Name: Genereren van een RIP1 knockout U937 cellijn met behulp van het CRISPR-Cas9 systeem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Leer hoe je met CRISPR-Cas9 een RIPK1 knockout U937-cellijn genereert voor genetisch onderzoek. Deze methode toont de effectiviteit van genbewerking en belicht experimentele uitdagingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Gostimskaya, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%E2%80%93Cas9%3A+A+History+of+its+discovery+and+ethical+considerations+of+its+use+in+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+%28Mosc.%29%22%5BJournal%5D)">CRISPR–Cas9: A History of its discovery and ethical considerations of its use in genome editing.</a> Biochem (Mosc.). 87 (8), 777-788 (2022).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual+RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Redman, M., King, A., Watson, C., King, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Dis+Child+Educ+Pract+Ed%22%5BJournal%5D)">What is CRISPR/Cas9.</a> Arch Dis Child Educ Pract Ed. 101 (4), 213-215 (2016).</li>
<li>Ebrahimi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+evaluation+of+CRISPR+PX-LmGP63+vector+effect+on+pathogenicity+of+Leishmania+major+as+a+primary+step+to+control+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">In vitro evaluation of CRISPR PX-LmGP63 vector effect on pathogenicity of Leishmania major as a primary step to control leishmaniasis.</a> Microb Pathog. 161 (Pt A), 105281(2021).</li>
<li>Ebrahimi, S., Alipour, H., Azizi, K., Kalantari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+px-lmgp63+using+crispr-cas9+as+primary+goal+for+gp63+gene+knockout+in+Leishmania+major+and+leishmanization%5BTitle%5D)+AND+%22Jundishapur+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction of px-lmgp63 using crispr-cas9 as primary goal for gp63 gene knockout in Leishmania major and leishmanization.</a> Jundishapur J Microbiol. 14 (1), 112965(2021).</li>
<li>Lim, J. M., Kim, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+principles+and+clinical+applications+of+CRISPR-based+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Yonsei+Med+J%22%5BJournal%5D)">Basic principles and clinical applications of CRISPR-based genome editing.</a> Yonsei Med J. 63 (2), 105-113 (2022).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+delivery+to+hard-to-transfect+cells+via+membrane+deformation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 delivery to hard-to-transfect cells via membrane deformation.</a> Sci Adv. 1 (7), 1500454(2015).</li>
<li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+for+the+study+of+hematopoietic+cells+in+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Lentiviral CRISPR/Cas9-mediated genome editing for the study of hematopoietic cells in disease models.</a> J Vis Exp. (152), e59977(2019).</li>
<li>Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line+as+a+platform+to+produce+recombinant+proteins+and+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 796991(2021).</li>
<li>Mccaig, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Dis. , 1-14 (2018).</li>
<li>Deragon, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ROS+prime+the+hyperglycemic+shift+from+apoptosis+to+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ROS prime the hyperglycemic shift from apoptosis to necroptosis.</a> Cell Death Dis. 6 (1), (2020).</li>
<li>Deragon, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+trafficking+of+MLKL%2C+Bak%2FBax%2C+and+Drp1+Is+mediated+by+RIP1+and+ROS+which+leads+to+decreased+mitochondrial+membrane+integrity+during+the+hyperglycemic+shift+to+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial trafficking of MLKL, Bak/Bax, and Drp1 Is mediated by RIP1 and ROS which leads to decreased mitochondrial membrane integrity during the hyperglycemic shift to necroptosis.</a> Int J Mol Sci. 24 (10), 8609(2023).</li>
<li>LaRocca, T. J., Sosunov, S. A., Shakerley, N. L., Ten, V. S., Ratner, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemic+conditions+prime+cells+for+RIP1-dependent+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemic conditions prime cells for RIP1-dependent necroptosis.</a> J Biol Chem. 291 (26), 13753-13761 (2016).</li>
<li>Pasparakis, M., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+and+its+role+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Necroptosis and its role in inflammation.</a> Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cytosolic+ATM%2FNEMO%2FRIP1+complex+recruits+TAK1+To+mediate+the+NF-%CE%BAB+and+p38+Mitogen-Activated+Protein+Kinase+%28MAPK%29%2FMAPK-activated+protein+2+responses+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A Cytosolic ATM/NEMO/RIP1 complex recruits TAK1 To mediate the NF-κB and p38 Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK)/MAPK-activated protein 2 responses to DNA damage.</a> Mol Cell Biol. 31 (14), 2774-2786 (2011).</li>
<li>Eng, V. V., Wemyss, M. A., Pearson, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diverse+roles+of+RIP+kinases+in+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The diverse roles of RIP kinases in host-pathogen interactions.</a> Semin Cell Dev Biol. 109, 125-143 (2021).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIPK1+in+the+inflammatory+response+and+sepsis%3A+Recent+advances%2C+drug+discovery+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">RIPK1 in the inflammatory response and sepsis: Recent advances, drug discovery and beyond.</a> Front Immunol. 14, 1114103(2023).</li>
<li>Kowolik, C. M., Yee, J. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+transduction+of+human+hepatocytes+with+lentiviral+vectors+pseudotyped+by+Sendai+virus+F+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Preferential transduction of human hepatocytes with lentiviral vectors pseudotyped by Sendai virus F protein.</a> Mol Ther. 5 (6), 762-769 (2002).</li>
<li>Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+types%2C+methods+and+strategies%3A+A+technical+review%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Transfection types, methods and strategies: A technical review.</a> PeerJ. 9, 11165(2021).</li>
<li>Keller, A. A., Maeß, M. B., Schnoor, M., Scheiding, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfecting+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Transfecting Macrophages.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 1784, 187-195 (2018).</li>
<li>Chanput, W., Peters, V., Wichers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((THP-1+and+U937+cells.+The+impact+of+food+bioactives+on+health%3A+In+vitro+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22models%22%5BJournal%5D)">THP-1 and U937 cells. The impact of food bioactives on health: In vitro and ex vivo.</a> models. 159 (147), (2015).</li>
<li>Kutner, R. H., Zhang, X. Y., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+concentration+and+titration+of+pseudotyped+HIV-1-based+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 4 (4), 495-505 (2009).</li>
<li>Ricks, D. M., Kutner, R., Zhang, X. Y., Welsh, D. A., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+lentiviral+transduction+of+mouse+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells Dev. 17 (3), 441-450 (2008).</li>
<li>Swainson, L., Mongellaz, C., Adjali, O., Vicente, R., Taylor, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+transduction+of+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Lentiviral transduction of immune cells.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 415, 301-320 (2008).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Adjusted DMEM Medium</td><td>Gibco</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A1593</td><td></td></tr><tr><td>bisBenzimide Hoechst 33342 trihydrochloride</td><td>Sigma</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Complete RPMI-1640 Medium</td><td>Sigma</td><td>R6504</td><td></td></tr><tr><td>CRISPR NTC gRNA E.coli Strain</td><td>transOMIC</td><td>TELA1011</td><td></td></tr><tr><td>CRISPR RIP1 gRNA E.coli Strain</td><td>transOMIC</td><td>TEVH-1162203</td><td></td></tr><tr><td>End-over-end Rotator</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL Fluorescence Microscope</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GenElute Plasmid Maxiprep Kit</td><td>Sigma</td><td>PLX15</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit IgG Antibody, (H+L) HRP conjugate</td><td>Sigma</td><td>AP307P</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T Cells</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator Shaker</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>BD</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>BD</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>LV-MAX Lentiviral Packaging Mix</td><td>Gibco</td><td>A43237</td><td></td></tr><tr><td>MitoSOX Red</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-D1055</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Necrostatin-1</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-14622A</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma</td><td>P7255</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-human RIP1 mAb</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3493</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE and western blot equipment</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alpha;</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-P7058</td><td></td></tr><tr><td>U937 Human Monocytes</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WST-1 Cell Proliferation Assay System</td><td>TaKaRa</td><td>MK400</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent</td><td>Roche Diagnostics</td><td>6365779001</td><td></td></tr><tr><td>z-VAD-FMK</td><td>APExBIO</td><td>A1902</td><td></td></tr></tbody></table>

genereren van een rip1 knockout u937 cellijn met behulp van het crispr-cas9 systeem

Generation of a RIP1 Knockout U937 Cell Line Using the CRISPR-Cas9 System

Genereren van een RIP1 knockout U937 cellijn met behulp van het CRISPR-Cas9 systeem

This protocol outlines a procedure for knocking out the RIP1 gene using CRISPR/Cas9 in the human monocyte U937 cell line. The method utilizes designated ...

generation-rip1-knockout-u937-cell-line-using-crispr-cas9

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the procedure for generating recombinant viral particles by transfecting embryonic kidney cells with plasmids encoding viral proteins and a gene of interest.

Generation of Recombinant Viral Particles Using Embryonic Kidney Cells

CRISPR/Cas9 is een robuust systeem om genen en genetische elementen te onderbreken. Hier beschrijven we een protocol voor het efficiënt creëren van genomische deleties in zoogdiercellijnen met behulp van CRISPR/Cas9.

Generatie van Genomic Deleties in zoogdiercellijnen via CRISPR / Cas9

Genoombewerkingstools zoals het CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) systeem hebben de efficiëntie van gentargeting in humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) aanzienlijk verbeterd. Dit manuscript beschrijft een protocol voor het genereren van een lijnspecifiek hiPSC-reporter met behulp van CRISPR/Cas systeem-ondersteunde homologe recombinatie.

Efficiënte generatie van iPSC Neural Lineage Specifieke Knockin Reporters Met de CRISPR / Cas9 en Cas9 Double Nickase System

Recente vooruitgang in het vermogen om somatische cellijnen genetisch te manipuleren, biedt een groot potentieel voor basis en toegepast onderzoek. Hier presenteren wij twee benaderingen voor CRISPR / Cas9 gegenereerde knockout productie en screening in zoogdiercellijnen, met en zonder het gebruik van selecteerbare markers.

Selectieafhankelijke en onafhankelijke generatie van CRISPR / Cas9-gemedieerde Gene Knockouts in zoogdiercellen

Een protocol voor snelle CRISPR/Cas9-gemedieerde gene verstoring van muis en mens primaire hematopoietische cellen wordt beschreven in dit artikel. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins worden ingevoerd via electroporation met sgRNAs gegenereerd via in vitro transcriptie en commerciële Cas9. Hoge bewerken rendementen worden bereikt met beperkte tijd en de financiële kosten.

Hoogefficiënte Gene verstoring van lymfkliertest en menselijke hematopoïetische voorlopercellen door CRISPR/Cas9

Hier presenteren we een protocol om genetisch wijzigen van primaire of uitgebreide menselijke natural killer (NK) cellen met behulp van Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). Met behulp van dit protocol, we genereerden menselijke NK cellen tekort voor Transformeren groeifactor-b receptor 2 (TGFBR2) en hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

Generatie van Knock-out primaire en uitgebreide menselijke NK-cellen met behulp van Cas9 Ribonucleoproteins

Dit protocol biedt een methode om het genereren van gedefinieerde heterozygoot of homozygoot nucleotide veranderingen te vergemakkelijken met behulp van CRISPR CAS9 in menselijke pluripotente stamcellen.

Generatie van gedefinieerde genomische modificaties met CRISPR CAS9 in menselijke pluripotente stamcellen

In dit protocol beschrijven we de technische procedures om bruin vetweefsel (BAT)-specifieke knock-out muizen te genereren met behulp van een gecombineerd Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 en adeno-geassocieerd virus (AAV) single-guide RNA (sgRNA) systeem. De beschreven stappen omvatten het ontwerp van de sgRNA's, de bereiding van de AAV-sgRNA-deeltjes en de micro-injectie van AAV in de BBT-lobben.

Generatie van bruine vet-specifieke knock-out muizen met behulp van een gecombineerd Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 en Adeno-geassocieerd virus single-guide RNA-systeem

Dit artikel rapporteert de constructie van centromeer-geassocieerde proteïne-E (CENP-E) knock-outcellen met behulp van het CRISPR/Cas9-systeem en drie op fenotype gebaseerde screeningstrategieën. We hebben de CENP-E knock-out cellijn gebruikt om een nieuwe benadering vast te stellen om de specificiteit en toxiciteit van de CENP-E-remmers te valideren, wat nuttig is voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en biologisch onderzoek.

Generatie van Centromeer-geassocieerde proteïne-E CENP-E-/- knock-outcellijnen met behulp van het CRISPR/Cas9-systeem

De THP-1-cellijn wordt veel gebruikt als model om de functies van menselijke monocyten/macrofagen in verschillende biologiegerelateerde onderzoeksgebieden te onderzoeken. Dit artikel beschrijft een protocol voor efficiënte CRISPR-Cas9-gebaseerde engineering en isolatie van single-cell kloons, waardoor de productie van robuuste en reproduceerbare fenotypische gegevens mogelijk wordt.

Op elektroporatie gebaseerde CRISPR-Cas9-gemedieerde genknock-out in THP-1-cellen en isolatie van eencellige klonen

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van maternale mutant dat een stabiele zpc:cas9 knock-in-lijn koppelt aan Tol2-gemedieerde afgifte van sgRNA-expressiecassettes.

Generatie van maternale mutanten met behulp van zpc:cas9 knock-in zebravissen

Leer hoe je met CRISPR-Cas9 een RIPK1 knockout U937-cellijn genereert voor genetisch onderzoek. Deze methode toont de effectiviteit van genbewerking en belicht experimentele uitdagingen.

Genereren van een RIP1 knockout U937 cellijn met behulp van het CRISPR-Cas9 systeem

Meer video's verkennen