flaconplug niet.
Bij gedragstesten is er altijd een mogelijkheid van inconsistenties in de resultaten als gevolg van fluctuaties in het gedrag van vliegen of onbekende variabelen die de test beïnvloeden. We raden aan om voor alle experimenten dezelfde Drosophila-media , dezelfde kleurstof voor levensmiddelen en hetzelfde merk injectieflacons te gebruiken. Interessant is dat in verschillende proeven werd waargenomen dat vliegen de neiging hebben om minder vaak te poepen in de vroege namiddag, mogelijk als gevolg van het circadiane ritme van de vliegen23. Dit gedrag is echter consistent bij zowel controlevliegen als vliegen die alfa-synucleïne tot expressie brengen, dus het zou geen zorgen moeten baren.
Als de vliegen aan het begin van de test geen blauwe ontlasting uitscheiden, is het mogelijk dat de gebruikte kleurstof niet voldoende gepigmenteerd is. In dit geval kan men de verhouding tussen kleurstof en gedestilleerd water dienovereenkomstig verhogen. Het is ook mogelijk dat wanneer er nog maar een kleine hoeveelheid blauw voedsel in het spijsverteringskanaal van de vlieg zit, het moeilijk kan zijn om te bepalen of de ontlasting lichtblauw of kleurloos is. Wanneer dit gebeurt, zal het plaatsen van een wit vel papier achter de injectieflacon helpen om de kleur van de fecale stip te bepalen. Zelfs als de ontlasting erg lichtblauw is, is het het beste om deze op te nemen als blauwe ontlasting in plaats van kleurloze ontlasting.
Een beperking van deze test is dat het handmatig tellen van fecale vlekken vereist. Om het potentieel voor high-throughput screening te verbeteren, kan dit protocol in de toekomst worden gewijzigd om geautomatiseerde kwantificering mogelijk te maken van blauwe fecale vlekken geproduceerd door individuele vliegen in platen met meerdere putjes. Een andere beperking is dat, hoewel het alfa-synucleïnemodel het potentieel heeft om te worden ontwikkeld tot een prodromaal model van PD, er nog geen optimaal tijdstip is geïdentificeerd waarop constipatie aanwezig is zonder neurodegeneratie.
Samenvattend biedt deze methode een eenvoudige, ongecompliceerde benadering voor het modelleren van constipatie, een onderbelicht niet-motorisch PD-symptoom, in een Drosophila-model van PD.

De ziekte van Parkinson (PD) is een progressieve neurodegeneratieve aandoening die klinisch wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van motorische symptomen zoals bradykinesie, stijfheid en tremor, resulterend in significante morbiditeit1. Pathologisch wordt PD gedefinieerd door het verlies van dopaminerge neuronen in de substantia nigra en het verkeerd vouwen van alfa-synucleïne, wat leidt tot de vorming van Lewy-lichaampjes en Lewy-neurieten. De pathogenese van PD blijft slecht begrepen en is waarschijnlijk het gevolg van een complex samenspel van genetische en omgevingsfactoren 2,3. Momenteel zijn ziektemodificerende therapieën niet beschikbaar, mogelijk deels als gevolg van het vergevorderde stadium van pathologie dat aanwezig is op het moment van diagnose. Studies hebben aangetoond dat meer dan 60% van de dopaminerge neuronen in de substantia nigra al verloren zijn gegaan door het begin van motorische symptomen, wat de noodzaak onderstreept om potentiële biomarkers voor vroege detectie van ziekten te onderzoeken. Een van die klinische biomarkers is constipatie, die vaak voorkomt bij PD-patiënten 5,6 en jaren of zelfs decennia kan voorafgaan aan het begin van motorische symptomen.
Ondanks de klinische definitie van PD op basis van motorische symptomen, is constipatie een van de vele niet-motorische symptomen die symptomatisch moeilijker te behandelen zijn en een aanzienlijke verslechtering van de kwaliteitvan leven van patiënten veroorzaken. Veranderingen in de darm-hersenas, die bidirectionele communicatie tussen de hersenen en het enterische zenuwstelsel vertegenwoordigt, zijn betrokken bij de pathogenese van PD. Alfa-synucleïne-aggregaten zijn gevonden in weefselmonsters uit het maagdarmkanaal van PD-patiënten8, en diermodellen suggereren dat alfa-synucleïne-aggregaten in het enterische zenuwstelsel zich op een prionachtige manier verspreiden naar het centrale zenuwstelsel9. Bovendien vertonen PD-patiënten afwijkingen in het darmmicrobioom10 en kunnen ze overmatige darmontsteking ervaren11. Constipatie bij PD is onderbelicht, met weinig gerapporteerde modellen van Parkinson-geassocieerde constipatie bij vliegen12,13 of knaagdieren14,15.
Deze test maakt gebruik van een Drosophila-model van PD waarin vliegen het menselijke alfa-synucleïne-gen tot expressie brengen onder controle van een pan-neuronale bestuurder, n-synaptobrevin. Deze vliegen vertonen alle kenmerkende kenmerken van PD, waaronder alfa-synucleïne-aggregatie, motorische disfunctie en leeftijdsgebonden neurodegeneratie, wat resulteert in het verlies van dopaminerge neuronen16,17. Eerdere studies hebben de meting van de fecale output bij vliegen geïntroduceerd om darmdisfunctie te beoordelen, de uitwerpselen van vliegen te kwantificeren en de uitwerpselen van verschillende genetische lijnen te vergelijken om functionele verschillen in het spijsverteringsstelsel aan het licht te brengen 18,19,20. Hier demonstreren we de constipatietest met behulp van vliegen die menselijke alfa-synucleïne tot expressie brengen. Dit eenvoudige maar waardevolle hulpmiddel maakt de studie van een belangrijk niet-motorisch symptoom van PD mogelijk.

<table><tbody><tr><td>1400 g sucrose</td><td>MP Biomedicals</td><td>904713</td><td></td></tr><tr><td>1800 g dextrose</td><td>MP Biomedicals</td><td>901521</td><td></td></tr><tr><td>2884 g yeast</td><td>MP Biomedicals</td><td>903312</td><td></td></tr><tr><td>428 g agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>10253156</td><td></td></tr><tr><td>4600 mL molasses</td><td>Grandma's Molasses</td><td>7971942</td><td></td></tr><tr><td>68 L water</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>680 mL tegosept mix (1200 g tegosept in 6 L ethanol)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6864 g cornmeal</td><td>Pearl Milling</td><td>125045</td><td></td></tr><tr><td>800 mL acid mix (83 mL phosphoric acid in 1 L water + 836 mL propionic acid in 1 L water)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cellSens Standard software</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Pharmco-Aper</td><td>111ACS200</td><td></td></tr><tr><td>Flugs for wide plastic vials</td><td>Genesee Scientific</td><td>49-101</td><td></td></tr><tr><td>Flystuff wide Drosophila vials, polystyrene</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-117</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism</td><td>GraphPad</td><td>N/A</td><td>Versie 9.5.1</td></tr><tr><td>Olympus DP23 camera</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Olympus SZX12 Stereo Microscope</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Phosphoric Acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25470A</td><td></td></tr><tr><td>Propionic Acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A258 - 500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Soft gel paste food color, Royal blue</td><td>AmeriColor</td><td>202</td><td></td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Apex</td><td>20-258</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Stocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nSyb-QF2, nSyb-Gal4</td><td>Alle lijnen geleverd door Dr. Mel Feany</td><td>N/A</td><td>Lijnen zijn rechtstreeks verkrijgbaar bij Dr. Feany&nbsp;</td></tr><tr><td>nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha synuclein</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>w1118</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

constipatie meten in een drosophila-model van de ziekte van parkinson

Measuring Constipation in a Drosophila Model of Parkinson's Disease

Niet-motorische symptomen bij de ziekte van Parkinson (PD) komen vaak voor, zijn moeilijk te behandelen en tasten de kwaliteit van leven aanzienlijk aan. Een veel voorkomend niet-motorisch symptoom is constipatie, die jaren of zelfs decennia aan de diagnose PD kan voorafgaan. Constipatie is onderbelicht in diermodellen van PD en mist specifieke therapieën. Deze test maakt gebruik van een Drosophila-model van PD waarin humaan alfa-synucleïne tot expressie wordt gebracht onder een pan-neuronale driver. Vliegen die alfa-synucleïne tot expressie brengen, ontwikkelen de kenmerkende kenmerken van PD: het verlies van dopaminerge neuronen, motorische stoornissen en alfa-synucleïne-insluitsels.
Dit protocol schetst een methode voor het bestuderen van constipatie bij deze vliegen. Vliegen worden 's nachts op vliegvoer met een blauwe kleuradditief geplaatst en de volgende dag overgebracht naar standaardvoer. Vervolgens worden ze gedurende 8 uur elk uur verplaatst naar nieuwe flacons met standaard vliegenvoer. Vóór elke overdracht wordt het percentage blauwgekleurde fecale vlekken ten opzichte van het totale aantal fecale vlekken op de wand van de injectieflacon berekend. Controlevliegen die geen alfa-synucleïne hebben, verdrijven alle blauwe kleurstof uren voordat vliegen alfa-synucleïne tot expressie brengen. Bovendien kan de doorgang van blauwgekleurd voedsel uit de darm worden gevolgd met eenvoudige fotografie. De eenvoud van deze test maakt het mogelijk om het te gebruiken in voorwaartse genetische of chemische screenings om modificatoren van constipatie in Drosophila te identificeren.

Omdat de buik van Drosophila transparant is, kan blauw voedsel in de darm worden gevisualiseerd in levende verdoofde vliegen. Kwalitatieve verschillen in darmtransit kunnen worden beoordeeld door foto's te maken van de vliegen op verschillende tijdstippen. Bij controlevliegen wordt het blauwe voedsel snel verdreven, terwijl bij alfa-synucleïnevliegen het blauwe voedsel tot 8 uur in de darm aanwezig blijft (Figuur 2).
De alfa-synucleïnevliegen vertonen leeftijdsgebonden neurodegeneratie, met een robuust fenotype dat zich 10 dagen na de eclosie ontwikkelt10. Op dit tijdstip worden verschillen in darmtransittijd in vergelijking met controlevliegen gezien door individuele tijdstippen tussen omstandigheden te vergelijken, door de helling van de lijn in de loop van de tijd te meten of door het gebied onder de curve te vergelijken (Figuur 3). Er worden geen verschillen waargenomen in darmtransit tussen controle- en alfa-synucleïnevliegen op een eerder tijdstip, dag 1 na de eclosie, wanneer motorische disfunctie en neurodegeneratie ook nog niet aanwezig zijn (Figuur 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig1v2.jpg"> Figuur 1: Blauwe voedselflesjes en ontlastingsvlekken. (A) Alle injectieflacons bevatten blauwgekleurd voedsel. Op dit moment zijn vliegen net geïntroduceerd in het blauwe voedsel en is er geen blauwe ontlasting zichtbaar. (B) Een injectieflacon nadat w1118-vliegen gedurende 1 uur zijn overgebracht naar vers voedsel en vervolgens zijn verwijderd. De linker inzet is vergroot in (C) en de rechter inzet is vergroot in (D). (C) Een gebied dat van de analyse is uitgesloten vanwege de aanwezigheid van vliegenvoer. (D) Vergrote weergave van fecale vlekken, met blauwe (zwarte pijlen) en niet-blauwe vlekken (gele pijlen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig02.jpg"> Figuur 2: Visualisatie van de darmtransit van het geverfde voedsel in de loop van de tijd. Controlevliegen en vliegen die menselijke alfa-synucleïne in neuronen tot expressie brengen, werden 's nachts op blauw geverfd voedsel gelaten en de volgende dag overgebracht naar standaardmedia. Vliegen werden elk uur serieel overgebracht naar nieuw standaard vliegenvoer. Representatieve beelden op tijdstip nul en 2, 4, 6 en 8 uur na overdracht worden weergegeven. Controle- en alfa-synucleïnevliegen vertonen vergelijkbare vlekken van blauw voedsel in de darm op tijdstip nul. Op de volgende tijdstippen hebben controlevliegen minder blauw voedsel dan alfa-synucleïnevliegen, en al het blauwe voedsel is verdwenen op het tijdstip van 8 uur bij controlevliegen. De genotypen voor elke vlieglijn zijn als volgt: controle (nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); alfa-synucleïne vliegt (nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alfa-synucleïne/+). Vrouwelijke vliegen worden gebruikt voor beeldvorming vanwege hun gemakkelijkere vermogen om de buik te visualiseren vanwege hun grotere formaat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig2v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig3v2.jpg"> Figuur 3: Constipatietest in dag 10 post-eclosievliegen. Controlevliegen en vliegen die menselijke alfa-synucleïne in neuronen tot expressie brengen, werden 's nachts op blauw geverfd voedsel gelaten en de volgende dag overgebracht naar standaard vliegenvoer. Vliegen werden elk uur serieel overgebracht naar nieuwe standaardmedia. (A) Percentage blauwe ontlasting per uur. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie. N = 6 injectieflacons per genotype; Elke flacon bevatte 9-14 vliegen. Alle statistische analyses werden uitgevoerd in Graphpad Prism (zie Tabel met materialen). De statistische significantie op elk tijdstip werd berekend met behulp van tweerichtings-ANOVA. De helling van de lijn en het verschil tussen de hellingen werden berekend met behulp van de lineaire regressieanalyse. (B) De oppervlakte onder de curve voor elk genotype werd berekend. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie. De genotypen voor elke vlieglijn zijn als volgt: controle (nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); alfa-synucleïne vliegt (nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alfa-synucleïne/+). Zowel mannelijke als vrouwelijke vliegen zijn in ongeveer gelijke aantallen opgenomen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig3v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig4v2.jpg"> Figuur 4: Constipatietest in dag 1 post-eclosievliegen. Controlevliegen en vliegen die menselijke alfa-synucleïne in neuronen tot expressie brengen, werden 's nachts op blauw geverfd voedsel gelaten en de volgende dag overgebracht naar standaardmedia. Vliegen werden elk uur serieel overgebracht naar nieuw standaard vliegenvoer. (A) Percentage blauwe ontlasting per uur. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie. N = minimaal 5 injectieflacons per genotype; Elke flacon bevatte 9-14 vliegen. Alle statistische analyses werden uitgevoerd in Graphpad Prism. De statistische significantie op elk tijdstip werd berekend met behulp van tweerichtings-ANOVA. De helling van de lijn en het verschil tussen de hellingen werden berekend met behulp van de lineaire regressieanalyse. (B) De oppervlakte onder de curve voor elk genotype werd berekend. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie. De genotypen voor elke vlieglijn zijn als volgt: controle (nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); alfa-synucleïne vliegt (nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alfa-synucleïne/+). Zowel mannelijke als vrouwelijke vliegen zijn in ongeveer gelijke aantallen opgenomen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig4v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Dit protocol presenteert een test voor het modelleren van constipatie in een op alfa-synucleïne gebaseerd Drosophila-model van de ziekte van Parkinson.

Constipatie meten in een Drosophila-model van de ziekte van Parkinson

Non-motor symptoms in Parkinson's disease (PD) are common, difficult to treat, and significantly impair quality of life. One prevalent non-motor symptom ...

De ziekte van Parkinson wordt gedefinieerd door de motorische symptomen van bradykinesie, tremor en stijfheid. Maar veel patiënten met de ziekte van Parkinson lijden aan niet-motorische symptomen, die moeilijker te behandelen zijn en een grotere verslechtering van de kwaliteit van leven veroorzaken. Deze zijn niet goed bestudeerd in diermodellen van de ziekte, wat ons vermogen beperkt om er nieuwe therapieën voor te vinden.Dit protocol is eenvoudig en goedkoop, maar genereert reproduceerbare resultaten. Het is gemakkelijk te leren en vereist geen gespecialiseerde apparatuur. Met deze eenvoudige test kunnen we constipatie beoordelen bij vliegen met neurodegeneratie.In de toekomst hopen we een model te ontwikkelen waarbij vliegen constipatie ontwikkelen voordat neurodegeneratie begint. Dit zal ons in staat stellen om de pathogenese van de ziekte van Parkinson beter te begrijpen.

measuring-constipation-in-a-drosophila-model-of-parkinson-s-disease

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Gedrag assays voor het meten van motorische functies, leren en geheugen capaciteiten...

Het testen van Beweegwijzer, leren en geheugen Tekortkomingen in Drosophila Modellen van Neurodegeneratie

Ziekte van Parkinson is een neurodegeneratieve aandoening die resulteert uit de degeneratie van dopaminerge neuronen in het centrale zenuwstelsel, waardoor voortbeweging defecten. Rotenone modellen ziekte van Parkinson in Drosophila. In dit document worden twee testen die zowel spontaan en schrikken geïnduceerde motoriek gebreken veroorzaakt door rotenon karakteriseren.

Methoden te karakteriseren Spontane en Schrik-geïnduceerde Locomotion in een-Rotenon geïnduceerde Parkinson&#39;s Disease Model van<em&gt; Drosophila</em

We presenteren een geoptimaliseerde, goedkope en betrouwbare negatieve geotaxistest in Drosophila melanogaster als model voor neurodegeneratieve aandoeningen. Omdat deze test gevoeliger is voor lichte locomotieve defecten, zal deze helpen bij het screenen op mogelijke genetische interacties en doelwitten voor geneesmiddelen.

Kwantitatieve Analyse van Klimmen Defecten in een Drosophila model van neurodegeneratieve aandoeningen

In dit artikel laten we zien hoe we een zevenpuntenscoresysteem kunnen gebruiken om veranderingen in dopaminerge neuron dendrietmorfologie in C. elegansconsequent te kwantificeren . Dit systeem is bedoeld voor analyses van dopaminerge neurodegeneratie-assays met behulp van genetische, chemische en op leeftijd gebaseerde modellen van neurodegeneratieve aandoeningen.

Kwantificering van dopaminerge neuron morfologische verandering en degeneratie in Caenorhabditis elegans

Dit protocol beschrijft een kwantitatieve ontlastingstest bij jonge RAC1/CED-10 mutante Caenorhabditis elegans, waarmee een eenvoudig model wordt geboden om prodromale stadia van de ziekte van Parkinson te bestuderen. Het overwint beperkingen van andere diermodellen en faciliteert het testen van therapeutische strategieën gericht op vroege Parkinsoniaanse pathologie.

Beoordeling van gastro-intestinale motiliteit bij Caenorhabditis elegans RAC1/CED-10 mutanten als hulpmiddel om vroege Parkinson te bestuderen

Dit artikel beschrijft een gedrags-test die mannetje mating drive in Drosophila melanogaste r om de motivatie te bestuderen gebruikt. Met deze methode kunnen onderzoekers gebruiken geavanceerde fly neurogenetische technieken om de genetische, moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze motivatie ontdekken.

Het meten en de wijziging van Mating Drive in Male<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Hier we illustreren hoe enkel molecuul foto-geactiveerde lokalisatie microscopie kan worden uitgevoerd op de motorische zenuw-terminal van een levende Drosophila melanogaster derde instar larve.

In Vivo Single-molecuul volgen bij de Terminal van de presynaptische motorische zenuw Drosophila

Dit protocol is gericht op kwantitatieve analyse van complexiteit van de neuronale dendritische arborization (NDAC) in Drosophila, die kan worden gebruikt voor studies van dendritische morfogenese.

Kwantitatieve analyse van neuronale dendritische Arborization complexiteit in Drosophila

Het doel van dit artikel is het schetsen van de stappen die nodig zijn voor de generatie van fibrillen van monomeer Alfa-synuclein, latere kwaliteitscontrole, en het gebruik van de voorgevormde fibrillen in vivo.

Generatie van Alfa-Synuclein voorgevormde fibrillen van monomeren en gebruik in vivo

Hier beschrijven we het RatWalker-systeem, gebouwd door het MouseWalker-apparaat opnieuw te ontwerpen om tegemoet te komen aan de toegenomen grootte en het gewicht van ratten. Dit systeem maakt gebruik van gefrustreerde totale interne reflectie (FTIR), snelle video-opname en open-access analysesoftware om loopparameters te volgen en te kwantificeren.

Het ratwalkersysteem toepassen voor loopanalyse in een genetisch rattenmodel van de ziekte van Parkinson

Leer een eenvoudige assay om constipatie te meten in een Drosophila melanogaster-model van de ziekte van Parkinson met alpha-synucleine. Deze methode helpt onderzoekers niet-motorische symptomen te bestuderen.

Constipatie meten in een Drosophila-model van de ziekte van Parkinson

Meer video's verkennen