Name: Monitoring Actin Demontage met Time-lapse Microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Leer hoe je een stroomkamer en fusiekamer bouwt voor beeldvorming op een rechtopstaande microscoop met behulp van parafilm en een warmteblok. Deze methode maakt geavanceerde beeldvorming toegankelijk voor onderzoekers.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li> Construeer een stroom geplaatst zoals aangegeven in de video. Zorg ervoor dat de Parafilm afdichting strak is en het gebruik van gewassen dekglaasjes. </li><li> Incubeer actine-bindende middel in de kamer voor 5-10 &#39;. </li><li> Blokkeer niet-specifieke bindingsplaatsen op het glas dekglaasje met een blokkerend eiwit. </li><li> Polymeriseren actine in de kamer door stroomt in G-actine in polymeriseren buffer. </li><li> Wash-out niet-gepolymeriseerde actine door stromend dan buffer. </li></ol>

monitoring actin demontage met time-lapse microscopie

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Monitoring Actin Demontage met Time-lapse Microscopie

Vandaag wil ik u laten zien hoe u een flowkamer construeert, een fusiekamer voor beeldvorming op een rechtopstaande microscoop. Hiervoor creëer ik twee ruimtes met behulp van folie. Ik neem hiervoor parafilm en snijd dit in kleine stroken.Vervolgens ga ik, dit zal in feite de kanalen voor de wanden vormen, en ik droog ze met een schuine luchtstroom. Ik plaats het dekglas bovenop de paraffine, en hier is het resultaat. Daarna verhit ik het op een warmteblok om de paraffine te smelten en zo in feite een afdichting te creëren.Dit is dus het dekglas hier, en bovenop het dekglas bevinden zich twee lagen phim, zoals u hier ziet. En daarop ligt vervolgens weer een dekglas van 22 bij 22 mm. Dit exemplaar hier, dat ik tegen de param heb gedrukt om de verzegeling te vormen.Oké, de vloeistof stroomt hier in één richting naar binnen en ik kan deze hier in deze richting wegzuigen met een filterpapier. Ik zal u zo laten zien hoe u dat doet. Wat ik graag doe, is het in een bevochtigingskamer plaatsen, wat heel eenvoudig is.Neem twee soorten verhoogde strips en plaats daar een filterpapier onder. Om het systeem afgesloten te houden, plaats ik het dekglas op de flowcel. De manier waarop u een oplossing in de cel introduceert, is door de pipetpunt bij de ingang van de cel te plaatsen en vervolgens te dispenseren.Vervolgens incubeer ik de kamer gedurende 10 minuten met het deksel gesloten. Om de vloeistof aan de andere zijde af te zuigen, gebruik ik gewoonlijk filterpapier dat in dunne strips is gesneden, zoals hier te zien is. Ik neem een van deze dunne strips en breng gelijktijdig de oplossing aan bij de ingang, terwijl ik het filterpapier bij de uitgang plaats om de uitwisselingsoplossing op te zuigen.U ziet nu de vloeistof door de oplossing stromen. Vervolgens wacht ik vijf minuten tot de afsluiting voltooid is. Nu ben ik klaar om het actine toe te voegen; ik moet het actine polymeriseren, wat ik binnen de flowkamer doe volgens dezelfde procedures als hiervoor.Omdat de actine nu gepolymeriseerd is, spoel ik alle overtollige, niet-gepolymeriseerde actine weg met een groot volume buffer. Ik gebruik hier ongeveer 100 µL, wat overeenkomt met enkele volumes van de reactiekamer aan buffer. Zodra het filterpapier verzadigd raakt, moet ik de richting veranderen. Oké?Ik ben nu klaar om hiermee beelden op te nemen. De perfusiekamer is voorzien van gebonden actine. Nu neem ik het objectglas, monteer ik het onder de microscoop en aangezien ik beelden opneem met een olie-objectief, breng ik immersie-olie aan op het bovenoppervlak van het dekglas, zodat de oplossing, het eiwit of wat er ook aan het actine is gebonden, behouden blijft.Wat ik dus doe, is dat ik de oplossing aan de ene zijde kan vervangen terwijl ik de time-lapse imaging uitvoer. Op die manier.

monitoring-actin-disassembly-with-time-lapse-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Microscopische beeldvorming van levende endotheliale cellen die GFP-actine maakt karakterisering van dynamische veranderingen in het cytoskelet structuren. In tegenstelling tot technieken die vaste exemplaren te gebruiken, deze methode geeft een gedetailleerde evaluatie van de tijdelijke veranderingen in het actine cytoskelet in dezelfde cellen voor, tijdens en na de diverse fysieke, farmacologische of inflammatoire stimuli.

Studie van het actine cytoskelet in Live endotheliale cellen die GFP-actine

Microtubules zijn inherent instabiel polymeren en hun schakelen tussen groei en bakvet stochastische en moeilijk te controleren. Hier beschrijven we protocollen gebruiken gesegmenteerde microtubuli met photoablatable stabiliserende caps. Depolymerisatie van gesegmenteerde microtubuli kan worden geactiveerd met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie, waardoor het bijstaan ​​van de analyse van bewegingen met de demontage uiteinden van microtubuli.

Voorbereiding van Segmented Microtubules om Motions Gedreven door het demonteren uiteinden van microtubuli Studie

We beschrijven hoe micro- en photomanipulation technieken zoals FRAP en photoactivation inschakelen de bepaling van de parameters van de beweeglijkheid en de spatio dynamiek van eiwitten in het migreren van cellen. Experimentele uitlezingen omvatten subcellular dynamiek en omzet van beweeglijkheid toezichthouders of van de onderliggende actine cytoskelet.

Micromanipulation technieken waardoor analyse van morfogenetische dynamiek en een omzet van Cytoskeletal regelgevers

We rapporteren een eenvoudige, tijdsefficiënte en op fluorescentiespectroscopie gebaseerde test met hoge doorvoer voor de kwantificering van actinefilamenten in ex vivo biologische monsters van hersenweefsels van knaagdieren en menselijke proefpersonen.

Een tijdsefficiënte fluorescentiespectroscopie-gebaseerde test voor het evalueren van de Actin-polymerisatiestatus in knaagdier- en menselijke hersenweefsels

Hier wordt een uitgebreid protocol gepresenteerd om ultrasnelle krachtklemexperimenten uit te voeren op processieve myosine-5-motoren, die gemakkelijk kunnen worden uitgebreid naar de studie van andere klassen processieve motoren. Het protocol beschrijft alle noodzakelijke stappen, van de opstelling van het experimentele apparaat tot monstervoorbereiding, gegevensverzameling en analyse.

Het ontleden van mechano-enzymatische eigenschappen van processieve myosinen met ultrasnelle krachtklemspectroscopie

We presenteren protocollen voor eenvoudige actinefilamentmicrofluïdische assays, in combinatie met fluorescentiemicroscopie, waarmee men individuele actinefilamenten in realtime nauwkeurig kan volgen terwijl ze sequentieel worden blootgesteld aan verschillende eiwitoplossingen.

Microfluïdica en fluorescentiemicroscopie gebruiken om de assemblagedynamiek van single actinefilamenten en -bundels te bestuderen

Dit protocol beschrijft de vorming van ondersteunde lipide bilayers en de toevoeging van cytoskeletale filamenten en motoreiwitten om de dynamiek van gereconstitueerde, membraangebonden cytoskeletale netwerken te bestuderen met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Reconstitutie van membraangebonden minimale actinecorticosterces op ondersteunde lipidebilagen

Dit protocol is een gids voor het visualiseren van dynamische actine en microtubuli met behulp van een in vitro total internal fluorescence (TIRF) microscopie assay.

Visualisatie van actine en microtubulikoppelingsdynamiek in vitro door total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie

Dit artikel presenteert protocollen voor het engineeren en karakteriseren van afstembare driedimensionale composietnetwerken van co-verstrengelde actinefilamenten en microtubuli. Composieten ondergaan actieve herstructurering en ballistische beweging, aangedreven door myosine II- en kinesinemotoren, en worden afgestemd op de relatieve concentraties actine, microtubuli, motoreiwitten en passieve crosslinkers.

Reconstitueren en karakteriseren van Actin-Microtubule Composieten met instelbare motoraangedreven dynamica en mechanica

In dit werk wordt een in vitro reconstitutiebenadering gebruikt om de poro-elasticiteit van actomyosinegels onder gecontroleerde omstandigheden te bestuderen. De dynamiek van de actomyosinegel en het ingebedde oplosmiddel worden gekwantificeerd, waardoor de netwerkporo-elasticiteit wordt aangetoond. We bespreken ook de experimentele uitdagingen, veelvoorkomende valkuilen en relevantie voor celcytoskeletmechanica.

De mechanica van (poro-)elastische contractiele actomyosinenetwerken als modelsysteem van het celcytoskelet

Hier presenteren we methoden voor het bereiden van quasi-tweedimensionale (2D) verstrengelde, verknoopte en vloeibare kristalactine-assemblages van gezuiverde eiwitten.

Het afstemmen van de contractiliteit en vervormingsmodi van actieve op actine gebaseerde assemblages in vitro: van tweedimensionale actieve netwerken tot druppels van vloeibare kristallen

Leer hoe je een stroomkamer en fusiekamer bouwt voor beeldvorming op een rechtopstaande microscoop met behulp van parafilm en een warmteblok. Deze methode maakt geavanceerde beeldvorming toegankelijk voor onderzoekers.

Monitoring Actin Demontage met Time-lapse Microscopie

Meer video's verkennen