Name: Een acetyl-klikchemietest om histonacetyltransferase 1-acetylering te meten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Leer een acetyl-klikchemietest om HAT1-acetyleringsactiviteit te meten voor high-throughput screening van kleine molecuulinhibitoren. Deze methode biedt een schaalbare tool voor medicijnontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We danken George Zheng voor het beschikbaar stellen van H4K12CoA. We danken de leden van het Gruber Lab voor de nuttige discussies en feedback. We danken de steun van de NIH/NCI (1K08CA245024), CPRIT (RR200090) en de V Foundation (V2022-022).

1. Methode 1: Produceren en zuiveren van recombinant HAT1/Rbap46-complex
<ol><li>HEK293f-cellen ontdooien, herstellen en uitbreiden<ol><li>Ontdooi 1-10 miljoen HEK293f zoogdiercellen26 in 30 ml freestyle 293 expressiemedia in een kolf van 100 ml. Incubeer in 8% CO2 bij 37 °C terwijl je roteert bij 60 tpm.</li>
		<li>Tel en controleer de volgende dag de levensvatbaarheid van de cel en pas vervolgens de rotatiesnelheid aan tot 120 tpm. Breid uit tot een kweek van 300 ml in een kolf van 1 liter, waarbij de zaaidichtheid op 500.000 cellen/ml wordt gehouden en de cellen worden gesplitst voordat de dichtheid hoger is dan 3 x 106 cellen/ml.</li>
	</ol></li>
	<li>HEK293f transfectie<ol><li>Zaad 5 x 105 cellen/ml in een cultuur van 300 ml in een kolf van 1 l en kweek gedurende 24 uur. Tel de volgende dag de cellen om er zeker van te zijn dat ze tussen 7,5 x 105 en 1,2 x 106 cellen/ml zijn.</li>
		<li>Bereid een mengsel van 300 μg pHEK-FLAG-HAT1 en 300 μg pHEK-Rbap46-plasmide-DNA in 30 ml PBS. Voeg 1,2 ml polyethylenimine (PEI) toe aan het DNA/PBS en meng. Incubeer gedurende 20 minuten bij RT. Voeg het DNA/PBS/PEI-mengsel toe aan de 300 ml cultuur en incubeer bij 37 °C gedurende 48 uur bij 120 rpm.</li>
	</ol></li>
	<li>Cellen oogsten<ol><li>Tel de cellen om er zeker van te zijn dat ze tussen 1,7 x 106 en 2,5 x 106 cellen/ml vallen. Voeg bij deze celdichtheid forskoline toe tot een eindconcentratie van 12,5 μM om HAT1 te activeren en de cellen gedurende 30 min, 37 °C, 120 tpm te incuberen.</li>
		<li>Pelleteer de cellen gedurende 5 minuten op 300 x g , was ze eenmaal met 30 ml PBS en vries ze snel in vloeistof N2 in. Bewaren bij -80 °C tot eiwitzuivering of direct overgaan tot zuivering.</li>
	</ol></li>
	<li>HAT1/Rbap46 complex FLAG-parel zuivering<ol><li>Lyseer de cellen en bereid eiwitextract.<ol><li>Bereid lysisbuffer voor door één tablet proteaseremmercocktail (PIC) toe te voegen aan 50 ml RSB-500 (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 500 mM NaCl, 25 mM MgCl2).</li>
			<li>Ontdooi de celpellet van 300 ml kweek op ijs en lyseer met 40 ml ijskoude lysisbuffer met 0,1% Triton X-100. Sonicaat op ijs en draai vervolgens gedurende 10 minuten bij 4°C naar beneden op 10.000 x g . Verzamel al het supernatant in een buisje van 50 ml op ijs, dat nu het eiwitextract is.</li>
		</ol></li>
		<li>Bereid FLAG kralen voor.<ol><li>Splits de FLAG-korrels in vier conische buizen van 15 ml door 400 μl M2-FLAG-agarose-parelslurry toe te voegen aan elk buisje met 5 ml 0,1 M glycine pH 3,5, 0,01% Triton X-100. Schud elke buis krachtig gedurende 5 s met de hand.</li>
			<li>Pulscentrifugeer gedurende 30 s bij 1000 x g bij 4 °C, supernatant opzuigen, tweemaal wassen met 5 ml RSB-500 + 0,1% Triton X-100 (Tx-100; geen proteaseremmer) en incuberen op ijs.</li>
		</ol></li>
		<li>Voer FLAG-immunoprecipitatie uit.<ol><li>Voeg 10 ml eiwitextract toe aan elke conische buis van 15 ml met gewassen kralen. Incubeer de buizen bij 4 °C met omgekeerde rotatie gedurende ten minste 90 minuten of een nacht.</li>
			<li>Was de gebonden kralen 5x in 10 ml RSB-500 + 0,1% Tx-100. Keer voor elke wasbeurt de buis 2x-5x om om de parels te resuspenderen en pellet vervolgens gedurende 1 minuut bij 4 °C op 1000 x g . Tot slot 1x wassen in RSB-100 (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 25 mM MgCl2) + 0,1% Tx-100.</li>
		</ol></li>
		<li>FLAG-peptide-elutie: Elute het HAT1-complex in 1,5 ml Elution Buffer (EB) met 0,5 mg/ml FLAG-peptide. Incubeer bij 4 °C gedurende ten minste 1 uur of een nacht. Pulscentrifugeer de geëlueerde korrels bij 1000 x g gedurende 30 s bij 4 °C en vang het supernatant op, dat het gezuiverde HAT1/Rbap46-complex bevat.</li>
		<li>Concentreer het eiwit en verwijder het FLAG-peptide.<ol><li>Voeg eluaat toe aan een filterbuis van 20 ml en 10.000 Dalton. Breng het volume op 15 ml met EB. Centrifugeer op 2500 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C, herhaal dit twee keer met telkens 15 ml EB.</li>
			<li>Haal het laatste eluaat uit de filterbuis en controleer de eiwitconcentratie met A260. Verwacht een concentratie van 1 mg totaal eiwit in 6 ml EB (per 300 ml startcultuur). Controleer de eiwitzuiverheid met SDS-PAGE, Coomassie en immunoblotting en bewaar aliquots bij -80 °C.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Methode 2: HAT1 acetyl-klik standaardcurve
<ol><li>Standaardcurve voorbereiden<ol><li>Synthetiseer een positief controlepeptide H4 N-terminaal met de sequentie: SCRG[Pra]GGKGLG[Pra]GGAKRHRKVLRGG[Lys(Biotine)], waarbij [Pra] staat voor propargylglycine.</li>
		<li>Resuspendeer het Pra-peptide tot 0,1 mg/ml in DMSO. Meng het Pra-peptide met gebiotinyleerd histon H4-peptide (1-23-GGK-biotine) om een standaardcurve te creëren (Figuur 2; volumes te vinden in Tabel 1). Standaardcurven kunnen vóór het binden van de plaat vers worden gemaakt of, indien van tevoren gemaakt, worden gemengd met 20 μl 8 M ureum en bij -20 °C worden opgeslagen tot stap 3.3.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Methode 3: HAT1-acetylkliktest
<ol><li>Assemblage van acetylatiereacties met testremmers<ol><li>Stel acetyleringsreacties in tweevoud samen in PCR-buisjes van 0,2 ml of PCR-platen met 96 putjes van de volgende componenten: gebiotinyleerd histon H4-peptide (1-23-GGK-biotine) geresuspendeerd in DMSO tot 0,1 mg/ml (34,8 μM), HAT1-enzym voorverdund in EB, 20x buffer (1M Tris pH 8,5, 0,1% NP40), 2 mM DTT, 4-pentynoyl-CoA opgelost in water tot 1 mg/ml (1 mM). Een reactie van 20 μL bestaat uit 10 μL enzym, 1 μL H4-peptide, 1 μL 20x buffer, 1 μL DTT voorgemengd en gealiquoteerd aan putjes van een PCR-plaat met 96 putjes op ijs.</li>
		<li>Voeg per putje 1 μL DMSO (negatieve controle) of teststof opgelost bij 1-10 μM, of H4K12CoA25 (of geschikte positieve controleremmer) toe. Meng door voorzichtig pipetteren en incubeer gedurende 10 minuten op ijs om enzym-inhibitorcomplexen te laten vormen.</li>
	</ol></li>
	<li>Voortzetting van de acetyleringsreactie<ol><li>Combineer 2 μL 4-pentynoyl-CoA met 4 μL water en voeg toe aan de putjes. Voorzichtig mengen door te pipetteren, centrifugeren bij 300 x g gedurende 30 s bij RT om de inhoud op te vangen, en gedurende 1 uur incuberen bij 37 °C in afgedekte buizen of platen met hersluitbare folie.</li>
		<li>Verwerk de inhoud direct voor reactieproducten of blus af met 20 μL 8 M ureum en bewaar bij -20 °C tot verwerking.</li>
	</ol></li>
	<li>Peptidebinding aan neutravidineplaat<ol><li>Voeg reactie-inhoud met of zonder ureum toe aan runderserumalbumine (BSA) voorgeblokkeerde zwarte neutravidine-gecoate platen met 96 putjes die 80 μL PBST (PBS + 0,1% Tween-20) per putje bevatten.</li>
		<li>Voeg standaard curvepeptiden in tweevoud toe aan hun eigen putjes die 80 μL PBST bevatten. Bind peptiden met zacht orbitaal schudden gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT).</li>
	</ol></li>
	<li>Wassen: Nadat het binden is voltooid, zuigt u de vloeistof uit de putjes op en wast u de putjes met 200 μL PBST 3x 15 slagen (180 μL slagvolume) met behulp van een platenwasser.</li>
	<li>Klik op chemie reactie<ol><li>Bereid de reagentia als volgt voor op de klikreactie: 100 mM Tris(3-hydroxypropyltriazolymethyl)amine (THPTA)-ligand in water en 20 mM CuSO4 in water. THPTA voorkomt Cu(II)-gekatalyseerde hydrolyse en dooft radicalen en peroxiden die worden gegenereerd door O2/Cu/ascorbaat.</li>
		<li>Voeg het THPTA/Cu-mengsel toe aan 300 mM natriumascorbaat in water en 2,5 mM biotineazide in DMSO. Reactie met één klik bevat 140 μL PBS, 10 μL THPTA, 10 μL CuSO4, 10 μL natriumascorbaat, 20 μL biotine-azide. Meng de klikreagentia altijd vers, doseer vervolgens 190 μL in elk putje, sluit de plaat af en incubeer gedurende 1 uur bij 37°C.</li>
	</ol></li>
	<li>Wassen: Zuig de vloeistof uit de putjes op en was de plaat 3x met PBST (180 μL slagvolume, 15 slagen voor elke wasbeurt).</li>
	<li>Streptavidine-mierikswortelperoxidasebinding: Verdun streptavidine-HRP (0,224 mg/ml) 1:10 in streptavidine (0,224 mg/ml), verdun vervolgens verder 1:1000 in PBST. Voeg Steptavidin-HRP: streptavidine mix (100 μL per putje) toe en incubeer gedurende 1 uur bij RT met zacht orbitaal schudden.</li>
	<li>Was 3x met PBST zoals in de vorige stappen.</li>
	<li>Amplex rode oxidatie<ol><li>Combineer de Amplex rode detectiereagentia als volgt: 4,45 ml NaHPO4-buffer (1x = 50 mM eindconcentratie), 50 μL amplex rood (20 mM verdund in DMSO), 500 μL verdundH2O2.</li>
		<li>Verdun H2O2 van 30% voorraad naar 3% in 1x NaHPO4 buffer en voeg vervolgens 22,7 μL 3% H2O2 toe aan 977 μL 1x NaHPO4 buffer (dit is de H2O2 die wordt gebruikt voor de amplex reactie). Voeg 100 μL van het amplex rode reactiemengsel per putje toe, incubeer gedurende 30 minuten beschermd tegen licht bij RT en detecteer vervolgens de fluorescentie-excitatie/emissie 571/585 nm met behulp van een standaard fluorescentieplaatlezer.</li>
	</ol></li>
	<li>Berekening van enzymremming: Bereken het percentage remming (figuur 3) volgens de volgende formule: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66054/66054eq01.jpg" style="margin: auto;">, waarbij D de fluorescentiewaarde is van controlereacties die alleen met DMSO zijn behandeld, X de waarde van reacties die met testverbindingen zijn behandeld en BG de waarde van achtergrondputjes (H4-peptidecontrole, geen enzym toegevoegd).</li>
	<li>Dosiscurve: Selecteer testverbindingen waarvan is vastgesteld dat ze de activiteit van het HAT1-enzym remmen voor herhaalde tests, waarbij de verbinding serieel wordt verdund. Bepaal de samengestelde verdunningen empirisch. Begin bijvoorbeeld met een voorraadconcentratie van 2 mM en verdun vervolgens serieel 1:3 voor acht verdunningen. Verdun vervolgens 1:20 tot enzymtesten die een topdosis van 100 μM opleveren.<ol><li>De curve uitzetten: Gebruik de kleinste kwadratenregressie om dosis-respons-remmingscurven in te passen (met behulp van procentuele remmingswaarden uit stap 3.10) in data-analysesoftware (GraphPad Prism) en leid IC50-waarden af voor elke verbinding (Figuur 4).</li>
	</ol></li>
	<li>Acetylatiereactie met acetyl-CoA:<ol><li>Gebruik dit om de enzymactiviteit te bevestigen met de natuurlijke co-factor acetyl-CoA in plaats van 4-pentynoyl-CoA. Voer HAT1-acetyleringstests uit zoals beschreven in de stappen 3.1-3.2 met acetyl-CoA in plaats van 4-pentynoyl-CoA.</li>
		<li>Breng de reactieproducten aan op nitrocellulosemembranen (1-2 μL), laat ze drogen en dep ze vervolgens met anti-H4-lysine-12-acetyl- of anti-H4-lysine-5-acetyl-antilichamen. Kwantificeer het immunoblot-signaal door middel van densitometrie.</li>
	</ol></li>
</ol>

Ontwikkeling van een click-based assay voor het screenen van HAT1 enzymactiviteit

<ol><li>Kleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+gene+encoding+a+yeast+histone+H4+acetyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of a gene encoding a yeast histone H4 acetyltransferase.</a> J Biol Chem. 270 (42), 24674-24677 (1995).</li>
<li>Parthun, M. R., Widom, J., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+cytoplasmic+histone+acetyltransferase+in+yeast%3A+links+to+chromatin+replication+and+histone+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The major cytoplasmic histone acetyltransferase in yeast: links to chromatin replication and histone metabolism.</a> Cell. 87 (1), 85-94 (1996).</li>
<li>Verreault, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosomal+DNA+regulates+the+core-histone-binding+subunit+of+the+human+Hat1+acetyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleosomal DNA regulates the core-histone-binding subunit of the human Hat1 acetyltransferase.</a> Curr Biol. 8 (2), 96-108 (1998).</li>
<li>Parthun, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetyltransferase+1%3A+more+than+just+an+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Histone acetyltransferase 1: more than just an enzyme.</a> Biochim Biophys Acta. 1819 (3-4), 256-263 (2013).</li>
<li>Gruber, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAT1+coordinates+histone+production+and+acetylation+via+H4+promoter+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">HAT1 coordinates histone production and acetylation via H4 promoter binding.</a> Mol Cell. 75 (4), 711-724 e5 (2019).</li>
<li>Fan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpressed+histone+acetyltransferase+1+regulates+cancer+immunity+by+increasing+programmed+death-ligand+1+expression+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Overexpressed histone acetyltransferase 1 regulates cancer immunity by increasing programmed death-ligand 1 expression in pancreatic cancer.</a> J Exp Clin Cancer Res. 38 (1), 47(2019).</li>
<li>Xia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-377+exerts+a+potent+suppressive+role+in+osteosarcoma+through+the+involvement+of+the+histone+acetyltransferase+1-mediated+Wnt+axis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-377 exerts a potent suppressive role in osteosarcoma through the involvement of the histone acetyltransferase 1-mediated Wnt axis.</a> J Cell Physiol. 234 (12), 22787-22798 (2019).</li>
<li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetyltransferase+1+is+a+succinyltransferase+for+histones+and+non-histones+and+promotes+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Histone acetyltransferase 1 is a succinyltransferase for histones and non-histones and promotes tumorigenesis.</a> EMBO Rep. 22 (2), e50967(2021).</li>
<li>Xue, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+screening+identifies+HAT1+as+a+potential+drug+target+in+esophageal+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Clin+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">RNAi screening identifies HAT1 as a potential drug target in esophageal squamous cell carcinoma.</a> Int J Clin Exp Pathol. 7 (7), 3898-3907 (2014).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+of+histones+H3-H4+facilitates+their+allosteric+exchange+between+RbAp48+and+ASF1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity of histones H3-H4 facilitates their allosteric exchange between RbAp48 and ASF1.</a> Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 29-35 (2013).</li>
<li>Campos, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+program+for+processing+newly+synthesized+histones+H3.1+and+H4%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The program for processing newly synthesized histones H3.1 and H4.</a> Nat Struct Mol Biol. 17 (11), 1343-1351 (2010).</li>
<li>Agudelo Garcia, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multiple+roles+for+histone+acetyltransferase+1+in+replication-coupled+chromatin+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of multiple roles for histone acetyltransferase 1 in replication-coupled chromatin assembly.</a> Nucleic Acids Res. 45 (16), 9319-9335 (2017).</li>
<li>Nagarajan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetyl+transferase+1+is+essential+for+mammalian+development%2C+genome+stability%2C+and+the+processing+of+newly+synthesized+histones+H3+and+H4%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Histone acetyl transferase 1 is essential for mammalian development, genome stability, and the processing of newly synthesized histones H3 and H4.</a> PLoS Genet. 9 (6), e1003518(2013).</li>
<li>Annunziato, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembling+chromatin%3A+the+long+and+winding+road%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Assembling chromatin: the long and winding road.</a> Biochim Biophys Acta. 1819 (3-4), 196-210 (2013).</li>
<li>Annunziato, A. T., Seale, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylation+is+required+for+the+maturation+of+newly+replicated+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylation is required for the maturation of newly replicated chromatin.</a> J Biol Chem. 258 (20), 12675-12684 (1983).</li>
<li>Dahlin, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+interference+and+off-target+liabilities+of+reported+histone+acetyltransferase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors.</a> Nat Commun. 8 (1), 1527(2017).</li>
<li>Baell, J. B., Miao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetyltransferase+inhibitors%3A+where+art+thou%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Histone acetyltransferase inhibitors: where art thou.</a> Future Med Chem. 8 (13), 1525-1528 (2016).</li>
<li>Lasko, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+selective+catalytic+p300%2FCBP+inhibitor+that+targets+lineage-specific+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours.</a> Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).</li>
<li>Baell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+histone+acetyltransferases+KAT6A%2FB+induce+senescence+and+arrest+tumour+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth.</a> Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).</li>
<li>Falk, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+high-throughput+screening+method+for+MYST+family+acetyltransferases%2C+a+new+class+of+epigenetic+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">An efficient high-throughput screening method for MYST family acetyltransferases, a new class of epigenetic drug targets.</a> J Biomol Screen. 16 (10), 1196-1205 (2011).</li>
<li>He, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+biology+approaches+for+investigating+the+functions+of+lysine+acetyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Chemical biology approaches for investigating the functions of lysine acetyltransferases.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 57 (5), 1162-1184 (2018).</li>
<li>Lipchik, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peptide-based+biosensor+assay+to+detect+intracellular+Syk+kinase+activation+and+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A peptide-based biosensor assay to detect intracellular Syk kinase activation and inhibition.</a> Biochemistry. 51 (38), 7515-7524 (2012).</li>
<li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoproteomic+profiling+of+protein+substrates+of+a+major+lysine+acetyltransferase+in+the+native+cellular+context%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemoproteomic profiling of protein substrates of a major lysine acetyltransferase in the native cellular context.</a> ACS Chem Biol. 17 (5), 1092-1102 (2022).</li>
<li>Gaddameedi, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetyl-click+screening+platform+identifies+small-molecule+inhibitors+of+histone+acetyltransferase+1+%28HAT1%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Acetyl-click screening platform identifies small-molecule inhibitors of histone acetyltransferase 1 (HAT1).</a> J Med Chem. 66 (8), 5774-5801 (2023).</li>
<li>Ngo, L., Brown, T., Zheng, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisubstrate+inhibitors+to+target+histone+acetyltransferase+1+%28HAT1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Drug+Des%22%5BJournal%5D)">Bisubstrate inhibitors to target histone acetyltransferase 1 (HAT1).</a> Chem Biol Drug Des. 93 (5), 865-873 (2019).</li>
<li>Parker, C. G., Pratt, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+chemistry+in+proteomic+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Click chemistry in proteomic investigations.</a> Cell. 180 (4), 605-632 (2020).</li>
<li>Islam, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bump-and-hole+tactic%3A+Expanding+the+scope+of+chemical+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">The bump-and-hole tactic: Expanding the scope of chemical genetics.</a> Cell Chem Biol. 25 (10), 1171-1184 (2018).</li>
<li>Radziwon, K., Weeks, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+engineering+for+selective+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein engineering for selective proteomics.</a> Curr Opin Chem Biol. 60, 10-19 (2021).</li>
<li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+of+the+year+2007+commercial+optical+biosensor+literature%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Recognit%22%5BJournal%5D)">Survey of the year 2007 commercial optical biosensor literature.</a> J Mol Recognit. 21 (6), 355-400 (2008).</li>
</ol>

We hebben patenten aangevraagd die de HAT1-acetylkliktest beschrijven (PCT/US20/29395). J.J.G. rapporteert adviesovereenkomsten met Sharma Therapeutics, LLC en Guidepoint en onderzoeksondersteuning (aan zijn instelling) van Hummingbird Biosciences.

In het afgelopen decennium werd klikchemie prominent20, waardoor het mogelijk werd om nauwkeurig op elkaar inwerkende chemische structuren te ontwerpen. Binnen deze context zijn verschillende bioorthogonale covalente verbindingen21 naar voren gekomen als veelbelovende opties voor het vormen van complexen in hun natuurlijke omgeving. Klikchemie maakt gebruik van paren van functionele groepen die snelle en selectieve reacties vertonen, algemeen bekend als 'klikreacties'. Deze...

Van de talrijke eukaryote acetyltransferasen was HAT1 de eerste histonacetyltransferase die 1,2,3 werd geïsoleerd. Latere onderzoeken hebben de centrale rol ervan in de replicatie van chromatine stevig vastgesteld, met name bij de synthese van nieuwe nucleosomen tijdens S-fase4. Ons onderzoek leidde tot de erkenning dat HAT1 sterk wordt gestimuleerd door behandeling met epidermale groeifactor (EGF) in borstcellen5. Verder is aan het licht gekomen dat HAT1 nodig is voor snelle celproliferatie en tumorvorming in vivo 6,7,8,9. Gegevens geven aan dat HAT1 van cruciaal belang is bij het coördineren van anabole en epigenetische processen voor celdeling, waardoor tumorgroei wordt gestimuleerd.
HAT1 di-acetyleert de amino-terminale staart van histon H4 op lysines 5 en 12 in complex met het chaperonne-eiwit Rbap46, dat het histon bindt en de amino-terminus presenteert aan HAT1. Histontetrameren of disomes10, samen met HAT1/Rbap46 en andere histonchaperonnes11, worden vervolgens in de kern geïmporteerd. Histonen worden vervolgens vrijgegeven om te worden afgezet op de replicatievork of andere plaatsen om genactivering of -onderdrukking te ondersteunen. De functie van de HAT1-di-acetyleringsmarkering op histon H4 is niet volledig begrepen. Het wordt waarschijnlijk snel verwijderd binnen een tijdsbestek van 15-30 minuten door de werking van histondeacetylasen 12,13,14,15 nadat H4 in chromatine is ingebracht. Het HAT1-di-acetyleringsmerk wordt dus niet gepropageerd in chromatine en speelt mogelijk geen echte epigenetische rol, hoewel een rol bij de rekrutering van chromatine-modificerende enzymen tot ontluikend chromatine is gepostuleerd12. Ook acetyleert HAT1 chromatine niet direct; De activiteit ervan is beperkt tot oplosbare histonen.
De ontwikkeling van histonacetyltransferaseremmers met kleine moleculen wordt belemmerd door niet-specifieke tests met een lage doorvoer, wat vaak resulteert in de generatie van biologisch reactieve verbindingen16,17. De gouden standaardtest om acetyltransferase-activiteiten te meten, vereist het gebruik van 3H-acetyl-coA, wat de doorvoer beperkt en straling vereist. Desalniettemin zijn onlangs specifieke en zeer krachtige acetyltransferaseremmers met kleine moleculen gericht op CBP/p30018 en KAT6A/B19,20 beschreven en bevestigd door het gebruik van 3-H-acetyl-CoA. In de toekomst worden verbeterde tests ontwikkeld om een betere doorvoer te bereiken en laboratoriumrisico's te voorkomen.
Recente ontwikkelingen op het gebied van acetylatiemonitoring21 hebben klikchemie gebruikt om enzymatische reactiemonitoring mogelijk te maken. Er zijn verschillende klik-enabled precursoren die toegankelijk zijn via eenvoudige synthetische routes of beschikbaar zijn voor aankoop die kunnen worden opgenomen in enzymreacties. Deze reacties worden meestal uitgevoerd in recombinante systemen, hoewel celgebaseerde assays ook haalbaar zijn22. Het voordeel van klik-enabled co-factoren en substraten is dat screening de enzymactiviteit direct kan meten zonder dat er gekoppelde uitleessystemen nodig zijn die vaak worden verstoord door screeningsverbindingen en extra verwerkingsstappen vereisen. Dit maakt alleen remmerbehandelingen mogelijk tijdens de enzymatische stap, terwijl alle stroomafwaartse functionaliserings- en detectiestappen worden uitgevoerd na uitgebreid wassen om verbindingen te verwijderen, waardoor de kans op testinterferentie wordt beperkt. Deze voordelen maken het ontwerp van klik-enabled assays te verkiezen boven gekoppelde assays die gewoonlijk afhankelijk zijn van de detectie van vrij co-enzym A.
Een belangrijke overweging is de acceptatie van klik-enabled co-factoren in de enzymactieve plaats. Bestaande co-factoren met klikfunctie zijn mogelijk niet volledig compatibel met de actieve site die is geoptimaliseerd voor de native co-factor. Structurele informatie en modellering kunnen worden gebruikt om aminozuursubstituties te ontwerpen om de actieve plaats te vergroten om gewijzigde substraten op te nemen23. Dit kan screening mogelijk maken met verbeterde enzymkinetiek en lagere substraat- en enzymniveaus. Het nadeel van deze aanpak is dat veranderde katalytische pockets mogelijk geen remmers identificeren die sterk interageren met het oorspronkelijke enzym. Uiteindelijk is een combinatie van benaderingen nodig om potentiële enzymremmers te identificeren en te valideren.
Hier beschrijven we een methode die is ontwikkeld om de activiteit van het HAT1-enzym te zuiveren en te testen met behulp van de klikco-factor 4-pentynoyl-CoA24. Deze test (Figuur 1) maakt gebruik van de oorspronkelijke enzymsequentie in complex met het vereiste partnereiwit Rbap46, waarvan is aangetoond dat het de enzymactiviteit verhoogt. Zuivering van het enzym uit menselijke cellen zorgt voor enzymactivering in cellulo, waardoor stimulerende posttranslationele modificaties die belangrijk zijn voor volledige enzymactiviteit behouden kunnen blijven. Ontwerp en optimalisatie van recombinante enzymtesten voor high-throughput chemische schermen zijn met succes gebruikt om HAT1-remmers van kleine moleculen te identificeren en te karakteriseren.

<table><tbody><tr><td>4P CoA</td><td>Cayman Chemical</td><td>10547</td><td>Click chemistry co-factor</td></tr><tr><td>Amplex Red</td><td>Fisher Sci</td><td>A12222</td><td>Fluorescentie substraat</td></tr><tr><td>Biotin-PEG-Azide</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64996MC</td><td>Click chemistry</td></tr><tr><td>Kopersulfaat</td><td>Sigma-aldrich</td><td>&nbsp;7758-98-7</td><td>Click chemistry</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp;67-68-5</td><td>verdunningsmiddel</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Acros Organics</td><td>03-12-3483</td><td>reducerend middel</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>VWR</td><td>102987-310</td><td>Proteïne expressie</td></tr><tr><td>Freestyle 293 Expression Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>12338018</td><td>Media</td></tr><tr><td>Freestyle 293-F cellen</td><td>Thermo Fisher</td><td>R790-07</td><td>Proteïne expressie</td></tr><tr><td>H4-peptide/1-23-GGK-biotine</td><td>Anaspec</td><td>AS65097</td><td>peptide substraat</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-aldrich</td><td>&nbsp;7365-45-9</td><td>EB-buffer</td></tr><tr><td>Waterstofperoxide 30% oplossing</td><td>Sigma-aldrich</td><td>&nbsp;Z00183-99-0</td><td>initiator</td></tr><tr><td>M2 FLAG antilichaam slurry</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A2220</td><td>Proteïnezuivering</td></tr><tr><td>Macrosep 10K Filter (Pall Lab)</td><td>VWR</td><td>89131-980</td><td>Proteïnezuivering</td></tr><tr><td>Neutravidin Plate</td><td>Thermo Sci</td><td>15127</td><td>BSA-voorgeblokkeerde</td></tr><tr><td>NP40 (IGEPAL)</td><td>MP Biomedical</td><td>198596</td><td>20x-buffer</td></tr><tr><td>pHEK-293 plasmide</td><td>Takara Bio</td><td>3390</td><td>Proteïne expressie</td></tr><tr><td>Fosfaatgebufferde Saline 10x</td><td>Alfa Aesar</td><td>&nbsp;Z00082-33-6</td><td>wasbuffer</td></tr><tr><td>Pra-peptide</td><td>Genscript</td><td>Aangepaste synthese</td><td>gebiotinyleerd</td></tr><tr><td>Natriumascorbaat</td><td>Sigma-aldrich</td><td>&nbsp;134-03-2</td><td>Click chemistry</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma-aldrich</td><td>&nbsp;7647-14-5</td><td>EB-buffer</td></tr><tr><td>Natriumfosfaat</td><td>VWR International</td><td>7558-80-7</td><td>buffer</td></tr><tr><td>Streptavidine</td><td>EMD Millipore</td><td>189730</td><td>concurrent</td></tr><tr><td>Streptavidine-HRP</td><td>Cell Signaling</td><td>3999S</td><td>enzym</td></tr><tr><td>THPTA-ligand</td><td>Fisher Sci</td><td>1010-500</td><td>Click chemistry</td></tr><tr><td>Tris-basis</td><td>Sigma-aldrich</td><td>&nbsp;77-86-1</td><td>20x-buffer</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>VWR International</td><td>&nbsp;9002-93-1</td><td>EB-buffer</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-aldrich</td><td>&nbsp;9005-64-5</td><td>Wasbuffer</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57-13-6</td><td>quencher</td></tr></tbody></table>

een acetyl-klikchemietest om histonacetyltransferase 1-acetylering te meten

An Acetyl-Click Chemistry Assay to Measure Histone Acetyltransferase 1 Acetylation

HAT1, ook bekend als histonacetyltransferase 1, speelt een cruciale rol bij de chromatinesynthese door ontluikend H4 te stabiliseren en te acetyleren vóór de nucleosoomassemblage. Het is nodig voor tumorgroei in verschillende systemen, waardoor het een potentieel doelwit is voor de behandeling van kanker. Om de identificatie van verbindingen die de enzymatische activiteit van HAT1 kunnen remmen te vergemakkelijken, hebben we een acetyl-kliktest ontwikkeld voor snelle screening. In deze eenvoudige test gebruiken we recombinant HAT1/Rbap46, dat wordt gezuiverd uit geactiveerde menselijke cellen. De methode maakt gebruik van het acetyl-CoA-analoog 4-pentynoyl-CoA (4P) in een klik-chemiebenadering. Dit omvat de enzymatische overdracht van een alkynehandvat via een HAT1-afhankelijke acylatiereactie naar een gebiotinyleerd H4 N-terminaal peptide. Het gevangen peptide wordt vervolgens geïmmobiliseerd op neutravidineplaten, gevolgd door functionalisatie van klikchemie met biotine-azide. Vervolgens wordt rekrutering van streptavidine-peroxidase gebruikt om amplexrood te oxideren, wat resulteert in een kwantitatieve fluorescerende output. Door chemische remmers in te brengen tijdens de acylatiereactie, kunnen we enzymatische remming kwantificeren op basis van een reductie van het fluorescentiesignaal. Belangrijk is dat deze reactie schaalbaar is, waardoor potentiële remmers met een hoge doorvoer kunnen worden gescreend op HAT1-enzymatische activiteit.

Standaardcurven in tweevoud (16 putjes) moeten op elke plaat worden opgenomen om een goede testprestatie te garanderen. Standaardcurvegegevens moeten in tabelvorm worden opgesteld, met een bereik van 100% tot 0%, afhankelijk van de verhouding tussen Pra-bevattend peptide en natuurlijk H4-peptide in oplossing (tabel 1). Het rode signaal van Amplex is het hoogst in 100% pra/0% native H4-peptideputten en het laagst in 0% pra/100% native H4-peptideputten. Nadat fluorescentie is gedetecteerd en het gemiddelde...

Snelle en nauwkeurige chemische tests om te screenen op specifieke remmers zijn een belangrijk hulpmiddel in het arsenaal aan geneesmiddelenontwikkeling. Hier presenteren we een schaalbare acetyl-klikchemietest om de remming van HAT1-acetyleringsactiviteit te meten.

Een acetyl-klikchemietest om histonacetyltransferase 1-acetylering te meten

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome ...

Onze ontwikkelde acetyl-click-test dient als een hulpmiddel om de activiteit van HAT1-acetyltransferase te beoordelen, wat essentieel is bij het isoleren van H4-histonen vóór nucleosoomopname. We willen deze methode gebruiken voor high throughput screening van kleine molecuulremmers tegen het HAT1-enzym. Deze methode meet de enzymatische activiteit direct op het peptidesubstraat.Dit biedt voordelen in vergelijking met andere enzymatische testen door biologische variabiliteit en antilichaamgerelateerde kosten te vermijden. Dit is ook een hoge doorvoer en kan worden aangepast voor gebruik met andere acetyltransferasen. We hebben onlangs een HAT1-remmer met een klein molecuul gepubliceerd op basis van deze test die actief is in cellen en dieren.We blijven deze test gebruiken om aanvullende chemische bibliotheken te screenen en structuuractiviteitsrelaties uit te voeren. We ontwikkelen methoden om histonproductie, vouwen, chaperoning en chromatine-integratie te volgen. Dit benadrukt de noodzaak van verbeterde chemische hulpmiddelen om biologische mechanismen te onderzoeken en de ontdekking van geneesmiddelen te stimuleren.Ons doel is om aan te tonen dat het aanpakken van histonproducti

an-acetyl-click-chemistry-assay-to-measure-histone-acetyltransferase

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Door de combinatie van inheemse en verknopen van chromatine immunoprecipitatie met een hoge-resolutie massaspectrometrie, ChroP benadering stelt aan de samengestelde proteomics architectuur van histonmodificaties, varianten en niet-histonic eiwitten synergizing op functioneel verschillende chromatinedomeinen ontleden.

De ChroP aanpak combineert chip en massaspectrometrie te ontleden Locus-specifieke Proteomic Landschappen van Chromatin

Dit protocol beschrijft de vereiste stappen om in vitro en in vivo deacetyleringsassays uit te voeren om de rol van eiwitten als specifieke deacetyleringssubstraten voor sirtuïnen vast te stellen en verder de rol van omkeerbare - lysine acetylering als een post-translationele modificatie te bestuderen.

Deacetylering Testen om de wisselwerking tussen Sirtuins (SIRT2) en specifiek eiwit-substraten Ontrafel

De huidige methode dient ter identificatie van isovorm-specifieke remmers van Histon deacetylases (HDAC) in HeLa cellen door de UHPLC-MS-analyse van meerdere substraten. Dit is een antilichaam-vrije methode ontwikkeld om te reflecteren van HDAC1 en HDAC6 activiteit in de levende cel omgeving, in tegenstelling tot één-isovorm cel-gratis testen.

Gelijktijdige meting van HDAC1 en HDAC6 activiteit in HeLa cellen met behulp van UHPLC-MS

Het doel van dit artikel is om een uitgebreide, systematische handleiding voor de efficiënte reiniging van histones H3 en H4 en de kwantificering van residuen geacetyleerd Histon.

Zuivering van H3 en H4 Histone eiwitten en de kwantificering van geacetyleerd Histone merken in cellen en hersenweefsel

Klasse 1 histone deacetylases (HDACs), zoals RpdA hebben opgedaan belang als potentiële doelstellingen voor de behandeling van schimmelinfecties. Hier presenteren we een protocol voor de specifieke verrijking van TAP-Tagged RpdA gecombineerd met een HDAC activiteit assay die het mogelijk maakt in vitro effectiviteit testen van histone deacetylase remmers.

Enkele stap verrijking van een TAP-Tagged histone deacetylase van de gloeiende schimmel Aspergillus nidulans voor enzymatische activiteit assay

Hier wordt een gevoelige fluorescentietest gepresenteerd om de Apolipoproteïne N-acyltransferase-activiteit te volgen met behulp van diacylglycerylpeptide en alkynfolipiden als substraten met klikchemie.

Op klikchemie gebaseerde fluorometrische test voor Apolipoproteïne N-acyltransferase van enzymkarakterisering naar screening met hoge doorvoer

Remmers van histonacetyltransferases (HAT's, ook bekend als lysine acetyltransferasen), zoals CBP/p300, zijn potentiële therapieën voor de behandeling van kanker. Er zijn echter rigoureuze methoden nodig om deze remmers te valideren. Drie in vitro methoden voor validatie omvatten HAT-tests met recombinant acetyltransferases, immunoblotting voor histonacetylatie in de celcultuur en ChIP-qPCR.

Assays voor het valideren van Histon Acetyltransferase Inhibitors

De studie van vetacylatatie heeft belangrijke implicaties in cellulaire eiwitinteracties en ziekten. Hier wordt een aangepast protocol gepresenteerd om de detectie van vet-geacyleerde eiwitten te verbeteren, die kunnen worden toegepast in verschillende celtypen en gecombineerd met andere testen, waaronder pulsachtervolging en massaspectrometrie.

Geoptimaliseerde integratie van alkynylvetzuuranalogen voor de detectie van vetacyleiwitten met behulp van Click Chemistry

Dit manuscript beschrijft een methode om te visualiseren en te kwantificeren van gelokaliseerde vertaling gebeurtenissen in subcellular compartimenten. De in dit manuscript voorgestelde benadering is vereist van een basissysteem voor confocal beeldvorming en reagentia en snelle en kostenefficiënte.

Kwantitatieve immunofluorescentie te meten Global gelokaliseerd vertaling

Dit manuscript beschrijft methodes voor het toepassen van peptide microarray technologie op specificiteit profilering van antilichamen die histonen herkennen en hun post-translationele modificaties.

Analyse van Histone Antilichaam Specificiteit Met Peptide Microarrays

Leer een acetyl-klikchemietest om HAT1-acetyleringsactiviteit te meten voor high-throughput screening van kleine molecuulinhibitoren. Deze methode biedt een schaalbare tool voor medicijnontwikkeling.

Een acetyl-klikchemietest om histonacetyltransferase 1-acetylering te meten

Meer video's verkennen