Monitoring Actin Demontage met Time-lapse Microscopie
8 november 2006
Oké, dus wat ik vandaag wil doen, is je laten zien hoe je een flowkamer, een fusiekamer voor beeldvorming op een rechtopstaande microscoop, kunt bouwen. Wat ik dan doe, is twee ruimtes maken met behulp van film. Dus wat ik doe, is ik neem de parafilm, ik snijd het in kleine stroken.
Vervolgens ga ik dit gebruiken om de kanalen voor de wanden te vormen, en ik droog ze met een hellende luchtstroom. Ik plaats de dekglas op de para en hier is de afgewerkte kamer. Vervolgens verwarm ik het op een verwarmingsblok om de param te smelten en een afdichting te maken.
Dus wat dit is, is het dekglast hier, en bovenop het dekglast zijn twee lagen phim, zoals je hier ziet. En bovenop dit, weer, is het een 22 bij twee twee mil millimeter dekglas. Deze hier, die ik tegen de param heb gedrukt om de afdichting te maken.
Oké, dus de vloeistof gaat hier in één richting in en ik kan het eruit zuigen met een filterpapier hier in deze richting. En ik zal je hoe dat te doen in een moment laten zien. Dus wat ik graag doe, is ik plaats het in een bevochtigde kamer, wat heel eenvoudig is.
Neem twee soorten verhoogde stroken en plaats er een filterpapier onder. En om het luidruchtig te houden, plaats ik het dekglast op de flowkamer. De manier waarop je een oplossing in de kamer introduceert, is dat je de pipettip bij de ingang van de kamer plaatst en je gewoon scheidt.
Nu wat ik doe, is ik incubeer de kamer met het deksel gesloten gedurende 10 minuten. Wat ik meestal doe om de vloeistof van de andere kant uit te zuigen, is een filterpapier nemen en het in dunne stroken snijden zoals dit. En ik neem een van deze dunne stroken en breng tegelijkertijd de oplossing bij de ingang aan terwijl ik het filterpapier bij de uitgang plaats om de oplossing te verwisselen.
Dus je zult de vloeistof zien stromen door de oplossing. En dan wacht ik vijf minuten voor de mid close. Nu wat ik klaar ben om te doen, is eigenlijk de actin er in te doen en de actin, ik moet het polymeriseren, ik polymeriseer het binnen de flowkamer en het is dezelfde procedure als eerder.
Dus omdat dit zo is, en nu dat de actie is gepolymeriseerd, was ik alle onnodige ongepolymeriseerde actie weg met een groot volume buffer. Dus hier heb ik ongeveer honderd microliters en het is een paar reactiekamer volumes buffer waard. Gewoon, weet je, wanneer het filterpapier verzadigd raakt, moet ik de richting veranderen.Oké?
En dus ben ik klaar om beeldvorming te doen met dit. Dus perfusiekamer met actin eraan bevestigd. Nu neem ik de dia, monteer het onder de microscoop, en aangezien ik beeldvorming doe met een olieobjectief, ga ik wat immersieolie op het bovenoppervlak van het dekglast doen, zodat het oplossing of eiwit of iets anders op het actin binnenin kan.
Dus wat ik doe, is dat ik de oplossing kan verwisselen terwijl ik de time lapse beeldvorming doe. Zo.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel demonstreert de constructie van een stroomkamer en fusiekamer voor beeldvorming op een rechtopstaande microscoop. Het proces omvat het creëren van kanalen met behulp van parafilm en het afdichten ervan met warmte.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Biologie
Achtergrond
- Stroomkamers zijn essentieel voor verschillende beeldvormingstechnieken.
- Het construeren van een fusiekamer zorgt voor verbeterde beeldvormingsmogelijkheden.
- Parafilm wordt veel gebruikt in laboratoriumomgevingen voor het maken van afdichtingen.
- Het begrijpen van het constructieproces is cruciaal voor onderzoekers op het gebied.
Doel van het onderzoek
- Om een stapsgewijze handleiding te bieden voor het construeren van een stroomkamer.
- Om het gebruik van parafilm bij het maken van beeldvormingskamers te illustreren.
- Om de toegankelijkheid van beeldvormingstechnieken voor onderzoekers te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Parafilm snijden in stroken om kanalen te vormen.
- De stroken drogen met gekantelde lucht.
- Een dekglas op de parafilm plaatsen.
- De assemblage op een warmteblok verwarmen om een afdichting te creëren.
Belangrijkste resultaten
- Een functionele stroomkamer werd met succes geconstrueerd.
- Het afdichtingsproces was effectief in het creëren van een stabiele omgeving voor beeldvorming.
- De gedemonstreerde methode is reproduceerbaar voor laboratoriumgebruik.
- Onderzoekers kunnen deze techniek gebruiken voor verschillende beeldvormingstoepassingen.
Conclusies
- De constructie van stroom- en fusiekamers is eenvoudig.
- Deze methode kan geavanceerde beeldvormingsstudies vergemakkelijken.
- Toegankelijkheid tot dergelijke technieken kan onderzoeksresultaten verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables reproducible preparation of controlled microenvironments for live-cell imaging, supporting mechanistic studies of cytoskeletal dynamics. By standardizing flow chamber assembly, it reduces variability in perfusion-based assays, improving data consistency across discovery teams. The method facilitates quantitative analysis of actin disassembly kinetics, a key process in cell motility and signal transduction relevant to target validation in oncology and immunology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct observation of actin depolymerization dynamics to interrogate regulators of cytoskeletal remodeling.
- Operational Value: Provides a standardized platform for testing compound effects on actin turnover in live cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports development of fluorescence-based readouts for actin disassembly rates as a functional assay endpoint.
- Operational Value: Allows solution exchange during time-lapse imaging to assess dose-response relationships under perfusion.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links actin dynamics to cellular phenotypes relevant to metastasis, invasion, and immune synapse formation.
- Operational Value: Enables preclinical assessment of pathway inhibitors using quantifiable imaging biomarkers.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement screening to functional validation in disease-relevant cellular systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cytoskeletal regulators through real-time visualization of actin flux.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible measurements of actin disassembly under controlled perfusion conditions.
- Analytics: Generates time-resolved fluorescence intensity data enabling kinetic modeling of actin turnover.
- Translational Research: Connects molecular mechanism to cellular phenotypes in preclinical models of cell migration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable perfusion platform adaptable to multiple cytoskeletal targets and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of targets involved in actin regulation through direct functional readouts.
- Operational Value: Standardized chamber preparation improves assay reproducibility across sites and operators.
- Strategic Value: Enables earlier go/no-go decisions by linking target modulation to functional cytoskeletal outcomes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on cell motility and invasion phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and microfluidic flow control.
- Depends on access to upright microscopes with environmental control and perfusion capabilities.
- Necessitates standardization of parafilm thickness and sealing parameters for chamber-to-chamber consistency.
- Adaptation to different cell types may require optimization of surface coating and actin polymerization conditions.
- Practical limitations include potential shear stress effects on cells during prolonged perfusion, as noted in the protocol.
