Toepassing van monolaag grafeen op cryo-elektronenmicroscopieroosters voor structuurbepaling met hoge resolutie
10 november 2023
De toepassing van steunlagen op cryogene elektronenmicroscopie (cryoEM)-roosters kan de deeltjesdichtheid verhogen, interacties met de lucht-waterinterface beperken, door bundels geïnduceerde beweging verminderen en de verdeling van deeltjesoriëntaties verbeteren. Dit artikel beschrijft een robuust protocol voor het coaten van cryoEM-roosters met een monolaag grafeen voor een betere voorbereiding van cryomonsters.
Een veel voorkomende uitdaging bij de voorbereiding van cryo-elektronenmicroscopiemonsters is de lokalisatie van deeltjes op het grensvlak tussen lucht en water, waardoor de deeltjes voorkeursoriëntaties aannemen en denatureren. In plaats daarvan is het beter om de deeltjes op het roosteroppervlak te laten rusten, wat dunne film ondersteunt, zoals grafeen bevorderen. Een andere uitdaging is de eis van relatief hoge monsterconcentraties, die ook door grafeen kunnen worden aangepakt.
Met grafeen gecoate roosters bieden tal van voordelen voor de bepaling van de cryoEM-structuur, maar zijn van oudsher moeilijk om in eigen huis reproduceerbaar te fabriceren, evenals de kosten om commercieel aan te schaffen. Dit protocol maakt de robuuste afzetting van monolaags grafeen mogelijk, waardoor de drempel voor gebruikers om deze rasters in hun onderzoek te gebruiken, wordt verlaagd. Grafeen is uniek vanwege zijn materiaaleigenschappen.
Het is een monolaag van koolstof en vertoont daardoor minimale achtergrondruis. Andere cryoEM-rasterondersteuningen, zoals een dunne laag amorfe koolstof- of grafeenoxidevlokken, kunnen niet als een enkele monolaag worden aangebracht en dragen meer achtergrondsignaal bij. Nu we een robuust protocol hebben opgesteld voor de toepassing van grafeen op cryoEM-roosters, willen we de functionalisering van met grafeen gecoate roosters voortzetten met affiniteitshandvatten voor on-grid afvang rechtstreeks uit cellysaten.
Dit zou een ander knelpunt in de voorbereiding van cryoEM-monsters kunnen verlichten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het coaten van cryogene elektronenmicroscopie (cryoEM) rasters met een monolaag van grafeen. Het gebruik van grafeen verhoogt de deeltjesdichtheid, minimaliseert interacties met de lucht-water interface en verbetert de oriëntatieverdeling van deeltjes.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Cryogene elektronenmicroscopie
- Materiaalwetenschap
- Technieken voor monstervoorbereiding
Achtergrond
- Deeltjeslokalisatie aan de lucht-water interface is een veelvoorkomende uitdaging in cryo-EM.
- Voorkeursoriëntaties kunnen leiden tot denaturatie van deeltjes.
- Grafeenondersteuningen kunnen deeltjes helpen rusten op het rasteroppervlak.
- Historisch gezien zijn grafeen-gecoate rasters moeilijk en duur geweest om te fabriceren.
Doel van het onderzoek
- Om een robuust protocol te bieden voor de afzetting van monolaag grafeen op cryoEM rasters.
- Om de belemmeringen voor onderzoekers om grafeen-gecoate rasters te gebruiken te verlagen.
- Om de voordelen van cryo-EM structuurbepaling te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Ontwikkeling van een protocol voor grafeencoating.
- Evaluatie van deeltjesdichtheid en oriëntatie.
- Vergelijking van grafeen-gecoate rasters met traditionele rasters.
- Beoordeling van de reproduceerbaarheid in rasterfabricage.
Belangrijkste resultaten
- Grafeen-gecoate rasters verbeteren de deeltjeslokalisatie aanzienlijk.
- Verhoogde deeltjesdichtheid zorgt voor betere structuurbepaling.
- Robuust protocol vergemakkelijkt in-house fabricage van grafeenrasters.
- Lagere kosten en verbeterde toegankelijkheid voor onderzoekers.
Conclusies
- Het gebruik van grafeen in cryo-EM rasters lost belangrijke uitdagingen op in de monstervoorbereiding.
- Dit protocol maakt bredere adoptie van grafeen-gecoate rasters in onderzoek mogelijk.
- De unieke eigenschappen van grafeen verbeteren de cryo-EM capaciteiten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Sample preparation bottlenecks in cryo-electron microscopy (cryoEM) limit the throughput and reliability of high-resolution structure determination in early discovery and structural biology pipelines. The application of monolayer graphene to cryoEM grids addresses critical challenges of particle localization, orientation bias, and sample concentration requirements, directly impacting predictive confidence in target validation and mechanistic studies. Robust, reproducible graphene grid protocols enable broader enterprise adoption, supporting risk-adjusted portfolio advancement and efficient resource allocation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-fidelity structural interrogation of macromolecular targets at near-atomic resolution.
- Reduces sample denaturation and orientation bias, supporting mechanistic de-risking.
- Facilitates confident target validation by improving particle density and imaging consistency.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized, reproducible grid supports for downstream cryoEM workflows.
- Improves assay reliability by minimizing background noise and enhancing quantitative imaging outputs.
- Supports scalable screening of structurally diverse complexes at lower sample concentrations.
Translational & Preclinical Research
- Enables structural studies of disease-relevant complexes, supporting translational biomarker alignment.
- Provides continuity from discovery-stage structure elucidation to preclinical validation of molecular mechanisms.
- Reduces risk of late-stage biological failure by ensuring structural data quality.
Pipeline & Workflow Integration
Monolayer graphene grid preparation integrates into the cryoEM workflow from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis-driven structure determination and mechanistic insight.
- Discovery Biology: Supports robust null hypothesis testing by enabling accurate structural comparisons across conditions.
- Screening: Delivers reproducible, low-background grids for quantitative imaging and assay standardization.
- Analytics: Provides high-quality diffraction patterns and density maps for statistical analysis and decision-making.
- Translational Research: Maintains structural data continuity for disease-relevant targets and complexes.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reproducible grid preparation capability for diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural studies.
- Operational Value: Standardizes grid preparation, enhances reproducibility, and lowers sample input requirements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by reducing sample preparation bottlenecks.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in graphene handling and cryoEM grid preparation.
- Needs access to spin coaters, glow discharge units, and UV ozone cleaners.
- Demands cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptation may be needed for different macromolecular systems or sample types.
- Practical limitations include handling fragility and ensuring monolayer integrity during transfer.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:35
Preparing MMA‐Coated CVD Graphene for Fabrication of Graphene‐Coated CryoEM Grids
3:27
Preparing Grid‐Sized MMA‐Coated CVD Graphene Squares for Attaching to CryoEM Grids
5:14
Fabricating Graphene‐Coated Cryo‐EM Grids Using Grid‐Sized MMA‐Coated CVD Graphene Squares
