Name: Ex vivo live beeldvorming gebruiken om celdelingen en bewegingen tijdens tandvernieuwing bij muizen te onderzoeken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-27T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Leer ex vivo live beeldvorming met tweefotonenmicroscopie om celdelingen in muizenknaagtanden te volgen. Deze techniek maakt real-time observatie van dynamische celgedragingen tijdens weefselvernieuwing mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We erkennen het UCLA Advanced Light Microscopy/Spectroscopy Laboratory en Leica Microsystems Center of Excellence bij het California NanoSystems Institute (RRID: SCR_022789) voor het leveren van twee-fotonmicroscopie. AS werd ondersteund door ISF 604-21 van de Israel Science Foundation. JH werd ondersteund door R03DE030205 en R01DE030471 van de NIH/NIDCR. AS en JH werden ook ondersteund door subsidie 2021007 van de United States-Israel Binational Science Foundation (BSF).

Alle muizen werden gehouden in pathogeenvrije dierfaciliteiten aan de Universiteit van Californië Los Angeles (UCLA) of de Hebreeuwse Universiteit van Jeruzalem (HUJI). Alle experimenten met muizen werden uitgevoerd volgens voorschriften en protocollen die zijn goedgekeurd door de respectieve Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (ARC-2019-013; UCLA) of (MD-23-17184-3; HUJI). Een algemene workflow van de experimentele stappen is weergegeven in figuur 2A. Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle instrumenten, reagentia en materialen die in dit protocol worden gebruikt.
1. Bereiding van oplossingen en gels
<ol><li>Dissectiemedium: Bereid verse DMEM/F12 met 0,5% glucose en houd deze warm bij 37 °C tot het nodig is in stap 2.4. OPMERKING: We gebruiken DMEM/F12 zonder fenolrood om autofluorescentie tijdens live beeldvorming te verminderen.</li>
	<li>1x kweekmedium: Bereid vers medium met 50% DMEM/F12, 50% rattenserum, 1x glutaminevervanger, 1x MEM niet-essentiële aminozuren, 1% glucose, 0,1 mg/ml L-ascorbinezuur en 0,5% penicilline-streptomycine. Houd het warm op 37 °C tot het nodig is in stap 5.5. Dit medium wordt gebruikt voor het kweken van explantaten snijtanden tijdens live beeldvorming. OPMERKING: Het rattenserum moet van hoge kwaliteit zijn en speciaal zijn bereid voor het kweken van hele weefsels door onderzoekers of van een commerciële bron. In het bijzonder moet het bloed worden gecentrifugeerd (gedurende 5 minuten bij 1.200 × g bij kamertemperatuur) voordat de stolling zich begint te vormen. Na centrifugeren moet het resulterende fibrinestolsel worden uitgeknepen en weggegooid33.</li>
	<li>Kweekgel: Het doel van de gel is om monsters te immobiliseren tijdens beeldvorming en wordt vers bereid.<ol><li>Maak 2% gel in DMEM/F12 door 200 mg agarose met een laag smeltpunt op te lossen in 10 ml DMEM/F12 met behulp van een magnetron. Houd de 2% gel op 37 °C.</li>
		<li>Maak 2x kweekmedium (zonder DMEM/F12) door 50% rattenserum, 1x glutaminevervanger, 1x MEM niet-essentiële aminozuren, 1% glucose, 0,1 mg/ml L-ascorbinezuur en 0,5% penicilline-streptomycine te mengen. Verwarm het 2x kweekmedium (zonder DMEM/F12) tot 37 °C.</li>
		<li>Maak 1% kweekgel door gelijke volumes van 2% gel en 2x kweekmedium (zonder DMEM/F12) te mengen. Houd de 1% kweekgel op 37 °C tot het nodig is in stap 5.1. NOTITIE: Zorg ervoor dat alle oplossingen warm zijn voordat u ze mengt om geleren te voorkomen. We vonden 1% gel geschikt voor het kweken van de snijtand voor volwassen muizen. Het gelpercentage moet empirisch worden bepaald als andere weefsels moeten worden gekweekt.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Extractie van de volwassen muizenkaken
<ol><li>Euthanaseer muizen op de gewenste leeftijd met behulp van standaardprocedures die zijn goedgekeurd door de IACUC. OPMERKING: Hier gebruiken we CO2 -verstikking gevolgd door cervicale dislocatie. De regelgeving voor euthanasie bij dieren kan per regio verschillen. Onderzoekers moeten de nodige institutionele goedkeuring verkrijgen voordat ze experimenten uitvoeren en ervoor zorgen dat ze voldoen aan de lokale regelgeving voor dierenverzorging.</li>
	<li>Desinfecteer de muis met 70% ethanol.</li>
	<li>Onthoofd de muis en haal de linker- en rechterkaken eruit.<ol><li>Leg de muis op zijn buik en gebruik vervolgens een #9 industrieel scheermesje met één rand om in de nek te snijden en de muiskop te scheiden van de rest van het lichaam. OPMERKING: Als er ook weefsels uit de keelholte of het nekgebied moeten worden verzameld, mag onthoofding niet worden uitgevoerd en kan men direct doorgaan naar stap 2.3.2.</li>
		<li>Draai de muis om zodat de buikzijde naar boven wijst en de kaken gemakkelijk toegankelijk zijn.</li>
		<li>Zet de kop van het dier vast door deze voorzichtig tussen duim en wijsvinger te houden.</li>
		<li>Gebruik het scheermesje om een mid-sagittale incisie te maken die over de huid van de onderkaak snijdt van de onderlip naar de halslijn. OPMERKING: Een #15 chirurgisch mes kan ook worden gebruikt om de incisie en daaropvolgende dissecties te maken (stappen 2.3.6-2.3.9).</li>
		<li>Terwijl de incisie wordt gemaakt, spreidt u de gesneden huid open met de duim en de wijsvinger om de spieren en het kaakbot eronder bloot te leggen.</li>
		<li>Gebruik het scheermesje om de kauwspieren aan de buccale zijde van de onderkaak door te snijden, zodat de buitenkant van de linker- en rechterhersenhelft nu vrij is van spieraanhechtingen.</li>
		<li>Snijd de mylohyoid-spieren langs de binnenkant van de onderkaak door om daar spieraanhechtingen te verwijderen.</li>
		<li>Maak nog een incisie bij de mandibulaire symfyse die de twee hemimandibles met elkaar verbindt. Eenmaal gesneden, wordt de onderkaak gescheiden in de linker- en rechterhelft.</li>
		<li>Klem het scheermesje tussen de mandibulaire condylus en het temporale mandibulaire gewricht en ontleed voorzichtig het hemimandible van de rest van het hoofd. OPMERKING: We vonden het handig om tegelijkertijd zachtjes aan de snijtand te trekken tijdens het snijden. Er moet voor worden gezorgd dat de onderkaak niet breekt en de zachte weefsels binnenin worden beschadigd.</li>
	</ol></li>
	<li>Breng de ontlede onderkaken onmiddellijk over in een petrischaal met de voorverwarmde dissectiemedia (stap 1.1) en verwijder de resterende spierweefsels met behulp van een #15 chirurgisch mes. OPMERKING: Het bewaren van monsters in koude media vertraagt de celactiviteiten, wat resulteert in vertraagd of zelfs mislukt herstel van bepaalde celactiviteiten, zoals proliferatie of celbeweging, tijdens live beeldvorming.</li>
</ol>3. Isolatie van de snijtanden van de hele muis
OPMERKING: Verdere isolatie van de snijtand wordt gedaan onder een heldervelddissectiemicroscoop.
<ol><li>Identificeer visueel het ovale gebied van de onderkaak dat de snijtand bedekt en het apicale deel van de snijtand herbergt.</li>
	<li>Plaats de onderkaak zo dat het binnenste (linguale) oppervlak naar boven wijst.</li>
	<li>Terwijl u de onderkaak op zijn plaats houdt met een gekartelde pincet, genereert u een venster in het ovale gebied door het bovenliggende membraanbot af te scheren met een #15 chirurgisch mes, in een richting die van de condylus naar de kiezen is. Hierdoor komt het zachte weefsel van de apicale snijtand aan de binnenkant bloot te liggen.</li>
	<li>Draai de onderkaak om zodat het buitenste (buccale) oppervlak naar boven wijst.</li>
	<li>Genereer een venster in het ovale gebied op de buitenonderkaak zoals beschreven in stap 3.3 en gebruik de punt van de scalpel om eventuele resterende botfragmenten aan de rand weg te halen. Zorg ervoor dat het apicale uiteinde van de tand van beide kanten zichtbaar is. NOTITIE: Vermijd overmatige druk tijdens het scheren van de botten om schade aan het onderliggende zachte weefsel te voorkomen.</li>
	<li>Snijd systematisch de botten rond de snijtand weg om de hele tand te isoleren.<ol><li>Maak een zuivere snede in een vlak dat direct grenst aan de apicale snijtand om eerst de processus condylair te verwijderen. NOTITIE: Pas op dat u niet in de snijtand snijdt.</li>
		<li>Maak een tweede snede net achter de 3e kies, maar dorsaal van de snijtand zonder de tand te beschadigen. Dit verwijdert het bot dat de processus coronoides omvat.</li>
		<li>Serieel gesneden vanaf de punt van de processus angularis naar de snijtand om de ventrale onderkaak geleidelijk stapsgewijs te verwijderen. OPMERKING: Het tandepitheel en de bijbehorende parodontale weefsels zitten vaak aan het bot vast en worden gemakkelijk afgescheurd als een groot deel van het ventrale bot in één keer wordt doorgesneden. Om het bot van het zachte weefsel van de snijtand te scheiden, kan men de scalpel (of een scherpe niet-gekartelde pincet) tussen de twee weefsels aan het apicale uiteinde van de snijtand steken en het instrument voorzichtig naar voren schuiven.</li>
		<li>Snijd het alveolaire bot met kiezen weg en eventuele resterende botten die nog aan de snijtand vastzitten.</li>
		<li>De hele snijtand is nu geïsoleerd. Breng de volledig ontlede snijtand over in een schaal met schone, warme snijmedia (stap 1.1).</li>
	</ol></li>
	<li>Herhaal stap 3.2-3.6 om indien nodig extra snijtanden te isoleren. OPMERKING: De maxillaire/bovenste snijtanden van de muis behouden ook volwassen stamcellen en kunnen worden gebruikt om tandregeneratie te bestuderen34. Tandheelkundig onderzoekers richten zich meestal op de onderste snijtanden omdat ze toegankelijker zijn en gemakkelijker kunnen worden ontleed dan de bovenste snijtanden. Verschillen tussen voorlopercellen van de onderkaak en de maxillaire snijtanden moeten nog worden bepaald.</li>
</ol>4. Verwijdering van parodontale weefsels om de cervicale lus van de snijtand bloot te leggen
<ol><li>Met de hele snijtand liggend op de linguale kant en terwijl u de tand op zijn plaats houdt met een gekartelde pincet, gebruikt u een paar #5 fijne pincetten om te beginnen met het instoppen van de parodontale weefsels die de apicale snijtand en het cervicale lusgebied bedekken.</li>
	<li>Trek voorzichtig het parodontale weefsel van de apicale knop, zodat de laterale zijde van de cervicale lus (of andere interessegebieden) zichtbaar wordt onder de scoop. OPMERKING: Er moet voor worden gezorgd dat het tandepitheel niet wordt beschadigd of loskomt van het mesenchym. Als de snijtand fluorescentiesignalen heeft in het interessegebied en er een fluorescerende dissectiemicroscoop beschikbaar is, kunnen fluorescentiesignalen worden gebruikt om onderscheid te maken tussen weefseltypes en dissecties te ondersteunen. Het is belangrijk om secties 2-4 efficiënt uit te voeren, zodat monsters snel kunnen worden overgebracht naar de kweekmedia en adequaat kunnen worden onderhouden door middel van explantatiekweek (zie hieronder).</li>
</ol>5. Weefselinbedding voor explantatiekweek
<ol><li>Voeg 500 μL warme, niet-gestolde kweekgel toe aan een putje in een plaat met 24 putjes en breng de ontlede hele snijtanden snel over naar het putje. Draai de plaat een paar keer rond om de snijtanden te spoelen.</li>
	<li>Voeg 400 μL warme, ongestolde kweekgel toe aan een kweekschaal en breng de gespoelde snijtanden over in de schaal. NOTITIE: We gebruiken een in de handel verkrijgbare kweekschaal die compatibel is met de perfusie-opstelling. Zie stap 6.4 voor alternatieve opties.</li>
	<li>Oriënteer de snijtand om het cervicale lusgebied (of andere interessante gebieden) in het midden van de schaal te plaatsen (Figuur 2A,B) en pas de kanteling van de apicale snijtand aan voor het gewenste beeldvlak. OPMERKING: Weefseloriëntatie moet snel worden gedaan voordat de gel volledig is.</li>
	<li>Nadat de gel is uitgehard, gebruikt u een fijne pincet om alle gel bovenop het interessegebied te verwijderen, zodat deze niet door de gel wordt bedekt.</li>
	<li>Voeg een voldoende hoeveelheid warme kweekmedia toe door deze langzaam tegen de rand van de schaal te pipetteren om het monster net te bedekken (~150 μL).</li>
	<li>Verplaats de explantatiecultuur naar een celkweekincubator van 37 °C om gedurende 1 uur weefselbezinking en aanpassing aan de kweektoestand mogelijk te maken.</li>
</ol>6. Timelapse-microscopie van snijtandexplantaten
OPMERKING: In dit experiment gebruikten we een rechtopstaande microscoop die was uitgerust met een 25x waterdompelobjectief met een numerieke apertuur van 1. Over het algemeen is een waterdompellens met een hoge numerieke apertuur het meest geschikt voor beeldvorming van diep weefsel.
<ol><li>Zet de microscoop en de twee-fotonlaser aan.</li>
	<li>Bevestig de kweekschaal aan de tafeladapter en monteer de perfusieadapterring erop (Figuur 2C).</li>
	<li>Sluit de stage-adapter aan op een temperatuurregelaar die is ingesteld om de cultuur op 37 °C te houden.</li>
	<li>Sluit de inlaat en de uitlaat van de adapterring aan op een microperfusiepomp en begin met de perfusie van het kweekmedium, met de perfusiesnelheid ingesteld op 20 op de pomp. Dit genereert een langzame stroom (~5 ml/uur) van het kweekmedium over de bovenkant van de monsters (Figuur 2C). OPMERKING: Zie de materiaaltabel voor details over het systeem om het weefsel in een stabiel gecontroleerde omgeving te houden. Er kunnen ook andere systemen worden gebruikt. Er kan ook een combinatie worden gebruikt van een verwarmingsplaat van 37 °C en een zelfgemaakte perfusiekweekschaal (aanvullende figuur S1) met een inlaat en een uitlaat die is aangesloten op spuitpompen.</li>
	<li>Plaats een Atmospheric Control Barrier Ring (ACBR) bovenop de adapterring en laat het objectief door de ACBR zakken om net contact te maken met het kweekmedium (Figuur 2D).</li>
	<li>Stem de lasergolflengte af op 920 nm om zowel GFP- als rode fluorescentiesignalen (bijv. tdTomato) te visualiseren.</li>
	<li>Lokaliseer monsters via oculairs en vervolgens via de software van de microscoop.</li>
	<li>Stel Z-stacks, multi-position imaging en tijdsintervallen in met behulp van de software. Om dit protocol te volgen, gebruikt u een z-stapgrootte van 4 μm en een tijdsinterval van 5 minuten gedurende 14 uur. OPMERKING: We ontdekten dat een tijdsinterval van langer dan 5 minuten vaak onvoldoende is om vloeiende celbewegingen en -delingen vast te leggen.</li>
	<li>Start de timelapse-beeldvorming. NOTITIE: De monsterpositie kan tijdens het eerste uur verschuiven en verdere aanpassingen kunnen nodig zijn.</li>
	<li>Sla bestanden op voor downstream gegevensverwerking en analyses.</li>
</ol>

Live volgen van tandcellen via twee-fotonmicroscopie

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Beeldvorming van levend weefsel is een belangrijke techniek die ons in staat stelt de dynamische processen en gedragingen van cellen te bestuderen wanneer ze in hun niche-omgeving worden gehouden41. Idealiter wordt live beeldvorming in vivo uitgevoerd met een hoge spatiotemporele resolutie. In vivo beeldvorming voor zoogdierorganen kan echter een uitdaging zijn vanwege de ontoegankelijkheid van weefsel, optische ondoorzichtigheid en de moeilijkheid om het dier of het orgaan gedur...

In de afgelopen twee decennia is de snijtand van muizen naar voren gekomen als een platform van onschatbare waarde voor het onderzoeken van de principes van volwassen stamcelregulatie en tandregeneratie 1,2. De muizensnijtand groeit continu en vernieuwt zichzelf gedurende het hele leven van het dier. Het doet dit door zowel epitheliale als mesenchymale stamcellen in stand te houden, die zichzelf kunnen vernieuwen en differentiëren in verschillende celtypen van de tand 1,2. Terwijl tandepitheliale stamcellen aanleiding geven tot ameloblasten, die de glazuurmatrix afscheiden, geven tandheelkundige mesenchymale stamcellen aanleiding tot odontoblasten, cementoblasten en fibroblasten, die respectievelijk dentine, cement en parodontaal ligament vormen 3,4,5,6. Deze constante toevoer van nieuwe cellen handhaaft de weefselhomeostase en maakt de vervanging mogelijk van oude cellen die verloren zijn gegaan als gevolg van kauwslijtage of verwondingen 7,8. Het ophelderen van de cellulaire en moleculaire mechanismen die het onderhoud en de differentiatie van tandheelkundige stamcellen reguleren, staat daarom centraal in het begrijpen van tandheelkundige regeneratie, een gebied van groeiende belangstelling.
Anatomisch gezien is een groot deel van de snijtand van de volwassen muis ingekapseld in het kaakbot. Terwijl de incisale rand van de tand zichtbaar is, past het apicale uiteinde van de snijtand in een kom en is het stevig bevestigd aan het omringende bot via parodontale ligamenten en bindweefsel (Figuur 1A,B). Het apicale uiteinde van de snijtand is ook het groeigebied van de tand en onderhoudt tandstam- en voorlopercellen in zowel de epitheellaag als de mesenchymale pulpa 9,10,11,12,13. In het bijzonder worden tandepitheelstamcellen gehandhaafd aan het bolvormige uiteinde van het epitheel, bekend als de apicale knop, ook wel de labiale cervicale lus genoemd (Figuur 1C). Net als bij het darmepitheel en de epidermis, wordt de epitheelvernieuwing in de snijtand voornamelijk ondersteund door actief cyclende stamcellen en hun zeer proliferatieve intermediaire afstammelingen, transit-amplificerende cellen 14,15,16,17 genaamd, die zich beide in het binnenste deel van de cervicale lus bevinden. Of het snijtandepitheel tijdens de regeneratie slapende stamcellen bevat en gebruikt, moet echter nog worden bepaald. Daarentegen zijn zowel actieve als slapende dentale mesenchymale stamcellen geïdentificeerd in de apicale pulpa, en de slapende stamcellen functioneren als een reservepopulatie die wordt geactiveerd tijdens het herstel van letsel13,18.
Veel van de ontdekkingen over de biologie van de vernieuwing en regeneratie van de snijtanden van muizen zijn het resultaat van histologisch onderzoek, waarbij monsters op verschillende tijdstippen worden verkregen, gefixeerd, verwerkt en vervolgens in microndunne plakjes langs een bepaald vlak worden verdeeld. Door gedetailleerde analyse van histologische secties van verschillende muismodellen die het traceren van afstammingslijnen of genetische verstoringen mogelijk maken, hebben wetenschappers de cellijnen van verschillende voorloperpopulaties geïdentificeerd, evenals de genetische en signaalroutes die de homeostase van de snijtanden en het herstel van verwondingen regelen 19,20,21 . De statische tweedimensionale (2D) beelden van niet-vitale cellen in secties kunnen echter niet het volledige spectrum van cellulair gedrag en ruimtelijke organisaties in levend weefsel vastleggen, zoals veranderingen in celvorm, bewegingen en cellulaire kinetiek. Het detecteren en meten van deze snelle cellulaire veranderingen, die optreden op een tijdschaal die onoplosbaar is door weefselsectie, vereist een andere strategie. Bovendien is het verkrijgen van dergelijke informatie ook van cruciaal belang om te begrijpen hoe tandcellen met elkaar omgaan, reageren op verschillende signaalstimuli en zichzelf organiseren om weefselstructuren en -functies te behouden.
De komst van vierdimensionale (4D) diepe weefselbeeldvorming met behulp van twee-fotonmicroscopie22, een technologie die drie ruimtelijke dimensies integreert met temporele resolutie, overwint de inherente beperkingen van histologische analyse door spatiotemporeel onderzoek van gekweekte weefselexplantaten, organoïden of zelfs weefsels in situ mogelijk te maken 23,24,25,26 . 4D live beeldvorming van het zich ontwikkelende tandepitheel heeft bijvoorbeeld de spatiotemporele patronen van celdelingen en migraties onthuld die weefselgroei, signaalcentrumvorming en tandepitheliale morfogenese coördineren 27,28,29,30,31,32. In de snijtand van volwassen muizen is onlangs 4D-beeldvorming aangepast om cellulair gedrag te bestuderen tijdens herstel van tandepitheelletsel. Live beeldvorming onthulde dat stratum intermedium cellen in de suprabasale laag direct kunnen worden omgezet in ameloblasten in de basale laag om het beschadigde epitheel te regenereren, waardoor het traditionele paradigma van herstel van epitheelletsel wordt uitgedaagd15.
Hier beschrijven we de dissectie, kweek en beeldvorming van de snijtand van volwassen muizen, met de nadruk op epitheelcellen in de labiale cervicale lus (Figuur 1). Deze techniek behoudt de vitaliteit van de tandcellen gedurende meer dan 12 uur en maakt het mogelijk om fluorescerend gelabelde cellen live te volgen met een resolutie van één cel. Deze benadering maakt het mogelijk om celbeweging en -migratie te onderzoeken, evenals dynamische veranderingen in celvorm en delingsoriëntatie onder normale kweekomstandigheden, of in reacties op genetische, fysische en chemische verstoringen.

<table><tbody><tr><td>24 well, flat bottom tissue culture plate</td><td>Olympus plastics</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>25x HC IRAPO motCORR water dipping objective</td><td>Leica</td><td>11507704</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic acid (Vitamin C)</td><td>Acros Organics</td><td>352685000</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose bioxtra&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Delta T system&nbsp;</td><td>Bioptechs</td><td>0420-4</td><td>Met temperatuurregeling, kweekschalen en perfusie-opstelling</td></tr><tr><td>Dissection microscope- LEICA S9E</td><td>Leica</td><td>LED300 SLI</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Scientific</td><td>11039047</td><td>Basaal medium zonder fenolrood</td></tr><tr><td>Feather chirurgisch mes (#15)</td><td>Feather</td><td>72044-15</td><td></td></tr><tr><td>Fijne pincet</td><td>F.S.T</td><td>11252-23</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>35050-061</td><td>Glutamine-vervanger</td></tr><tr><td>Leica SP8-DIVE uitgerust met een 25X HC IRAPO motCORR water-dipping objectief&nbsp;</td><td>Leica</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Laagsmeltende agarose</td><td>NuSieve</td><td>50080</td><td></td></tr><tr><td>Niet-essentiële aminozuren (100x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline&ndash;streptomycine</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140122</td><td>10.000 U/mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>Gen Clone</td><td>32-107G</td><td>90 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Rattenserum</td><td>Valley Biomedical</td><td>AS3061SC</td><td>Verwerkt voor live beeldvorming</td></tr><tr><td>Veiligheidsmes #9</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Scalpelgreep</td><td>F.S.T</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Schaar</td><td>F.S.T</td><td>37133</td><td></td></tr><tr><td>Gekartelde pincet</td><td>F.S.T</td><td>11000-13</td><td></td></tr><tr><td>Vedermes</td><td>F.S.T</td><td>91500-09</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo live beeldvorming gebruiken om celdelingen en bewegingen tijdens tandvernieuwing bij muizen te onderzoeken

Using Ex Vivo Live Imaging to Investigate Cell Divisions and Movements During Mouse Dental Renewal

De continu groeiende muizensnijtand is in opkomst als een zeer handelbaar modelsysteem om de regulatie van volwassen epitheliale en mesenchymale stamcellen en tandregeneratie te onderzoeken. Deze voorloperpopulaties delen, verplaatsen en differentiëren actief om de weefselhomeostase te handhaven en verloren cellen op een responsieve manier te regenereren. Traditionele analyses met behulp van vaste weefselsecties konden de dynamische processen van cellulaire bewegingen en interacties echter niet vastleggen, waardoor ons vermogen om hun regulatie te bestuderen werd beperkt. Dit artikel beschrijft een protocol voor het onderhouden van hele muizensnijtanden in een explantatiekweeksysteem en live-track tandepitheelcellen met behulp van multifoton timelapse-microscopie. Deze techniek is een aanvulling op onze bestaande gereedschapskist voor tandheelkundig onderzoek en stelt onderzoekers in staat om spatiotemporele informatie te verkrijgen over celgedrag en organisaties in een levend weefsel. We verwachten dat deze methodologie onderzoekers zal helpen bij het verder onderzoeken van mechanismen die de dynamische cellulaire processen beheersen die plaatsvinden tijdens zowel tandheelkundige vernieuwing als regeneratie.

Het apicale gebied van de snijtand van de volwassen muis is ingekapseld in de onderkaak (figuur 1) en is daarom niet direct toegankelijk voor het visualiseren en live volgen van de voorlopercellen die zich in het groeigebied bevinden. Daarom hebben we een methode ontwikkeld om de hele snijtand uit het kaakbot te halen en te bewaren in een explantatiekweeksysteem voor timelapse-microscopie met twee fotonen (Figuur 2). Hier beschrijven we representatieve resultate...

Ex vivo live beeldvorming is een krachtige techniek voor het bestuderen van de dynamische processen van cellulaire bewegingen en interacties in levende weefsels. Hier presenteren we een protocol dat twee-fotonmicroscopie implementeert om tandepitheelcellen live te volgen in gekweekte snijtanden van hele volwassen muizen.

Ex vivo live beeldvorming gebruiken om celdelingen en bewegingen tijdens tandvernieuwing bij muizen te onderzoeken

The continuously growing mouse incisor is emerging as a highly tractable model system to investigate the regulation of adult epithelial and mesenchymal ...

Om de juiste cellulaire organisatie te behouden tijdens orgaanvernieuwing, beweegt weefsel dat de cellen nadert en deelt het specifieke oriëntaties en patronen. Het is daarom belangrijk om de regels en voorschriften van deze dynamische cellulaire gebeurtenissen te begrijpen. De muizensnijtand is een opkomend model voor onderzoek naar volwassen stamcellen en er zijn veel genetische hulpmiddelen beschikbaar in het systeem om genfuncties te bestuderen en cellen te labelen voor het traceren van afstamming.De meeste onderzoeken tot nu toe maken gebruik van gebitsmonsters voor volwassenen die zijn verzameld en de specifieke tijdstippen hebben vastgelegd, en dit verhindert ons om het gedrag van levenscellen te onderzoeken. In dit protocol beschrijven we een methode om de levensstijl van de snijtand van volwassen muizen te volgen, en deze techniek zal toekomstige studies mogelijk maken die tot doel hebben te begrijpen hoe dynamisch celgedrag bijdraagt aan de vernieuwing en het herstel van tandweefsels.

using-ex-vivo-live-imaging-to-investigate-cell-divisions-movements

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Hier ontwikkelen we de instrumenten die nodig zijn voor...

Ex vivo Live-Imaging van Single Cell Divisies in Muis neuroepithelium

Progenitorceltransplanten mitose is een kritische parameter van neurogenese. Veel van onze kennis van neurale voorlopercellen mitose is gebaseerd op de analyse van vaste weefsel. Live-beeldvorming in de embryonale hersenen plakjes is een veelzijdige techniek om mitose te beoordelen met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie in een gecontroleerde omgeving.

Live-Imaging van mitose in het ontwikkelen van muis embryonale Cortex

Hier presenteren we een protocol voor live imaging van muis secundaire paletfusie met behulp van confocale microscopie. Dit protocol kan worden gebruikt in combinatie met een verscheidenheid aan fluorescerende reporter muis lijnen, en met pathway inhibitors voor mechanistisch inzicht. Dit protocol kan aangepast worden voor livebeelden in andere ontwikkelingssystemen.

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Immunofluorescerende beeldvorming wordt beperkt door het vermogen om complexe, tijdsafhankelijke biologische processen in slechts één momentopname in de tijd waar te nemen. Deze studie schetst een live-imaging-benadering die wordt uitgevoerd op nauwkeurig gesneden plakjes submandibulaire klier van muizen. Deze aanpak maakt de real-time observatie mogelijk van cel-cel interacties tijdens homeostase en de processen van regeneratie en herstel.

Ondervraging van cel-celinteracties in de speekselklier via ex vivo beeldvorming van levende cellen

Hier presenteren we een protocol om faryngeale bogen te kweken om de biologie van hart- en spiervoorlopercellen en hun micro-omgeving te bestuderen.

Ex Vivo Cultuur van pharynxbogen to Heart en Muscle voorouders en hun niche Studie

De ex vivo rechtopstaande druppelcultuur is een alternatief voor huidige in vitro en in vivo experimentele technieken. Dit protocol is eenvoudig uit te voeren en vereist kleinere hoeveelheden reagens, terwijl het de mogelijkheid biedt om foetale vasculaire vorming, morfogenese en organogene te manipuleren en te bestuderen.

Gebruik<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Culturen van Whole Foetale organen Developmental processen te bestuderen tijdens Mouse Organogenese

Het doel van dit protocol is een verliesgevende beschrijven en gain-of functiemethode dat geldt voor neogenin identificeren als een stadium-specifieke receptor die tot trophectoderm en binnenste celmassa differentiatie van pre-implantatie muizenembryo's is.

Verlies- en Gain-of-function Aanpak Early Cell Fate Determinanten Onderzoek in Pre-implantatie muizenembryo&#39;s

Door celtransplantatie, cytoskelettenlabeling en verlies/winst van functiebenaderingen te combineren, beschrijft dit protocol hoe de migrererende zebravis prospectieve prechordale plaat kan worden gebruikt om de functie van een kandidaatgen in in vivo celmigratie te analyseren.

analyseren<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Migratie behulp Cell Transplantaties en Time-lapse Imaging in zebravis embryo&#39;s

Een methode om verschillende gehumaniseerde beenmergnissen in muizen te creëren en te leven, wordt gepresenteerd. Op basis van de ondersteunende niche die door menselijke mesenchymale cellen is gecreëerd, induceert de toevoeging van menselijke endotheelcellen de vorming van menselijke vaten, terwijl de toevoeging van rhBMP-2 de vorming van chimerisch volwassen weefsel van humane muizen veroorzaakt.

Bioengineering van Humanized Botmarg Microenvironments in Mouse en hun visualisatie door Live Imaging

Dit manuscript beschrijft een in vitro zaadknop cultivatiemethode die het mogelijk live-cel beeldvorming van Arabidopsis zygoten en embryo's maakt. Deze methode wordt gebruikt om te visualiseren de intracellulaire dynamiek tijdens de zygote polarisatie en de cel lot specificatie bij de ontwikkeling van de embryo's.

In Vitro Zaadknop teelt voor Live-cel Imaging van Zygote polarisatie en Embryo patronen in Arabidopsis thaliana

Leer ex vivo live beeldvorming met tweefotonenmicroscopie om celdelingen in muizenknaagtanden te volgen. Deze techniek maakt real-time observatie van dynamische celgedragingen tijdens weefselvernieuwing mogelijk.

Ex vivo live beeldvorming gebruiken om celdelingen en bewegingen tijdens tandvernieuwing bij muizen te onderzoeken

Meer video's verkennen