Name: Directe observatie en geautomatiseerde meting van stomatale responsen op Pseudomonas syringae pv. tomaat DC3000 in Arabidopsis thaliana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-09T13:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Ontdek een geautomatiseerde methode voor het meten van stomatale openingen in Arabidopsis thaliana met behulp van een draagbaar beeldvormingsapparaat en deep learning. Deze techniek vermindert de meettijd met 95% en vergemakkelijkt onderzoek naar plantenstress.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken alle leden van het onderzoeksproject, 'Co-creatie van plant adaptieve eigenschappen via assemblage van plant-microbe holobiont', voor vruchtbare discussies. Dit werk werd ondersteund door Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (21H05151 en 21H05149 aan AM en 21H05152 aan Y.T.) en Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (22K19178 aan A. M.).

1. Planten kweken
<ol><li>Om de kiemrust te doorbreken, resuspendeert u de zaden van A. thaliana (Col-0) in gedeïoniseerd water en broedt u ze gedurende 4 dagen in het donker uit bij 4 °C.</li>
	<li>Zaai de zaden op de grond en kweek in een kamer die is uitgerust met wit fluorescerend licht. Houd de volgende groeiomstandigheden aan: temperatuur van 22 °C, lichtintensiteit van 6.000 lux (ca. 100 μmol/m2/s) gedurende 10 uur en relatieve vochtigheid van 60%.</li>
	<li>Geef de planten indien nodig water met een vloeibare meststof. Geef geen water van 1 week tot 2 dagen voorafgaand aan de inoculatie en geef 1 dag voor de inoculatie goed water.</li>
</ol>2. Bereiding van bacterieel entmateriaal
<ol><li>Streep Pto uit de glycerolvoorraad op gestold King's B (KB) medium (20 g trypton, 1,5 g K2HPO4 en 15 g glycerol voor 1 l, 1,5% agar) met 50 μg/ml rifampicine en incubeer gedurende 2 dagen bij 28 °C.</li>
	<li>Inoculeer een enkele kolonie met 5 ml KB vloeibaar medium met 50 μg/ml rifampicine en incubeer bij 28 °C met schudden bij 200 tpm tot de late logaritmische groeifase.</li>
	<li>Centrifugeer de cultuur gedurende 2 minuten op 6.000 x g , gooi het supernatant weg en resuspendeer de pellet in 1 ml steriel water. Herhaal deze stap nog een keer.</li>
	<li>Verwijder het supernatant, resuspendeer de pellet in 1 ml huidmondjesopeningsbuffer (25 mM MES-KOH pH 6,15, 10 mM KCl) en meet de OD600.</li>
	<li>Verdun de suspensie tot OD600 0,2 met een huidmondjesopening die 0,04% siliconen oppervlakteactieve stof bevat.</li>
</ol>3. Spray-inoculatie van bacteriën
<ol><li>Stel planten vanaf 1 dag voor inoculatie tot het einde van het experiment bloot aan een lichtintensiteit van ongeveer 10.000 lux (ca. 170 μmol/m2/s).</li>
	<li>Om ervoor te zorgen dat de meeste huidmondjes open zijn, bewaart u de planten op een bak bedekt met een transparant deksel onder het licht gedurende ten minste 3 uur voordat u ze spuit.</li>
	<li>Verwijder het deksel en gebruik een airbrush om de abaxiale zijde van bladeren te besproeien met 2,5 ml bacteriële suspensie per drie planten op een enkele pot.</li>
	<li>Incubeer de geënte planten op een tray bedekt met een transparant deksel om een relatieve luchtvochtigheid van ongeveer 85% te behouden.</li>
	<li>Maak beelden van huidmondjes 1 uur en 3 uur na het inoculeren met de spray volgens de methode beschreven in rubriek 4.</li>
</ol>4. Directe observatie van huidmondjes met behulp van het draagbare beeldvormingsapparaat
NOTITIE: Het draagbare stomatale beeldvormingsapparaat is uitgerust met een LED-lampje en een cameramodule en kan 2.592 × 1.944 (hoogte × breedte; pixels) beelden maken met een resolutie van ongeveer 0,5 μm/pixel.
<ol><li>Sluit het draagbare stomatale beeldvormingsapparaat aan op een pc (pc) die is uitgerust met beeldacquisitiesoftware.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig maar volledig waterdruppels van de geënte bladeren met een stuk papier.</li>
	<li>Open de bovenklep van het apparaat, plaats de vleugel op de tafel en sluit de bovenklep (Figuur 1).</li>
	<li>Pas de focus van de afbeelding aan door de stelschroef te manipuleren en klik vervolgens op de Afbeelding opslaan knop op het pc-scherm. Het beeld wordt onmiddellijk verkregen. Doorgaans bevat een scherp beeld ongeveer 10 analyseerbare huidmondjes. Om robuuste resultaten te verkrijgen, maakt u huidmondjes van zes bladeren van drie verschillende planten (twee bladeren per plant).</li>
</ol>5. Handmatige meting van de stomatale opening
OPMERKING: De ImageJ-software kan worden gedownload op https://imagej.nih.gov/ij/download.html
<ol><li>Open een afbeeldingsbestand in de ImageJ.</li>
	<li>Open de ROI-manager door Analyze > Tools > ROI Manager te selecteren.</li>
	<li>Gebruik het selectiegereedschap Rechte lijn om een lijn te tekenen die overeenkomt met de breedte van een stoma (Figuur 2) en registreer de ROI door op Toevoegen te klikken in de ROI Manager.</li>
	<li>Trek een lijn die overeenkomt met de lengte van dezelfde stoma (figuur 2A) en registreer de ROI zoals beschreven in stap 5.3.</li>
	<li>Klik op Meten in de ROI Manager om de breedte en lengte te meten.</li>
	<li>Deel de breedte door de lengte om de huidmondjesopening (verhouding) te verkrijgen. Gebruik voor een robuuste kwantificering 60 of meer huidmondjes voor elke behandeling en elk tijdstip. Kies geen premature of onduidelijke huidmondjes voor de analyse (Figuur 2B, C).</li>
</ol>6. Geautomatiseerde meting van de stomatale opening
OPMERKING: De pijplijn voor beeldanalyse wordt uitgevoerd in Google Colaboratory, een uitvoerbare omgeving in de cloud-programmeertaal Python. Gebruikers moeten een geldig Google-account hebben met een werkende Google Drive, Google Chrome-browser en een stabiele internetverbinding als vereiste.
<ol><li>Download het Google Colaboratory-notitieblok van Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) en open het notitieblok.</li>
	<li>Maak een lokale kopie van het notitieblok naar Google Drive door Bestand te selecteren > Een kopie opslaan in Drive te selecteren. Nadat er een nieuw tabblad is verschenen, sluit u het tabblad van het oorspronkelijke notitieboek veilig.</li>
	<li>Druk eenmaal op de knop Uitvoeren onder de sectie Omgevingsinstellingen in het notitieblok zonder de celblokken uit te vouwen om de vereiste bibliotheken te importeren.</li>
	<li>Voer het gedeelte Directory-instellingen uit om drie mappen te maken die worden gebruikt voor analyse (bijvoorbeeld example_result, inference_results en model) in Google Drive. OPMERKING: In dit geval worden de mappen met de naam example_result, inference_results en model gebruikt als de bovenliggende map, waarin respectievelijk deductieresultaten en getrainde modellen worden opgeslagen. Dit notitieblok toont een voorbeeld van het maken van mappen als een representatieve procedure. Als u de naam wilt wijzigen, herschrijft u het pad pardir, infdir of modeldir .</li>
	<li>Verplaats volgens de sectie Voorbereiding van de afbeeldingen de verkregen afbeeldingen naar example_result, gegroepeerd in afbeeldingstitels per behandeling of steekproef (bijv. mock_1h_XXXXXX.jpg) voor het genereren van de uiteindelijke grafiek. Voorbeeldfoto's zijn verkrijgbaar bij Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528).</li>
	<li>Voer het gedeelte Getrainde modellen downloaden uit om de ONNX-bestanden van de getrainde modellen van Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) te downloaden en onder de modelmap te plaatsen.</li>
	<li>Voer het gedeelte Inferentie en meting van stomatale opening uit om de stomatale opening te kwantificeren op basis van afzonderlijke afbeeldingen. De resulterende afbeeldingen met overlappende deductie en het csv-bestand met de naam example_result.csv worden geëxporteerd naar de map inference_results.</li>
	<li>Voer de sectie Grafiekgeneratie uit om een grafiek te maken over de stomatale diafragmaverhouding, geëxporteerd naar de map inference_results .</li>
</ol>

Geautomatiseerde meting van de stomatale respons op bacteriële invasie bij Arabidopsis

<ol><li>Shimono, M., Higaki, T., Kaku, H., Shibuya, N., Hasezawa, S., Day, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evaluation+of+stomatal+cytoskeletal+patterns+during+the+activation+of+immune+signaling+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative evaluation of stomatal cytoskeletal patterns during the activation of immune signaling in Arabidopsis thaliana.</a> PLoS One. 11, e0159291(2016).</li>
<li>Bourdais, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+quantitative+imaging+to+investigate+regulators+of+membrane+trafficking+in+Arabidopsis+stomatal+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The use of quantitative imaging to investigate regulators of membrane trafficking in Arabidopsis stomatal closure.</a> Traffic. 20 (2), 168-180 (2019).</li>
<li>Higaki, T., Kutsuna, N., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CARTA-based+semi-automatic+detection+of+stomatal+regions+on+an+Arabidopsis+cotyledon+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Morphology%22%5BJournal%5D)">CARTA-based semi-automatic detection of stomatal regions on an Arabidopsis cotyledon surface.</a> Plant Morphology. 26 (1), 9-12 (2014).</li>
<li>Eisele, J. F., Fäßler, F., Bürgel, F., Chaban, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+simple+method+for+microscopy-based+stomata+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A rapid and simple method for microscopy-based stomata analyses.</a> PLoS One. 11, e0164576(2016).</li>
<li>Chitraker, R., Melotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+stomatal+response+to+live+bacterial+cells+using+whole+leaf+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Assessing stomatal response to live bacterial cells using whole leaf imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. 44, 2185(2010).</li>
<li>Sai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((StomaAI%3A+an+efficient+and+user-friendly+tool+for+measurement+of+stomatal+pores+and+density+using+deep+computer+vision%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">StomaAI: an efficient and user-friendly tool for measurement of stomatal pores and density using deep computer vision.</a> New Phytologist. 238 (2), 904-915 (2023).</li>
<li>Takagi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+quantification+of+Arabidopsis+thaliana+stomatal+aperture+from+leaf+images%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Image-based quantification of Arabidopsis thaliana stomatal aperture from leaf images.</a> Plant and Cell Physiology. pcad018, (2023).</li>
<li>Melotto, M., Zhang, L., Oblessuc, P. R., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+defense+a+decade+later%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Stomatal defense a decade later.</a> Plant Physiology. 174 (2), 561-571 (2017).</li>
<li>Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+stomata+function+in+innate+immunity+against+bacterial+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion.</a> Cell. 126 (5), 969-980 (2006).</li>
<li>Zeng, W., He, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prominent+role+of+the+flagellin+receptor+FLAGELLIN-SENSING2+in+mediating+stomatal+response+to+Pseudomonas+syringae+pv+tomato+DC3000+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">A prominent role of the flagellin receptor FLAGELLIN-SENSING2 in mediating stomatal response to Pseudomonas syringae pv tomato DC3000 in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 153 (3), 1188-1198 (2010).</li>
<li>Zheng, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronatine+promotes+Pseudomonas+syringae+virulence+in+plants+by+activating+a+signaling+cascade+that+inhibits+salicylic+acid+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation.</a> Cell Host and Microbe. 11 (6), 587-596 (2012).</li>
<li>Raffeiner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xanthomonas+type-III+effector+XopS+stabilizes+CaWRKY40a+to+regulate+defense+responses+and+stomatal+immunity+in+pepper+%28Capsicum+annuum%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The Xanthomonas type-III effector XopS stabilizes CaWRKY40a to regulate defense responses and stomatal immunity in pepper (Capsicum annuum).</a> The Plant Cell. 34 (5), 1684-1708 (2022).</li>
<li>Munemasa, S., Hauser, F., Park, J., Waadt, R., Brandt, B., Schroeder, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+abscisic+acid-mediated+control+of+stomatal+aperture%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of abscisic acid-mediated control of stomatal aperture.</a> Current Opinion in Plant Biology. 28, 154-162 (2015).</li>
<li>Förster, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wounding-induced+stomatal+closure+requires+jasmonate-mediated+activation+of+GORK+K%2B+channels+by+a+Ca2%2B+sensor-kinase+CBL1-CIPK5+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Wounding-induced stomatal closure requires jasmonate-mediated activation of GORK K+ channels by a Ca2+ sensor-kinase CBL1-CIPK5 complex.</a> Developmental Cell. 48 (1), 87-99 (2018).</li>
<li>Cheng, Y. T., Zhang, L., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-microbe+interactions+facing+environmental+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Plant-microbe interactions facing environmental challenge.</a> Cell Host and Microbe. 26 (2), 183-192 (2019).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Eerdere studies gebruikten epidermale schillen, bladschijven of losse bladeren om stomatale reacties op bacteriële invasies te onderzoeken 9,11,12. De methode die in deze studie wordt voorgesteld, maakt daarentegen gebruik van het draagbare stomatale beeldvormingsapparaat om huidmondjes direct te observeren op een blad dat aan de plant is bevestigd na spray-inoculatie van Pto, waardoor natuurlijke omstandigheden van bacteriële invasie worden nagebootst. Omdat deze methode geen destructieve monstervoorbereidingsprocessen met zich meebrengt, zoals het loslaten van bladeren, excisie van de bladschijf en epidermale peeling, kunnen wonden en waterverlies in verband met deze monstervoorbereidingsprocessen worden vermeden. Deze effecten moeten niet lichtvaardig worden opgevat, omdat verwonding en waterverlies onvermijdelijk plantaardige signalen produceren, zoals de fytohormonen jasmonaat en abscisinezuur die de huidmondbewegingen beïnvloeden 13,14.
Er zijn verschillende richtlijnen voor het optimale gebruik van het draagbare stomatale beeldvormingsapparaat. Ten eerste is het grondig verwijderen van waterdruppels van bladoppervlakken van het grootste belang voor het verkrijgen van beelden met optimale helderheid en focus. Ten tweede wordt aanbevolen om meerdere foto's te maken van identieke bladgebieden door de stelschroef te manipuleren om de scherpstelling te verfijnen. Verwacht wordt dat deze praktijk het aantal analyseerbare huidmondjes per bladoppervlak zal verhogen, waardoor mogelijke bemonsteringsfouten worden verminderd. Ten slotte moet u bij het knijpen van een blad met het apparaat voorzichtig omgaan om schade aan het blad te voorkomen. Dit is van cruciaal belang omdat verwonding een van de signalen is die huidmondjessluiting uitlokken14.
De huidmondopening was meestal variabeler in de geautomatiseerde meting dan in de handmatige meting (figuur 3). Daar zijn verschillende mogelijke redenen voor. Eerder werd gemeld dat stomatale poriën die worden afgeleid uit de beeldanalysepijplijn vaak celwanden en/of schaduwen van wachtcellen rond de stomatale porie7 bevatten, wat niet het geval is bij handmatige meting door menselijke ogen. Huidmondjes met ongebruikelijke vormen kunnen ook van invloed zijn op de variatie tussen handmatige en geautomatiseerde metingen, hoewel het huidmondjesdetectiemodel is getraind om dergelijke huidmondjes uit te sluiten van de analyse7. Een paar huidmondjes kregen nulwaarden voor de stomatale opening in de geautomatiseerde meting, maar geen enkele in de handmatige meting om onbekende redenen. Toekomstige updates van de modellen kunnen nodig zijn om deze problemen aan te pakken. Niettemin, aangezien de geautomatiseerde meting van de stomatale opening in wezen overeenkwam met de handmatige meting, is de huidige versie van de beeldanalysepijplijn van praktisch nut.
De directe observatie en geautomatiseerde meting van de huidmondjesopening in A. thaliana die in deze studie wordt beschreven, is veelbelovend voor verschillende toepassingen om de rol van huidmondjes in de aanpassing aan het milieu van planten op te helderen. De gepresenteerde methode zou bijvoorbeeld breed toepasbaar moeten zijn voor het snel kwantificeren van de huidmondjesopening in een intact heel plantensysteem na blootstelling aan biotische stress zoals MAMP's en microbiële pathogenen, evenals abiotische stress zoals droogte. Ter ondersteuning hiervan heeft een eerdere studie met succes de beeldanalysepijplijn toegepast om de stomatale opening van "bladschijven" die zijn behandeld met het schimmeltoxine fusicoccine dat de stomatale opening induceert of het stresshormoon abscisinezuur dat de sluiting van de huidmondjes induceert, nauwkeurig te kwantificeren7. Bovendien maakt het draagbare beeldvormingsapparaat in principe een langdurige analyse van het tijdsverloop mogelijk van de huidmondjesopening op een enkel identiek blad dat aan de plant is bevestigd. Dit zou licht kunnen werpen op nieuwe aspecten van plant-microbe interacties, omdat de meeste studies zich hebben gericht op stomatale reacties op bacteriële pathogenen gedurende de eerste paar uur van de interactie 9,10,11. Het zal ook interessant zijn om de gepresenteerde methode te gebruiken en aan te passen om stomatale reacties op bacteriële invasie onder verschillende omgevingsomstandigheden te onderzoeken. Dit is met name relevant voor het begrijpen van de effecten van omgevingsfactoren zoals temperatuur, vochtigheid en beschikbaarheid van bodemwater die van invloed zijn op huidmondbewegingen en ziekteontwikkeling door bacteriële pathogenen 8,15. Concluderend kan worden gesteld dat de gepresenteerde methode bedoeld is om het onderzoek naar huidmondjesfuncties in en buiten plant-microbe-interacties te versnellen in tot nu toe onbereikbare experimentele omgevingen.

Huidmondjes zijn microscopisch kleine poriën omgeven door een paar wachtcellen op het oppervlak van bladeren en andere bovengrondse delen van planten. In steeds veranderende omgevingen is de regulering van de huidmondjesopening van cruciaal belang voor planten om de opname van kooldioxide te regelen die nodig is voor fotosynthese ten koste van waterverlies via transpiratie. De kwantificering van de huidmondjesopening is dus van groot belang geweest voor het begrijpen van de aanpassing van het milieu aan planten. Het kwantificeren van de huidmondjesopening is echter inherent tijdrovend en omslachtig, omdat het menselijke arbeid vereist om stomatale poriën te herkennen en te meten in een bladbeeld dat door een microscoop is vastgelegd. Om deze beperkingen te omzeilen, zijn verschillende methoden ontwikkeld om de kwantificering van de stomatale opening in Arabidopsis thaliana te vergemakkelijken, een modelplant die op grote schaal wordt gebruikt om de stomatale biologie 1,2,3,4,5,6 te bestuderen. Een porometer kan bijvoorbeeld worden gebruikt om de transpiratiesnelheid te meten als maatstaf voor stomatale geleiding. Deze methode geeft echter geen directe informatie over het huidmondgetal en de opening die de huidmondgeleiding bepalen. Sommige onderzoeken hebben confocale microscopietechnieken gebruikt die de stomatale poriën benadrukken met behulp van een fluorescerende actinemarker, een fluorescerende kleurstof of celwandautofluorescentie 1,2,3,4,5. Hoewel deze benaderingen de detectie van huidmondjes vergemakkelijken, kunnen de kosten van zowel het exploiteren van een confocale microscopiefaciliteit als het voorbereiden van microscopiemonsters een obstakel vormen voor routinematige toepassing. In een baanbrekend werk van Sai et al. werd een diep neuraal netwerkmodel ontwikkeld om automatisch de stomatale opening te meten op basis van helderveldmicroscopische beelden van A. thaliana epidermale peelings6. Toch ontslaat deze innovatie onderzoekers niet van de taak om een epidermale peeling voor te bereiden op microscopische observatie. Onlangs werd dit obstakel overwonnen door een draagbaar beeldvormingsapparaat te ontwikkelen dat huidmondjes kan observeren door in een blad van A. thaliana te knijpen, samen met een op deep learning gebaseerde beeldanalysepijplijn die automatisch de huidmondopening meet op basis van bladbeelden die door het apparaat zijn vastgelegd7.
Huidmondjes dragen bij aan de aangeboren immuniteit van planten tegen bacteriële ziekteverwekkers. De sleutel tot deze immuunrespons is stomatale sluiting die het binnendringen van bacteriën door de microscopisch kleine porie in het binnenste van het blad beperkt, waar bacteriële ziekteverwekkers zich vermenigvuldigen en ziekten veroorzaken. Stomatale sluiting wordt geïnduceerd na herkenning van microbe-geassocieerde moleculaire patronen (MAMP's), immunogene moleculen die vaak gemeenschappelijk zijn voor een klasse van microben, door plasmamembraan-gelokaliseerde patroonherkenningsreceptoren (PRR's)9. Een epitoop van 22 aminozuren van bacterieel flagelline, bekend als flg22, is een typische MAMP die stomatale sluiting induceert door de herkenning ervan door de PRR FLS210. Als tegenmaatregel kunnen bacteriële ziekteverwekkers zoals Pseudomonas syringae pv. tomaat DC3000 (PTO) en Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria hebben virulentiemechanismen ontwikkeld om huidmondjes te heropenen 9,11,12. Deze huidmondjes op bacteriële pathogenen zijn conventioneel geanalyseerd in tests waarbij epidermale peelings van bladeren, bladschijven of losse bladeren op bacteriële suspensie worden gezweefd en vervolgens huidmondjes worden waargenomen onder een microscoop, gevolgd door handmatige meting van de huidmondjesopening. Deze tests zijn echter omslachtig en weerspiegelen mogelijk geen huidmondjes op natuurlijke bacteriële invasie die optreden in een blad dat aan de plant is bevestigd.
Hier wordt een eenvoudige methode gepresenteerd om stomatale sluiting en heropening tijdens Pto-invasie te onderzoeken onder de voorwaarde die de natuurlijke interactie tussen plant en bacterie nauw nabootst. Deze methode maakt gebruik van het draagbare beeldvormingsapparaat voor directe observatie van A. thaliana huidmondjes op een blad dat is bevestigd aan de plant die is geïnoculeerd met Pto, samen met de beeldanalysepijplijn voor geautomatiseerde meting van de huidmondaopening.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Nakarai tesque</td><td>01028-85</td><td></td></tr><tr><td>Airbrush kits</td><td>ANEST IWATA</td><td>MX2900</td><td>Accessoire kits voor SPRINT JET</td></tr><tr><td>Biotron</td><td>Nippon Medical &amp; Chemical Instruments</td><td>LPH-411S</td><td>Plantengroeikamerbehuizing met witte fluorescentielamp</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Wako</td><td>072-00626</td><td></td></tr><tr><td>Half tray</td><td>Sakata</td><td>72000113</td><td>Een set van bak en deksel</td></tr><tr><td>Hyponex</td><td>Hyponex</td><td>Geen catalogusnummer beschikbaar</td><td>Verdun de oplossing van Hyponex in een verhouding van 1:2000 in gedeïoniseerd water voor het bewateren van planten</td></tr><tr><td>Image J</td><td>Natinal Institute of Health</td><td>Downloaden op https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td><td>Gebaat voor handmatige meting van stomata opening</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Wako</td><td>164-04295</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Wako</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Wako</td><td>168-21815</td><td>Voor MES-KOH</td></tr><tr><td>MES</td><td>Wako</td><td>343-01621</td><td>Voor MES-KOH</td></tr><tr><td>Portable stomatal imaging device</td><td>Phytometrics</td><td>Bestel op https://www.phytometrics.jp/</td><td>Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018.</td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Wako</td><td>185-01003</td><td>Oplossen in DMSO</td></tr><tr><td>Silwet-L77</td><td>Bio medical science</td><td>BMS-SL7755</td><td>Silicone oppervlakteactieve stof gebruikt bij spuit inoculatie</td></tr><tr><td>SPRINT JET</td><td>ANEST IWATA</td><td>IS-800</td><td>Airbrush gebruikt voor spuit inoculatie</td></tr><tr><td>SuperMix A</td><td>Sakata seed</td><td>72000083</td><td>Mengen met Vermiculite G20 in gelijke verhoudingen voor het bereiden van aarde</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Nakarai tesque</td><td>35640-95</td><td></td></tr><tr><td>Vermiculite G20</td><td>Nittai</td><td>Geen catalogusnummer beschikbaar</td><td>Mengen met Super Mix A in gelijke verhoudingen voor het bereiden van aarde</td></tr><tr><td>White fluorescent light</td><td>NEC</td><td>FHF32EX-N-HX-S</td><td>Gebaat voor Biotron</td></tr></tbody></table>

directe observatie en geautomatiseerde meting van stomatale responsen op pseudomonas syringae pv. tomaat dc3000 in arabidopsis thaliana

Direct Observation and Automated Measurement of Stomatal Responses to Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 in Arabidopsis thaliana

Huidmondjes zijn microscopisch kleine poriën die worden aangetroffen in de epidermis van het plantenblad. Regulering van de huidmondjesopening is niet alleen van cruciaal belang voor het balanceren van de opname van kooldioxide voor fotosynthese en transpiratief waterverlies, maar ook voor het beperken van bacteriële invasie. Terwijl planten huidmondjes sluiten bij herkenning van microben, pathogene bacteriën, zoals Pseudomonas syringae pv. tomaat DC3000 (PTO), heropen de gesloten huidmondjes om toegang te krijgen tot het binnenste van de vleugel. In conventionele tests voor het beoordelen van stomatale reacties op bacteriële invasie, worden epidermale peelings van bladeren, bladschijven of losse bladeren op bacteriële suspensie gezweefd en vervolgens worden huidmondjes onder een microscoop geobserveerd, gevolgd door handmatige meting van de huidmondjesopening. Deze tests zijn echter omslachtig en weerspiegelen mogelijk geen huidmondjes op natuurlijke bacteriële invasie in een blad dat aan de plant vastzit. Onlangs is een draagbaar beeldvormingsapparaat ontwikkeld dat huidmondjes kan observeren door in een blad te knijpen zonder het los te maken van de plant, samen met een op deep learning gebaseerde beeldanalysepijplijn die is ontworpen om automatisch de huidmondopening te meten op basis van bladbeelden die door het apparaat zijn vastgelegd. Voortbouwend op deze technische vooruitgang wordt hier een nieuwe methode geïntroduceerd om de stomatale respons op bacteriële invasie in Arabidopsis thaliana te beoordelen. Deze methode bestaat uit drie eenvoudige stappen: sprayinoculatie van Pto die natuurlijke infectieprocessen nabootst, directe observatie van huidmondjes op een blad van de Pto-geïnoculeerde plant met behulp van het draagbare beeldvormingsapparaat en geautomatiseerde meting van de huidmondjesopening door de beeldanalysepijplijn. Deze methode werd met succes gebruikt om stomatale sluiting en heropening tijdens Pto-invasie aan te tonen onder omstandigheden die de natuurlijke interactie tussen plant en bacterie nauw nabootsen.

Na spray-inoculatie van Pto werden huidmondjes op bladeren die aan de geïnoculeerde planten waren bevestigd, direct waargenomen door het draagbare stomatale beeldvormingsapparaat. Met behulp van handmatige en geautomatiseerde metingen werden dezelfde bladafbeeldingen gebruikt om de huidmondjesopening te berekenen door verhoudingen van breedte tot lengte van ongeveer 60 huidmondjes te nemen. Handmatige en geautomatiseerde metingen duidden consequent op een afname van de huidmondjesopening in Pto-geïnoculeerde planten in vergelijking met nep-geïnoculeerde planten 1 uur na inoculatie (hpi) (Figuur 3A,B), wat aangeeft dat A thaliana huidmondjes sluit als reactie op Pto-invasie. Bij 3 hpi was de huidmondopening in Pto-geïnoculeerde planten en nep-geïnoculeerde planten vrijwel hetzelfde (Figuur 3C,D), wat doet denken aan de heropening van de huidmondjes door Pto. Opmerkelijk is dat de geautomatiseerde meting van de stomatale opening slechts ongeveer 5 seconden duurde om één beeld te verwerken (tabel 1), waardoor de meettijd met meer dan 95% werd verkort in vergelijking met de handmatige meting. Dit protocol biedt dus een operationeel eenvoudige en arbeidsbesparende manier om de dynamische huidmondjes van A. thaliana op de bacteriële ziekteverwekker te volgen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66112/66112fig01.jpg"> Afbeelding 1: Draagbaar beeldvormingsapparaat. Foto's van het draagbare beeldvormingsapparaat met een blad op het podium (links) en met de bovenklep gesloten (rechts). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66112/66112fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66112/66112fig02.jpg"> Figuur 2: Schematisch diagram van de meting van de huidmondaopening. (A) De huidmondopening wordt bepaald door de verhouding tussen breedte en lengte van een stoma te berekenen, zoals aangegeven door witte pijlen. (B) Prematuur en (C) onduidelijk huidmondjes moeten van de meting worden uitgesloten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66112/66112fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66112/66112fig03.jpg"> Figuur 3: Huidmondjesreacties op Pto in een intacte hele plant. A. thaliana planten werden besproeid met mock of Pto, en huidmondjes op bladeren die aan de geïnoculeerde planten vastzaten, werden direct waargenomen bij (A,B) 1 hpi en (C,D) 3 hpi door het draagbare stomatale beeldvormingsapparaat. De huidmondopening (verhouding) werd berekend door (A,C) handmatige en (B,D) geautomatiseerde metingen. P-waarden werden berekend door middel van een tweezijdige t-toets. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66112/66112fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td colspan="2">Verwerkingstijd(en)</td>
		</tr><tr><td>Methode</td>
			<td>Bedoelen</td>
			<td>SD</td>
		</tr><tr><td>Handmatig</td>
			<td>130.1</td>
			<td>48.8</td>
		</tr><tr><td>Geautomatiseerde</td>
			<td>4.7</td>
			<td>0.8</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Verwerkingstijd voor handmatige en geautomatiseerde metingen van de stomatale opening per beeld. Gemiddelden en standaarddeviaties (SD) van de verwerkingstijd werden berekend op basis van de metingen van negen representatieve beelden.

Hier presenteren we een eenvoudige methode voor directe observatie en geautomatiseerde meting van stomatale reacties op bacteriële invasie in Arabidopsis thaliana. Deze methode maakt gebruik van een draagbaar stomatale beeldvormingsapparaat, samen met een beeldanalysepijplijn die is ontworpen voor bladbeelden die door het apparaat zijn vastgelegd.

Directe observatie en geautomatiseerde meting van stomatale responsen op Pseudomonas syringae pv. tomaat DC3000 in Arabidopsis thaliana

Stomata are microscopic pores found in the plant leaf epidermis. Regulation of stomatal aperture is pivotal not only for balancing carbon dioxide uptake ...

Plantale huidmondjes spelen een centrale rol bij de aanpassing aan stressomstandigheden, dus we moeten de huidmondjesopening meten om te begrijpen hoe planten reageren op biotische en abiotische stress. Het meten van de huidmondjesopening is echter tijdrovend en omslachtig. Om de opening van huidmondjes te meten, pellen we de opperhuid en observeren we huidmondjes onder een microscoop.Vervolgens meten we handmatig de opening van huidmondjes, wat zelfs voor zeer ervaren onderzoekers lang duurt. We daagden deze barrières uit en ontwikkelden een tool en een techniek die automatisch de huidmondjesopening in intacte Arabidopsis-bladeren kan meten. We zijn er dus sterk van overtuigd dat het huidmondjesmeetapparaat en het deep-learning-algoritme dat we hebben ontwikkeld, de functionele analyse van huidmondjesreacties op verschillende biotische en abiotische stress zullen vergemakkelijken, omdat deze technische vooruitgang de tijd en menselijke arbeid die nodig is voor het meten van huidmondjesopeningen aanzienlijk zal verminderen.

direct-observation-automated-measurement-stomatal-responses-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We hebben een eenvoudige en reproduceerbare protocol om stomatale reactie op de levende bacteriën te openen. Deze methode minimaliseert verwonden en manipulatie van het blad ten opzichte van het gebruik van de epidermale schillen eerder gerapporteerd.

Het beoordelen van stomatale Reactie op bacteriële cellen Live met behulp van Whole Leaf Imaging

Source: Liu, X., et al. Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method to assess the bacterial load in Arabidopsis thaliana leaves infected with Pseudomonas syringae. Leaf discs from infected leaves are homogenized, serially diluted, and plated onto nutrient-rich agar to promote bacterial colony formation. Colony counts are then used to...

Assessing Pseudomonas syringae Infection Load in Arabidopsis thaliana Leaves

Kwantificering van ziekteverwekkergroei is een krachtig hulpmiddel om verschillende Arabidopsis thaliana (hierna: Arabidopsis) immuunresponsen te karakteriseren. De hier beschreven methode presenteert een geoptimaliseerde spuitinfiltratie-assay om de groei van Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 in volwassen Arabidopsis-bladeren te kwantificeren.

Bacteriële Leaf Infiltratie Assay voor Beeldende karakterisatie van Plant Defense Reacties met behulp van de<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

Het doel van dit protocol is om te demonstreren hoe fluorescent-gelabelde eiwit dynamiek op plantencel oppervlakken met een variabele hoek epifluorescentiemicroscopie, waaruit blijkt knipperende stippen van GFP-gelabeld PATROL1, een membraan mensenhandel eiwit te controleren, in de cel cortex van de stomatale complex in Arabidopsis thaliana.

Real-time beeldvorming van Plant Cell Surface Dynamics met variabele hoek epifluorescentiemicroscopie

Hier presenteren we een protocol voor het bestuderen van de plant groei gedrag en vooral fenotypen op een reproduceerbare wijze. Variabele en op de dezelfde tijd stabiel lichtomstandigheden, tonen we hoe te verstrekken. Goede analyses, is afhankelijk van voldoende monster getallen en geldige statistische evaluaties.

Analyse van Arabidopsis thaliana groei gedrag in verschillende kwaliteiten van het licht

Dit protocol beschrijft een methode voor te bereiden van verrijkte stomatal guard cellen die nuttig is voor fysiologische en andere biologische studies.

Stoma Tape-Peel: Een verbeterde methode voor de bereiding van de monsters van de Guard cel

Wij rapporteren een eenvoudig en veelzijdig methode voor het uitvoeren van fluorescerende live-imaging van Arabidopsis thaliana bladeren gedurende een langere periode van tijd. We gebruiken een transgene Arabidopsis plant die een fluorescerende verslaggever-gen uitdrukt onder de controle van een promotor immuniteit-gerelateerde als voorbeeld voor het verkrijgen van Spatio begrip van de immuunreacties van de plant.

Een veelzijdige methode voor de montage van Arabidopsis vertrekt naar Intravital Time-lapse Imaging

Dit artikel beschrijft twee methoden voor het kwantificeren van verdediging reacties in Arabidopsis thaliana na blootstelling aan immuun uitlokken: de voorbijgaande oxidatieve uitbarsting, en de remming van zaailing groei.

Patroon-geactiveerde oxidatieve burst en zaailing groeiremming assays in Arabidopsis thaliana

Wij bieden een methode voor het identificeren van modulatoren van bladtranspiratie door grootschalige screening van een samengestelde bibliotheek.

Identificatie van nieuwe regulatoren van plantaardige transpiratie door grootschalige thermische beeldvorming screening in Helianthus Annuus

De zaailing overstromingstest vergemakkelijkt een snelle screening van wilde tomaten toetredingen voor de weerstand tegen de Pseudomonas syringae bacterie. Deze test, gebruikt in combinatie met de zaailing bacteriële groei test, kan helpen bij het verder karakteriseren van de onderliggende weerstand tegen de bacterie, en kan worden gebruikt om het scherm mapping populaties om de genetische basis van resistentie te bepalen.

High-Throughput Identificatie van resistentie tegen Pseudomonas syringae pv. Tomaat in Tomaat met seedling Flood Assay

Dit artikel beschrijft twee fenotyperingsmethoden zonder het gebruik van epidermale peelings om de genen te karakteriseren die de stomatale ontwikkeling regelen. De eerste methode demonstreert hoe een stomataal fenotype kan worden geanalyseerd met behulp van een toluidineblauwe O-gekleurde plantenepidermis. De tweede methode beschrijft hoe stomatale liganden te identificeren en hun biologische activiteiten te volgen.

Identificatie van de genen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van stomato via epidermale fenotypescores

Ontdek een geautomatiseerde methode voor het meten van stomatale openingen in Arabidopsis thaliana met behulp van een draagbaar beeldvormingsapparaat en deep learning. Deze techniek vermindert de meettijd met 95% en vergemakkelijkt onderzoek naar plantenstress.

Directe observatie en geautomatiseerde meting van stomatale responsen op Pseudomonas syringae pv. tomaat DC3000 in Arabidopsis thaliana (Video) | JoVE Journal

Directe observatie en geautomatiseerde meting van stomatale responsen op Pseudomonas syringae pv. tomaat DC3000 in Arabidopsis thaliana

Meer video's verkennen