Name: Differentiatie van afstammingslijnen van het enterische zenuwstelsel van menselijke pluripotente stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T13:35:00.000+00:00
Duration: 5 min 11 s
Description: Leer hoe je functionele humane enterische neuronen genereert van pluripotente stamcellen via neurale lijstinductie. Dit robuuste platform ondersteunt ziekte-modellering en onderzoek naar het enterische zenuwstelsel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk werd ondersteund door subsidies van het UCSF-programma voor doorbraakbiomedisch onderzoek en de Sandler Foundation, March of Dimes-subsidie nr. 1-FY18-394 en 1DP2NS116769-01, de NIH Director's New Innovator Award (DP2NS116769) aan F.F. en het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK121169) aan F.F., HM wordt ondersteund door Larry L. Hillblom Foundation postdoctorale fellowship, NIH T32-DK007418 fellowship en UCSF-programma voor Breakthrough Biomedical Research onafhankelijke postdoctorale fellowship.

1. Voorbereiding van de media
OPMERKING: De concentraties die in het hele protocol worden genoemd, zijn de eindconcentraties van de mediacomponenten. Bereid alle media onder steriele omstandigheden voor in een laminaire vloeikap en bewaar ze bij 4 °C in het donker. Gebruik binnen 2 weken.
<ol><li>hPSC-onderhoudsmedium: Meng het voedingsvrije hPSC-onderhoudsmediumsupplement (20 μL/ml) met het basismedium.</li>
	<li>Medium A: Voeg botmorfogenetisch eiwit 4 (BMP4; 1 ng/ml), SB431542 (10 μM) en CHIR99021 (600 nM) toe aan het differentiatiebasismedium.</li>
	<li>Medium B: Voeg SB431542 (10 μM) en CHIR99021 (1,5 μM) toe aan het differentiatiebasismedium.</li>
	<li>Medium C: Voeg SB431542 (10 μM), CHIR99021 (1,5 μM) en RA (1 μM) toe aan het differentiatiebasismedium.</li>
	<li>Neural crest complete (NCC) Medium: Voeg FGF2 (10 ng/ml), CHIR99021 (3 μM), N2-supplement (10 μL/ml), B27-supplement (20 μL/ml), L-glutaminesupplement (10 μL/ml) en MEM NEAA's (10 μL/ml) toe aan neurobasaal medium.</li>
	<li>ENC-medium: Voeg GDNF (10 ng/ml), ascorbinezuur (100 μM), N2-supplement (10 μL/ml), B27-supplement (20 μL/ml), L-glutaminesupplement (10 μL/ml) en MEM NEAA's (10 μL/ml) toe aan neurobasaal medium.</li>
	<li>Ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) 1x: Verdun 500 mM EDTA (1000x) tot een eindconcentratie van 500 μM in PBS. OPMERKING: Gebruik Ca2+ en Mg2+ vrije PBS in dit protocol, tenzij anders vermeld.</li>
</ol>2. Coaten van kweekplaten
<ol><li>Met basale membraanmatrix beklede platen: Ontdooi en verdun snel een bevroren aliquot van 500 μl basale membraanmatrix in 50 ml gekoelde DMEM:F12 door krachtig te pipetteren met een serologische pipet van 50 ml. Smeer de putjes in met de verdunde basaalmembraanmatrixoplossing (100 μl percm2 putoppervlak) en incubeer ze een nacht bij 37 °C. Zuig het coatingmedium op voor gebruik. Om verstijfseling van de basale membraanmatrix te voorkomen, voert u deze stap zo snel mogelijk uit en gebruikt u koude DMEM:F12 voor het oplossen van de bevroren aliquot. OPMERKING: De temperatuur van de basale membraanmatrix moet koud worden gehouden tijdens het ontdooien (op ijs) en aliquoteren (buizen op ijs) om coagulatie te voorkomen.</li>
	<li>PO/FN/laminine gecoate platen: Bereid een 15 μg/ml polyornithine (PO) oplossing in PBS door een 1000x bouillon te verdunnen. Smeer de putjes in met 100 μl PO/PBS-oplossing per cm2 putoppervlak en incubeer de platen een nacht bij 37 °C. Aspireer de volgende dag PO/PBS en smeer de putjes in op 100 μl percm2 putoppervlak met vers gemaakte FN/laminine/PBS-oplossing die 2 μg/ml fibronectine (FN) en 2 μg/ml laminine bevat. Platen kunnen worden gebruikt na minimaal 2 uur incubatie bij 37 °C. Zuig FN/laminin/PBS op voor gebruik.</li>
</ol>3. Behoud van de hPSC-cultuur
OPMERKING: Alle celincubatiestappen zijn bij 5% CO2 en bij 37 °C in een bevochtigde incubator.
<ol><li>Aspireer hPSC-medium uit de hPSC-cultuur en voeg om de dag vers medium toe (200 μL percm2 putoppervlak) totdat de kolonies ~80% samenvloeien.</li>
	<li>Om te passeren, zuigt u hPSC-medium op en wast u de cellen met 100 μL PBS percm2 putoppervlak. LET OP: Het is belangrijk om Ca2+ en Mg2+ vrije PBS te gebruiken om de cellen te wassen.</li>
	<li>Voeg 500 μM EDTA toe (100 μL percm2 putoppervlak). Plaats het deksel van de plaat terug. Kijk door een omgekeerde microscoop en controleer de cellen op loslating van de kolonieranden (2-4 min).</li>
	<li>Gebruik een serologische pipet van 5 of 10 ml om hetzelfde volume hPSC-medium in elk putje over te brengen en oogst de cellen mechanisch door een paar keer op en neer te pipetteren. OPMERKING: De optimale EDTA-incubatietijd is afhankelijk van de iPSC-lijn. Vermijd krachtig pipetteren voor het losmaken van kolonies, omdat dit kan leiden tot overmatige dissociatie van de kolonie en celdood. Bij het passeren om een differentiatieplaat te starten, incubeer cellen met EDTA 1-2 minuten langer.</li>
	<li>Breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 ml. Draai de cellen rond (2 min, 290 x g, 20-25 °C) en gooi het supernatant voorzichtig weg.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen in een geschikt volume hPSC-medium en breng ze over naar putjes van een nieuwe met basaalmembraanmatrix beklede plaat. OPMERKING: Gebruik voor regelmatig hPSC-onderhoud een passaging-verhouding van 1:18 - 1:24 (1:18 betekent het overbrengen van een derde van de cellen gedissocieerd van een enkel putje van een plaat met 6 putjes naar een volledig nieuwe plaat). Om een differentiatieplaat te starten, volgt u een passaging-verhouding van 5:6.</li>
	<li>Incubeer bij 5% CO2 en 37 °C.</li>
</ol>4. Inductie van neurale kam
OPMERKING: Deze stap is schematisch weergegeven in figuur 1A. Begin met NC-differentiatie wanneer cellen voor ongeveer 80% samenvloeien. Dit zal binnen 1-2 dagen worden bereikt wanneer cellen worden gepasseerd in een verhouding van 5:6 (zie hierboven). Start NC-differentiatie op dag 0 met pluripotente en volledig ongedifferentieerde hPSC-cellen. Voor een hoge efficiëntie moeten de koloniegrenzen minimale differentiërende cellen hebben. Passage en plaat hPSC voor differentiatie wanneer kolonies groot zijn, of het centrum van de kolonie begint dikker/donkerder te worden wanneer het wordt gecontroleerd met een omgekeerde microscoop. Aandacht besteden aan de samenvloeiing en morfologie is meestal betrouwbaarder dan het aantal vergulde cellen, aangezien dit kan variëren afhankelijk van de cellijn en kan variëren van 50.000-200.000 per cm2.
<ol><li>Vervang op dag 0 hPSC-onderhoudsmedium door medium A met 1 ng/ml BMP4, 10 μM SB431542, 600 nM CHIR99021 (200 μL medium per cm2 putoppervlak).</li>
	<li>Op dag 2 moeten de cellen 100% samenvloeiend zijn. Zuig verbruikt medium A voorzichtig op en voed de cellen met medium B met 10 μM SB431542, 1,5 μM CHIR99021 (200 μL medium percm2 putoppervlak). OPMERKING: Naarmate culturen groeien tijdens de NC-inductie, kunnen cellen loskomen van de onderliggende monolaag. Voorkom overmatig celverlies door oude media voorzichtig te verwijderen en nieuwe media aan de zijkant van de put toe te voegen.</li>
	<li>Op dag 4 voed de cellen de cellen opnieuw met Medium B (200 μL medium percm2 putoppervlak).</li>
	<li>Vervang op dag 6 medium B door medium C met 10 μM SB431542, 1,5 μM CHIR99021 en 1 μM retinoïnezuur (400 μL medium per cm2 putoppervlak).</li>
	<li>Op dag 8 en 10 voer je zoals dag 6.</li>
</ol>5. ENC-sferoïde vorming
OPMERKING: Deze stap is schematisch weergegeven in Figuur 1B.
<ol><li>Aspireer op dag 12 voorzichtig Medium C en was de cellen met 100 μL PBS percm2 putoppervlak. Voeg dezelfde hoeveelheid oplossing voor celloslating toe en incubeer gedurende 30 minuten bij 5% CO2 en 37 °C.</li>
	<li>Verdun de oplossing voor celloslating door hetzelfde volume NCC-medium toe te voegen dat 10 ng/ml FGF2, 3 μM CHIR99021, 10 μL/ml N2-supplement, 20 μL/ml B27-supplement, 10 μL/ml L-glutaminesupplement en 10 μL/ml mem NEAA bevat. Gebruik een serologische pipet om de eencellige suspensie te oogsten en toe te voegen aan een conische buis van 15 ml.</li>
	<li>Draai de cellen rond (2 min, 290 x g, 20-25 °C) en gooi het supernatant voorzichtig weg.</li>
	<li>Voeg met een serologische pipet van 10 ml 12 ml (voor een volledige plaat met 6 gaatjes) NCC-medium toe en resuspendeer de cellen volledig door 1-2 keer mechanisch op en neer te pipetteren. Breng de celsuspensie over naar een ultralage bevestigingsplaat. OPMERKING: Ongeveer 10cm2 ENC-monolaagcellen worden geresuspendeerd in 2 ml NCC-medium en overgebracht naar een putje van een ultralage bevestigingsplaat. Dit komt overeen met een volledige NC-inductieplaat met 6 putjes die is overgebracht naar een volledige ultralage bevestigingsplaat met 6 putjes.</li>
	<li>Draai op dag 14 de platen voorzichtig rond totdat er kleine sferoïden in het midden van elk putje zijn verzameld. Gebruik een P1000-micropipet en in een langzame cirkelvormige beweging om het gebruikte NCC-medium rond de omtrek van elk putje op te zuigen. Probeer te voorkomen dat de vrij zwevende sferoïden worden verwijderd.</li>
	<li>Voed de cellen met het oorspronkelijke volume NCC-medium.</li>
</ol>6. EN inductie
OPMERKING: Deze stap is schematisch weergegeven in Figuur 1B.
<ol><li>Pas op dag 15 dezelfde techniek toe die op dag 14 wordt gebruikt om het medium voorzichtig te verwijderen en de sferoïden te wassen met PBS. Verwijder zoveel mogelijk PBS en vermijd de sferoïden.</li>
	<li>Voeg de oplossing voor celloslating toe (100 μl percm2 van het oppervlak van de put) en dissocieer de sferoïden in afzonderlijke cellen door 30 minuten te incuberen bij 5% CO2 en 37 °C.</li>
	<li>Voeg met behulp van een serologische pipet van 10 ml een gelijk volume ENC-medium (met 10 ng/ml GDNF, 100 μM ascorbinezuur, 10 μL/ml N2-supplement, 20 μL/ml B27-supplement, 10 μL/ml L-glutaminesupplement en 10 μL/ml mem NEAA in neurobasaal medium) toe aan elk putje en breek de resterende sferoïden door 2-3 rondes mechanisch pipetteren. Breng de cellen over in een conische buis van 50 ml. OPMERKING: Vermijd overmatige stress en celdood die kunnen optreden door geforceerd pipetteren of het gebruik van pipetten met een kleinere tipopening.</li>
	<li>Draai de cellen rond (2 min, 290 x g, 20-25 °C) en gooi het supernatant voorzichtig weg. Gebruik een serologische pipet van 10 ml om ~ 5-10 ml ENC-medium toe te voegen en resuspendeer de cellen volledig door 1-2 keer op en neer te pipetteren.</li>
	<li>Tel de concentratie van levensvatbare cellen met behulp van trypanblauw en een celtelmethode zoals een hemocytometer. LET OP: Trypanblauw is vermoedelijk kankerverwekkend. Voorzichtig behandelen, op de juiste manier weggooien.</li>
	<li>Voeg voldoende volume ENC-medium toe om ongeveer 300.000-400.000 levensvatbare cellen percm2 oppervlak te bedekken met een dichtheid van ongeveer ~ 1.000.000 cellen per ml. Zuig FN/laminine/PBS-oplossing op uit putjes van de plaat. OPMERKING: Kies het plaatformaat op basis van de tests die zijn gepland voor de EN-culturen, aangezien deze fase de laatste stap van het opnieuw plateren van het protocol markeert. Voorlopers van enterische neuronen kunnen op dag 15 worden ingevroren. Na het dissociëren van de bolletjes met een oplossing voor celloslating, resuspendeert u de voorlopercellen bij ongeveer 5 x 106 cellen/ml in vriesmedium zoals 10% DMSO of Stem-cellbanker. Indien nodig ontdooien in warme ENC-media met 5 μM Y-27632 ROCK-remmer. Plaatcellen in het gewenste plaatformaat. Vervang de media na een paar uur door verse ENC.</li>
	<li>Voeg de cellen voorzichtig toe aan de met PO/FN/laminine beklede putjes. Voorkom dat luchtbellen vast komen te zitten onder de celsuspensie, waardoor de cellen zich niet hechten aan de PO/FN/lamininecoating, vooral bij gebruik van platen met een kleinere putgrootte, zoals platen met 384 putjes. Dit kan leiden tot celdood.</li>
	<li>Voer de cellen om de dag met ENC-medium (200 μL percm2 putoppervlak) tot dag 30-40, verlaag daarna de voedingsfrequentie (tot één of twee keer per week) maar verdubbel het voedingsvolume (tot 400 μL medium percm2 putoppervlak). OPMERKING: Dit is belangrijk omdat overmatig verwijderen en toevoegen van media de loslating van de neuronale cultuur van het oppervlak van de putten kan vergemakkelijken. Om prospectief loslating te voorkomen, vooral bij culturen op langere termijn, vult u ENC eenmaal per week aan met FN (2 μg/ml) en laminine (2 μg/ml).</li>
</ol>

Afleiding van enterische neuronen uit menselijke pluripotente stamcellen

<ol><li>Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enteric+nervous+system%3A+a+second+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Hosp+Pract%22%5BJournal%5D)">The enteric nervous system: a second brain.</a> Hosp Pract. 34 (7), 35-38 (1999).</li>
<li>Haggarty, S. J., Silva, M. C., Cross, A., Brandon, N. J., Perlis, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+drug+discovery+for+neuropsychiatric+disorders+using+patient-specific+stem+cell+models%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Advancing drug discovery for neuropsychiatric disorders using patient-specific stem cell models.</a> Mol Cell Neurosci. 73, 104-115 (2016).</li>
<li>Bose, A., Petsko, G. A., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+a+tool+for+modeling+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: a tool for modeling Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 45 (8), 608-620 (2022).</li>
<li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells%3A+from+2D+to+3D+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Camb+Engl%22%5BJournal%5D)">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Dev Camb Engl. 145 (5), (2018).</li>
<li>Marchetto, M. C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+neural+development+and+treatment+of+Rett+syndrome+using+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 143 (4), 527-539 (2010).</li>
<li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134 (5), 877-886 (2008).</li>
<li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).</li>
<li>Shyamala, K., Yanduri, S., Girish, H. C., Murgod, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest%3A+The+fourth+germ+layer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oral+Maxillofac+Pathol%22%5BJournal%5D)">Neural crest: The fourth germ layer.</a> J Oral Maxillofac Pathol. 19 (2), 221-229 (2015).</li>
<li>Crane, J. F., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest stem and progenitor cells.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 267-286 (2006).</li>
<li>Thomas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neural+crest+cells+display+molecular+and+phenotypic+hallmarks+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Human neural crest cells display molecular and phenotypic hallmarks of stem cells.</a> Hum Mol Genet. 17 (21), 3411-3425 (2008).</li>
<li>Heanue, T. A., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+nervous+system+development+and+Hirschsprung%27s+disease%3A+advances+in+genetic+and+stem+cell+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Enteric nervous system development and Hirschsprung's disease: advances in genetic and stem cell studies.</a> Nat Rev Neurosci. 8, 466-479 (2007).</li>
<li>Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+neural+crest+induction%2C+melanocyte+specification%2C+and+disease-related+pigmentation+defects+in+hESCs+and+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs.</a> Cell Rep. 3 (4), 1140-1152 (2013).</li>
<li>Fattahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+human+ENS+lineages+for+cell+therapy+and+drug+discovery+in+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease.</a> Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).</li>
<li>Barber, K., Studer, L., Fattahi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+enteric+neuron+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Derivation of enteric neuron lineages from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 14 (4), 1261-1279 (2019).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+transplantation+of+enteric+neural+crest+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Mol Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).</li>
<li>Workman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+human+pluripotent-stem-cell-derived+intestinal+tissues+with+a+functional+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system.</a> Nat Med. 23, 49-59 (2017).</li>
<li>Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox10+mutation+disrupts+neural+crest+development+in+Dom+Hirschsprung+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model.</a> Nat Genet. 18 (1), 60-64 (1998).</li>
<li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+directed+differentiation+of+neural+crest+stem+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 25 (12), 1468-1475 (2007).</li>
<li>Majd, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hPSC-derived+enteric+ganglioids+model+human+ENS+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">hPSC-derived enteric ganglioids model human ENS development and function.</a> BioRxiv. , (2022).</li>
<li>Majd, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+Schwann+cells+from+hPSCs+enables+disease+modeling+and+drug+discovery+for+diabetic+peripheral+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Deriving Schwann cells from hPSCs enables disease modeling and drug discovery for diabetic peripheral neuropathy.</a> Cell Stem Cell. 30 (5), 632-647 (2023).</li>
<li>Samuel, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Schwann+cell+derived+melanocytes+from+hPSCs+identifies+pro-metastatic+factors+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Generation of Schwann cell derived melanocytes from hPSCs identifies pro-metastatic factors in melanoma.</a> BioRxiv. , (2023).</li>
<li>Richter, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+muscarinic+receptor+signaling+protects+human+enteric+inhibitory+neurons+against+platin+chemotherapy+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Inhibition of muscarinic receptor signaling protects human enteric inhibitory neurons against platin chemotherapy toxicity.</a> BioRxiv. , (2023).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het hier beschreven differentiatieprotocol biedt een robuuste in vitro methode om binnen 30-40 dagen enterische neuronen uit hPSC's te verkrijgen (Figuur 1E) en enterische glia die gliaal fibrillair zuur eiwit, GFAP en SOX10 tot expressie brengen in oudere culturen (> dag 55)13,14,19,22. Deze neuronen en glia worden geïnduceerd door stapsgewijze differentiatie van hPSC's in vagale en enterische neurale topcellen, gevolgd door enterische neuron- en glia-voorlopercellen13,14. De neurale topcellen brengen neurale topmarkers, transcriptiefactor AP-2 alfa en bèta, TFAP2A en TFAP2B, respectievelijk21 tot expressie. We hebben eerder aangetoond dat CD49 kan worden gebruikt als een marker om de efficiëntie van hPSC-afgeleide neurale topcellen aan te geven14. De efficiëntie en het succes van deze methode hangt af van een combinatie van factoren. Ten eerste is het van cruciaal belang om alle stappen onder steriele omstandigheden uit te voeren. Het testen van hPSC-culturen op mycoplasma-besmetting is belangrijk omdat het de groei van stamcellen nadelig kan beïnvloeden en visueel niet detecteerbaar is. Ten tweede vermindert het gebruik van gelijkmatig en goed gecoate platen de kans op fragmentarische hPSC-cultuurgroei en loslating van NC-culturen en oudere neuronen van het oppervlak van de putjes. Ten derde is het voor een hoge efficiëntie in differentiatie essentieel om te beginnen met pluripotente en volledig ongedifferentieerde hPSC-cellen. hPSC-kolonies moeten minimale differentiërende cellen hebben aan de grenzen van de kolonie. hPSC's moeten worden gepasseerd of geplateerd voor differentiatie wanneer kolonies groot zijn, of wanneer het midden van de kolonie dikker/donkerder van kleur begint te worden, zoals waargenomen door een fasecontrastmicroscoop. Ongewenste gedifferentieerde cellen (meestal mesenchymale cellen) verminderen niet alleen de algehele differentiatie-efficiëntie, maar ze kunnen ook leiden tot loslating van neuronen van het oppervlak van de put naarmate de culturen ouder worden. Het is daarom aan te raden om de ENC-culturen de eerste 15 dagen goed te monitoren. Onder efficiënte differentiatieomstandigheden verschijnen er donkere schijven op het oppervlak van de cultuur ~dag 6, wat wijst op efficiënte sferoïde vorming op dag 12-15. Bovendien moeten in de sferoïde fase (dag 12-15) vrij zwevende bollen gladde oppervlakken hebben (Figuur 1D). Het handhaven van de 3D-sferoïde fase op dag 12-15 is over het algemeen voldoende om de zuiverheid van ENC's te verbeteren voor de stroomafwaartse differentiatie van culturen in ENS-afstammingslijnen. Voor onderzoeken die vroege en zuivere populaties van ENC-voorlopercellen vereisen, wordt FACS met CD49D aanbevolen. CD49D is een specifieke oppervlaktemarker voor SOX10:hPSC-afgeleide NC-lijnen en is met succes gebruikt in cellijnen13,14. Voor meer informatie over het isoleren van CD49D+-cellen met behulp van FACS en aanbevelingen over gating-strategie verwijzen lezers naar het artikel van Barber et al, Figuur 2D, Kader 1 en Aanvullende Figuur 614. Ten vierde, om de efficiëntie te maximaliseren, moet differentiatie beginnen wanneer hPSC-culturen monolaag en ~80% confluent zijn. Dit betekent dat je op dag 2 een volledig confluente cultuur hebt. Een lagere confluentie heeft een negatieve invloed op de efficiëntie en zeer dichte culturen hebben de neiging om een hogere celdoodsnelheid te hebben en kunnen mogelijk leiden tot het ontstaan van ongewenste gedifferentieerde cellen.
Het opnieuw plateren van cellen op dag 15 markeert een belangrijke stap in dit protocol. Dit is de laatste celoverdrachtsstap voor een monolaagse neuronale cultuur en daarom moet de plaatlay-out worden gekozen op basis van de geplande tests. Het aantal cellen dat naar elk putje wordt overgebracht, kan een aanzienlijke invloed hebben op de neuronale diversiteit en oudere neuronen die aan het oppervlak van de putjes blijven vastzitten. Over het algemeen is een celdichtheid in het bereik van 250.000-350.000 cellen percm2 (ongeveer 75.000-100.000 cellen per put van een plaat met 96 putjes of 500.000-700.000 per put van een plaat met 24 putjes) wenselijk. Vanaf dag 30-40 zou men kunnen overwegen om fibronectine en laminine aan het voedingsmedium toe te voegen (niet meer dan één keer per week) om prospectief loslating van neuronen te voorkomen, vooral voor cellen die gepland zijn voor langere neuronculturen. Op dit punt wordt aanbevolen om de voedingsfrequentie te verminderen tot eens in de 5-7 dagen en wat medium in elk putje te laten voordat u extra vers medium toevoegt. Dit verkleint de kans dat er onnodige fysieke belasting wordt uitgeoefend op de neuronale projecties. Uitgaande van verdamping van het medium (vooral voor putjes in de rand van de plaat) kan men 75 μL verwijderen en 100 μL vers medium aan elk putje toevoegen. Op basis van ervaring hebben culturen die op polymeer dekglaasjes aan de onderkant worden gekweekt, de neiging om te leven en langer aan het oppervlak van de put vast te blijven zitten. Daarom wordt aanbevolen om de polymeer coverslip bottom imaging plates te overwegen voor experimenten die zeer oude neuronale culturen vereisen, zoals co-culturen met andere celtypen. Hoewel aan de lucht gedroogde PO/FN/laminin gecoate platen nog steeds een efficiënte differentiatie kunnen opleveren, is dit niet systematisch getest voor de toepassing van dit protocol. Daarom wordt het gebruik van vers gecoate platen aanbevolen.
Het hier beschreven protocol is gebaseerd op een eerder gepubliceerd protocol van Barber et al14. Vergeleken met oudere ENC-inductiemethoden die media gebruiken die serumvervangende factoren bevatten (bijv. KSR)13,14, zijn de huidige protocolmediacondities chemisch gedefinieerd. Dit is gunstig voor meer consistente differentiaties en maakt nauwkeurigere ontwikkelingsstudies mogelijk door de cultuuromstandigheden te manipuleren. Dit robuuste protocol genereert reproduceerbaar culturen van enterische neuronen uit onafhankelijke geïnduceerde en embryonale stamcellijnen die zijn getest, zoals H9, UCSF4 en WTC11. Een krachtig aspect van het gepresenteerde protocol is het vermogen om een verscheidenheid aan ENS-neuronale subtypes te genereren die lijken op die in het menselijke ENS. De expressie van specifieke markers voor verschillende ENS-neurochemische identiteiten kan bijvoorbeeld worden gecontroleerd door middel van flowcytometrie en fluorescentiebeeldvorming (Figuur 1F,G). Het typische bereik van hPSC-afgeleide enterische neuronale populaties die positief zijn voor stikstofmonoxidesynthase 1 (NOS1) is 5%-20%; choline O-acetyltransferase (CHAT) is 40%-60%; gamma-aminoboterzuur (GABA) is 15%-30% en serotonine (5-HT) is 15%-30%. De mate waarin de in vitro structurele en functionele connectiviteit tussen deze subtypes de in vivo cellulaire netwerken nauwkeurig modelleert, vereist echter verder onderzoek. Bovendien zouden analyses van afzonderlijke cellen om de transcriptionele profilering van individuele subtypes uit te breiden, niet alleen helpen om de in vivo en in vitro cellulaire identiteiten beter te vergelijken, maar zouden ze ook ten goede komen aan ontwikkelings- en moleculaire studies, evenals aan toekomstige protocoloptimalisaties om specifieke subtypes te verrijken voor het ontdekken van geneesmiddelen en regeneratieve geneeskunde.
Ondanks de culturen die verschillende neuronale en in oudere culturen gliacellen bevatten, genereert dit protocol niet de andere celtypen die van nature in de in vivo niche van het ENS voorkomen, zoals spiercellen, epitheelcellen en immuuncellen. Het bestuderen van de ENS-interactie met deze celtypen in de context van gezondheid en ziekte vereist investeringen in het optimaliseren van co-cultuur en darmorganoïdensystemen. Over het algemeen wordt hier een krachtige methode beschreven om verschillende subtypes van het ENS in te genereren uit hPSC's in vitro . De schaalbare culturen zijn geschikt voor ontwikkelingsstudies van het menselijke ENS, toxicologische tests en ziektemodelleringsexperimenten gericht op het ontwikkelen van medicamenteuze therapieën en het leveren van transplanteerbare cellen voor de behandeling van enterische neuropathieën.

Het enterische zenuwstelsel (ENS) is het grootste onderdeel van het perifere zenuwstelsel. Het ENS bevat meer dan 400 miljoen neuronen die zich in het maagdarmkanaal bevinden en bijna alle functies van de darm controleren. Moleculair begrip van de ontwikkeling en functie van het ENS en de defecten ervan bij enterische neuropathieën vereist toegang tot een betrouwbare en authentieke bron van enterische neuronen. De toegang tot menselijk primair weefsel is beperkt en diermodellen slagen er niet in om de belangrijkste ziektefenotypes in veel enterische neuropathieën te recapituleren. Menselijke pluripotente stamceltechnologie (hPSC) is buitengewoon nuttig gebleken bij het bieden van een onbeperkte bron van gewenste celtypen, vooral die welke moeilijk te isoleren zijn van primaire bronnen 2,3,4,5,6,7. Hier geven we details over een stapsgewijze en robuuste in vitro methode om ENS-culturen uit hPSC's te verkrijgen. Deze schaalbare hPSC-afgeleide culturen openen wegen voor ontwikkelingsstudies, ziektemodellering en high-throughput medicijnscreening en kunnen transplanteerbare cellen leveren voor regeneratieve geneeskunde.
Enterische neuronlijnen zijn afgeleid van neurale topcellen (NC) die het ENS-ontwikkelingspad volgen tijdens de embryogenese. In embryo's verschijnen NC-cellen langs de randen van de vouwende neurale plaat. Ze vermenigvuldigen, migreren en geven aanleiding tot veel verschillende celtypen, waaronder sensorische neuronen, Schwann-cellen, melanocyten, craniofaciale skelet- en darmneuronen en glia 8,9,10. De beslissing over het lot van de cel hangt af van het specifieke gebied langs de voorste-achterste as waaruit de NC-cellen tevoorschijn komen, d.w.z. craniale NC, vagale NC, romp NC en sacrale NC. Het ENS ontwikkelt zich uit vagale en sacrale NC-cellen, waarbij de eerste de populatie van de darmneuronen domineert als gevolg van de uitgebreide migratie langs de lengte van de darm en het koloniseren van de darm11.
Afleiding van NC-cellen uit PSC's omvat gewoonlijk een combinatie van dubbele SMAD-remming en activering van de WNT-route12,13. Tot voor kort betroffen alle NC-inductieprotocollen serum- en andere additieven van dierlijke producten in de kweekomstandigheden. Chemisch ongedefinieerde media verlagen niet alleen de reproduceerbaarheid van NC-inductie, maar dagen ook mechanistische ontwikkelingsstudies uit. Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, ontwikkelden Barber et al14 een NC-inductieprotocol met behulp van chemisch gedefinieerde kweekomstandigheden en was daarom voordelig ten opzichte van alternatieve methoden die afhankelijk zijn van serumvervangende factoren (bijv. KSR)13,14. Dit werd verkregen door basale mediavervangingen en het optimaliseren van een protocol dat oorspronkelijk werd gepresenteerd door Fattahi et al. om enterische NC-cellen af te leiden uit hPSC's. Dit verbeterde systeem is de basis van het hPSC-differentiatieprotocol dat hier wordt gepresenteerd. Het begint met inductie van enterische neurale crest (ENC)-cellen in een periode van 15 dagen door nauwkeurige modulatie van BMP-, FGF-, WNT- en TGFβ-signalering naast retinoïnezuur (RA). Vervolgens leiden we de ENS-lijnen af door cellen te behandelen met gliacellijn-afgeleide neurotrofe factor (GDNF). Alle mediasamenstellingen zijn chemisch gedefinieerd en leveren binnen 30-40 dagen robuuste enterische neuronale culturen op.
Naast het hier beschreven monolayer celkweeksysteem zijn er alternatieve NC-inductiebenaderingen ontwikkeld die gebruik maken van vrij zwevende embryoïde lichamen 15,16. Van migrerende cellen in deze culturen is aangetoond dat ze NC-markers tot expressie brengen met een subset die de vagale NC vertegenwoordigt. Co-culturen met primair darmweefsel zijn gebruikt om enterische NC-voorlopers in deze culturen te verrijken. Mediasamenstellingen in deze onderzoeken bevatten een combinatie van verschillende factoren, zoals zenuwgroeifactor, NT3 en van de hersenen afgeleide neurotrofe factor. In dit stadium is het niet volledig duidelijk hoe deze factoren de bindingsidentiteiten van de voorlopers van enterische neuronen kunnen beïnvloeden. Voor een efficiënte vergelijking van de enterische NC-inductie in de monolaag en de embryoïde-lichaam-gebaseerde culturen zijn meer gegevens nodig. Gezien de verschillende cultuurlay-outs in deze strategieën, moet het gebruik van elke methode worden overwogen en geoptimaliseerd op basis van de specifieke toepassing in gedachten.
Het hier gepresenteerde protocol is reproduceerbaar en is door ons en anderen met succes getest met behulp van verschillende hPSC-lijnen (geïnduceerd en embryonaal) 8,14,16.

<table><tbody><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement (serum free, minus vitamin A)</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Basement membrane matrix, Geltrex</td><td>Gibco</td><td>A14133-2</td><td></td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R&amp;D systems</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture centrifuge</td><td>Eppendorf, model no. 5810R</td><td>02262501</td><td></td></tr><tr><td>Cell detachment solution, Accutase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>07920</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>Conical tubes</td><td>USA scientific</td><td>1475-0511, 1500-1211</td><td></td></tr><tr><td>Differentiation base medium, Essential 6</td><td>Life Technologies</td><td>A1516401</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 no glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>21331020</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>MT-46034CI</td><td></td></tr><tr><td>Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium Kit</td><td>Life Technologies</td><td>A2858501</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>R&amp;D systems</td><td>233-FB/CF</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Corning</td><td>356008</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>1475</td><td></td></tr><tr><td>Human pluripotent stem cells, H9 ESC</td><td>WiCell</td><td>RRID: CVCL_1240</td><td></td></tr><tr><td>Incubator with controlled humidity, temperature and CO2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Herralcell 150i</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EVOS FL</td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow hood</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1300 series class II, type A2</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Cultrex</td><td>3400-010</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine supplement, Glutagro</td><td>Corning</td><td>25-015-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAAs</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell plates, Falcon</td><td>BD</td><td>353934, 353075</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement</td><td>CTS</td><td>A1370701</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Ca and Mg free)</td><td>Life Technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pipette filler</td><td>Eppendorf</td><td>Z768715-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips</td><td>USA scientific</td><td>1111-2830</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11E, 13-678-11F</td><td></td></tr><tr><td>PO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>polymer coverslip bottom imaging plates, ibidi</td><td>ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>RA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>R&amp;D systems</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue stain, 0.4%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-low attachment plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-601</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride</td><td>R&amp;D systems</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

differentiatie van afstammingslijnen van het enterische zenuwstelsel van menselijke pluripotente stamcellen

Differentiation of Enteric Nervous System Lineages from Human Pluripotent Stem Cells

Het menselijk enterisch zenuwstelsel, ENS, is een groot netwerk van glia- en neuronale celtypen met een opmerkelijke diversiteit aan neurotransmitters. Het ENS regelt de darmmotiliteit, enzymsecretie en opname van voedingsstoffen en interageert met het immuunsysteem en het darmmicrobioom. Bijgevolg zijn ontwikkelings- en verworven defecten van het ENS verantwoordelijk voor veel ziekten bij de mens en kunnen ze bijdragen aan de symptomen van de ziekte van Parkinson. Beperkingen in diermodelsystemen en toegang tot primair weefsel vormen aanzienlijke experimentele uitdagingen bij studies van het menselijke ENS. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor effectieve in vitro afleiding van de ENS-lijnen uit menselijke pluripotente stamcellen, hPSC, met behulp van gedefinieerde kweekomstandigheden. Ons protocol begint met gerichte differentiatie van hPSC's naar enterische neurale topcellen binnen 15 dagen en levert binnen 30 dagen diverse subtypes van functionele enterische neuronen op. Dit platform biedt een schaalbare bron voor ontwikkelingsstudies, ziektemodellering, het ontdekken van geneesmiddelen en regeneratieve toepassingen.

Dit protocol biedt een methode om enterische neurale kam en enterische neuronen af te leiden uit hPSC's met behulp van chemisch gedefinieerde kweekomstandigheden (Figuur 1A-B). Het genereren van neuronen van hoge kwaliteit is afhankelijk van een efficiënte inductiestap voor de enterische neurale top. Dit kan visueel worden beoordeeld door de morfologie van de vrij zwevende bollen te controleren die er rond uit moeten zien met gladde oppervlakken met een grootte van ongeveer 0,1 - 0,4 mm, zoals te zien is in figuur 1C. Deze sferoïden moeten ook de neurale topmarker SRY-Box transcriptiefactor 10 (SOX10)17,18 tot expressie brengen, zoals te zien is in figuur 1D. Tijdens de inductiefase van enterische neuronen kunnen neurieten al op dag 25-30 zichtbaar worden (Figuur 1E). Dit kan echter worden vertraagd in differentiaties met een lagere efficiëntie die ongewenste mesenchymale celcontaminaties bevatten. Het menselijk enterisch zenuwstelsel is een verzameling van diverse neuronen die verschillende neurotransmitters tot expressie brengen. Deze heterogeniteit wordt gerecapituleerd in het meegeleverde in-vitroprotocol en de expressie van belangrijke markers kan worden beoordeeld door middel van celkleuringsmethoden zoals immunofluorescentiebeeldvorming en flowcytometrie volgens eerder beschreven protocollen 13,14,19,20,21 (Figuur 1F,G).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66133/66133fig01v2.jpg"> Figuur 1: Afleiding van menselijke ENC-cellen en subtypes van enterische neuronen uit hPSC's. (A) Enterische neurale top (ENC) inductie uit hPSC. Protocol (dag 0-12) met mediasamenstellingen voor het afleiden van ENC-cellen uit hPSC's. (B) ENC-sferoïde vorming en darmneuroneninductie volgens ENC. Protocol (dag 12-15) met gemiddelde samenstelling voor ENC-sferoïde vorming. Daarna worden darmneuronen gegenereerd en gerijpt door behandeling met een medium dat GDNF en AA bevat. (C) Representatieve fasecontrastbeelden van differentiërende hPSC's op verschillende tijdstippen van het protocol. Schaalbalk: 1000 μM. (D) SOX10::GFP die H9 iPSC-afgeleide ENC-sferoïden tot expressie brengt op dag 14. Schaalbalk: 1000 μm. (E) Fasecontractbeeld van dag 33 neuronen. Schaalbalk: 400 μm. (F-G) Immunofluorescentiebeeldvorming (F) en flowcytometrie (G) van neurotransmittermarkers in dag 40 neuronen. Schaal balk: 50 μm. Afkortingen: BMP4 = recombinant humaan BMP4-eiwit; RA = retinoïnezuur; FGF2 = recombinant humaan FGF basisch; GDNF = recombinante humane gliacellijn-afgeleide neurotrofe factor; AA = ascorbinezuur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66133/66133fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Het afleiden van afstammingslijnen van het enterische zenuwstelsel (ENS) uit menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) biedt een schaalbare bron van cellen om de ontwikkeling en ziekte van ENS te bestuderen en om te gebruiken in regeneratieve geneeskunde. Hier wordt een gedetailleerd in vitro protocol gepresenteerd om enterische neuronen af te leiden uit hPSC's met behulp van chemisch gedefinieerde kweekomstandigheden.

Differentiatie van afstammingslijnen van het enterische zenuwstelsel van menselijke pluripotente stamcellen

The human enteric nervous system, ENS, is a large network of glial and neuronal cell types with remarkable neurotransmitter diversity. The ENS controls ...

Hier bieden we een methode voor het genereren van menselijke enterische neuronen uit menselijke pluripotente stamcellen onder volledig gedefinieerde omstandigheden, en we gebruiken deze cellen om de ontwikkeling en functie van het menselijk enterisch zenuwstelsel te begrijpen. Dus ik denk dat de ontwikkeling, fysiologie en pathofysiologie van het menselijk enterisch zenuwstelsel een grote uitdaging is geweest, en dat komt door de zeldzaamheid van de cellen van het enterische zenuwstelsel en de voorbijgaande aard van de voorlopers van de neurale top, en de moeilijkheid om toegang te krijgen tot weefsel en isolatie van het weefsel. Dit is een robuust platform voor het genereren van authentieke en functionele menselijke darmneuronen uit HPSC's, en door langdurige technische uitdagingen op het gebied van weefseltoegang te overwinnen, biedt het schaalbare culturen van componenten van het enterische zenuwstelsel voor ziektemodellering, het ontdekken van geneesmiddelen en het bestuderen van ENS-ontwikkelingen en -functie.

differentiation-enteric-nervous-system-lineages-from-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We hebben een protocol voor de inductie van neuroblasts rechtstreeks van pluripotente menselijke embryonale stamcellen gehouden onder bepaalde voorwaarden met kleine moleculen, die afleiding van een groot aanbod van menselijke neurale voorouders en neuronale celtypes in het ontwikkelen van CNS voor neurale reparatie mogelijk maakt.

Efficiënte Afleiding van de Mens Neuronale voorouders en neuronen van pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

Protocollen voor neuronale differentiatie van pluripotente menselijke stamcellen (hPSCs) vaak tijdrovend en vereisen grote celkweek vaardigheden. Hier hebben we een kleine molecule aangepast gebaseerde differentiatie procedure een multititre plaat formaat, zodat eenvoudige, snelle en efficiënte productie van humane neuronen in een gecontroleerde manier.

Snelle en efficiënte generatie van de neuronen van menselijke pluripotente stamcellen in een Multititre Plate Format

This video demonstrates the generation of neural progenitor cells from non-transgenic and transgenic human pluripotent stem cells (hPSCs). hPSCs are differentiated into neural progenitor cells using a neuronal differentiation medium. While differentiation is induced in non-transgenic cells using small molecules, the transgenic hPSCs are differentiated by adding an antibiotic that induces the promoter for a neuronal differentiation-specific transcription factor.

Differentiating Non-Transgenic and Transgenic Human Pluripotent Stem Cells into Neural Progenitor Cells

Deze procedure levert telencephalic neuronen door door checkpoints die vergelijkbaar zijn met die waargenomen in menselijke ontwikkeling. De cellen mogen spontaan differentiëren blootgesteld aan risicofactoren te duwen naar de neurale stam, geïsoleerd en uitgeplaat op dekglaasjes om voor terminale differentiatie en maturatie.

De Specificatie van Telencephalic glutamaat neuronen van menselijke pluripotente stamcellen

Neurale lijst (NC) cellen afkomstig van menselijke pluripotente stamcellen (HPSC) hebben een groot potentieel voor het modelleren van de menselijke ontwikkeling en ziekte en voor celvervangingstherapieën. Hier, een voedingsvrije aanpassing van de momenteel...

Voedingsvrije Afleiding van neurale stamcellen uit humane pluripotente stamcellen

Wij hebben, op basis van kennis uit de ontwikkelingsbiologie en gepubliceerd onderzoek, een geoptimaliseerd protocol ontwikkeld om efficiënt A9 middenhersen-dopaminerge neuronen te genereren uit zowel menselijke embryonale stamcellen als menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen, wat nuttig zou zijn voor ziektemodellering en celvervangende therapie voor de ziekte van Parkinson.

Geregisseerd Dopaminerge Neuron Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen

Hier beschrijven we de isolatie van darmen-gliale cellen uit de intestinale submucosa-sequentiële EDTA incubations met divalente kationen en vervolgens incubatie in de oplossing van de gegevensterugwinning van de niet-enzymatische cel chelaat. De resulterende celsuspensie op poly-D-lysine en laminin plating resulteert in een sterk verrijkt cultuur van submucosal gliacellen voor functionele analyse.

Isolatie van darmen gliale cellen uit de Submucosa en de Lamina Propria van de volwassen muis

Hier gepresenteerd is een protocol voor het genereren van een eencellige cultuur van menselijke embryonale stamcellen en hun daaropvolgende differentiatie in neurale voorlopercellen. Het protocol is eenvoudig, robuust, schaalbaar en geschikt voor geneesmiddelen screening en toepassingen voor regeneratieve geneeskunde.

Efficiënte Neurale differentiatie met behulp van eencellige cultuur van menselijke embryonale stamcellen

In dit protocol beschrijven we een stabiele, zeer efficiënte differentiatiestrategie voor het genereren van postganglionische sympathische neuronen uit menselijke pluripotente stamcellen. Dit model zal neuronen beschikbaar stellen voor het gebruik van studies van meerdere autonome aandoeningen.

Efficiënte differentiatie van postganglionic Sympathische neuronen met behulp van menselijke pluripotente stamcellen onder Feeder-vrije en chemisch gedefinieerde cultuurvoorwaarden

Hier worden gedetailleerde methoden beschreven voor het genereren, onderhouden en karakteriseren van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide dunne darm- en colonorganoïden. Deze methoden zijn ontworpen om de reproduceerbaarheid te verbeteren, de schaalbaarheid uit te breiden en de werktijd te verkorten die nodig is voor het plateren en passeren van organoïden.

Generatie, onderhoud en karakterisering van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide darm- en colonorganoïden

Menselijke darmorganoïden moeten worden geïnnerveerd om de structuur en functie van de inheemse menselijke darm beter samen te vatten. Hier presenteren we een methode om een enterisch zenuwstelsel in deze constructies op te nemen.

Innervatie van menselijke darmorganoïden

Leer hoe je functionele humane enterische neuronen genereert van pluripotente stamcellen via neurale lijstinductie. Dit robuuste platform ondersteunt ziekte-modellering en onderzoek naar het enterische zenuwstelsel.

Differentiatie van afstammingslijnen van het enterische zenuwstelsel van menselijke pluripotente stamcellen

Meer video's verkennen