Name: Inductie van acute ischemische beroerte bij muizen met behulp van de distale occlusietechniek van de middelste slagader (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-15T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Leer de distale middelste slagaderocclusiemethode met transcraniële elektrocoagulatie bij C57BL/6J muizen. Dit protocol evalueert neurologisch gedrag en histopathologische kenmerken voor betrouwbaar beroerteonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door de subsidies van de Nature Science Foundation van de provincie Hubei (2022CFC057).

Het experimentele protocol werd goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Jianghan University en werd uitgevoerd in overeenstemming met de ethische richtlijnen voor experimentele dieren die zijn uitgegeven door het Center for Disease Control of China. Volwassen mannelijke C57BL/6J-muizen, 10 weken oud, met een gewicht van 24-26 g, werden in dit protocol gebruikt. Alle muizen werden gehuisvest in een 12-uurs licht/donker-cyclus gecontroleerde omgeving met voedsel en water ad libitum.
1. Preoperatieve voorbereiding
OPMERKING: De belangrijkste instrumenten en apparatuur die nodig zijn voor dit protocol worden weergegeven in afbeelding 1.
<ol><li>Steriliseer de chirurgische instrumenten voorafgaand aan de procedure door middel van autoclaveren.</li>
	<li>Dien meloxicam subcutaan toe in een dosis van 5 mg/kg voor analgesie 60 minuten voor de operatie.</li>
	<li>Verdoof de muis met 5% isofluraan in een inductiekamer.</li>
	<li>Veeg de verwarmingsoperatieplank af met 75% ethanol en activeer de verwarmingsschakelaar met de temperatuur ingesteld op 37 °C. Plaats de muis vervolgens in een linker zijwaartse positie op het bord, met het hoofd weg van de chirurg en de staart naar de chirurg gericht.</li>
	<li>Bevestig een masker aan het gezicht van de muis dat zorgt voor een constante toevoer van 2% isofluraan en 0,3 l/min zuurstof voor onderhoudsanesthesie. Breng de oogzalf aan op het hoornvlies om het te beschermen tegen uitdroging tijdens de procedure.</li>
	<li>Scheer de vacht van de linker oogkas tot de linker gehoorgang met een scheerapparaat. Gebruik ontharingscrèmes om de resterende vacht te verwijderen voor sterilisatie.</li>
	<li>Bereid het operatiegebied voor door driemaal povidon-jodiumdesinfectiemiddel en 75% ethanol aan te brengen.</li>
</ol>2. Distaal MCAO-model
<ol><li>Controleer of de muis diep verdoofd is door de reflexen van de teenknijp te beoordelen.</li>
	<li>Maak een verticale incisie tussen de linker oogkas en de linker gehoorgang met behulp van een steriel scalpelmesje.</li>
	<li>Trek het zachte weefsel van de huid terug met retractors en leg de temporale spier bloot.</li>
	<li>Gebruik een rechte micropincet om de apicale en dorsale segmenten van de temporale spier van de schedel te scheiden.</li>
	<li>Identificeer de bifurcatie van de MCA, die een "Y"-vorm aanneemt onder het slaapbeen met een voorkeur naar de basis van de schedel (Figuur 2A). OPMERKING: Als de bifurcatie van MCA niet visueel waarneembaar is (als gevolg van een anatomisch normale variatie), bepaal dan het meest rostrale vat.</li>
	<li>Gebruik een elektrische schedelboor om de schedel uit te dunnen om een botvenster (4 mm in diameter) te maken totdat de dura mater, met zijn doorschijnende textuur, zichtbaar wordt. OPMERKING: Voeg met tussenpozen druppels normale zoutoplossing toe aan de schedel om oververhitting tijdens dit proces te voorkomen.</li>
	<li>Verwijder de dura mater boven de slagader met een gebogen micropincet om de MCA-tak bloot te leggen.</li>
	<li>Stel de elektrocauterisatie in op 7 W. Coaguleer de slagader met behulp van de elektrische stollingstang op de plaatsen proximaal en distaal van de bifurcatie van MCA (Figuur 2A). Wanneer de bifurcatie niet zichtbaar is als gevolg van een anatomische variatie, voer dan de coagulatie uit op de nauwkeurig geïdentificeerde MCA-tak (zoals hierboven vermeld) op twee afzonderlijke locaties met een onderlinge afstand van ongeveer1 mm 13.</li>
	<li>Bewaak de bloedstroom van de linker MCA-corticale tak met behulp van een laserspikkelbloedstroommeter. OPMERKING: Muizen die na elektrocoagulatie een vermindering van de bloedstroom vertoonden van minder dan 40% van de uitgangswaarde, werden uitgesloten van het onderzoek.</li>
	<li>Hecht de spier en de huid afzonderlijk met behulp van 5-0 polyglycolzuurhechtingen. Breng diclofenac-natriumgel en mupirocinezalf aan op de huidincisie met behulp van een steriel wattenstaafje.</li>
	<li>Plaats de muis in een verkoeverkamer. Houd alle muizen in de gaten totdat ze volledig wakker zijn. Geef meloxicam (5 mg/kg, SC) voor analgesie elke 24 uur tot 72 uur.</li>
</ol>3. Schijnoperatie
<ol><li>Reproduceer dezelfde procedure als de hierboven genoemde, met uitzondering van het proces van arteriële coagulatie.</li>
</ol>4. Gedragstesten
OPMERKING: Voorafgaand aan de dMCAO ondergingen de muizen gedurende 3 dagen tweemaal daags gedragstraining. Verplaats de muizen op de3e dag na dMCAO naar de gedragstestruimte voor een aanpassing van 2 uur aan de omgeving voordat u gaat testen.
<ol><li>Grijpkracht test14 NOTITIE: De grijpkrachtmeter bestaat uit een push-pull rekstrook en een metalen horizontale stang.<ol><li>Pak de basis van de muisstaart vast. Laat de muis geleidelijk zakken in de richting van de metalen greepstang totdat deze de horizontale balk met beide voorpoten vastpakt (Figuur 2B).</li>
		<li>Trek de muis met een constante snelheid van ongeveer 2 cm/s naar achteren en houd de behuizing horizontaal.</li>
		<li>Noteer de piekkracht in gram (g) wanneer de muis zijn voorpoten van de stang loslaat.</li>
	</ol></li>
	<li>Pole test15<ol><li>Plaats de muis op de bovenkant van een verticale houten paal (50 cm hoog, 1 cm in diameter) met het hoofd naar boven gericht, en laat hem langs de paal naar beneden klimmen (Figuur 2B).</li>
		<li>Noteer de tijd die de muis nodig heeft om zich om te draaien (T-bocht) en de totale tijd om langs de paal naar beneden te klimmen (T-totaal) met een cut-off tijd van 60 seconden.</li>
	</ol></li>
	<li>Test voor het verwijderen van plakband16<ol><li>Houd de muis vast en bevestig een stukje plakband (2 × 2 mm) aan de rechtervoorpoot van de muis (Figuur 2B).</li>
		<li>Plaats de muis terug in de opfokkooi en laat hem vrij bewegen.</li>
		<li>Noteer de tijd die de muis nodig heeft om lijm te verwijderen met een limiet van 60 s.</li>
	</ol></li>
	<li>Cilinder test17<ol><li>Plaats de muis in een doorzichtige glazen cilinder met open bovenkant (diameter: 14 cm; hoogte: 20 cm) en registreer zijn spontane staande verkennende gedrag gedurende 3 minuten met behulp van een camera (Figuur 2B). OPMERKING: Tijdens de experimentele procedure werden twee spiegels naast de cilinder geplaatst om een optimale registratie van de bewegingen van de voorpoten te garanderen.</li>
		<li>Veeg de cilinder af met 75% ethanol om resterende olfactorische signalen te verwijderen voordat u de volgende muis test.</li>
		<li>Verlaag de afspeelsnelheid van de video tot 1/5 van de werkelijke snelheid en tel het aantal muuraanrakingen met de linker (L) of rechter voorpoot (R) of gelijktijdig gebruik van beide voorpoten (B). Bereken het gebruikspercentage van de rechtervoorpoot als (L-R)/(L + R + B) × 100%.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Perfusie en monstervoorbereiding
<ol><li>Euthanaseer de muis door peritoneale injectie overdosis pentobarbital (300 mg/kg). Plaats de muis op zijn rug en immobiliseer de ledematen.</li>
	<li>Maak een incisie in de middellijn op de huid, beginnend bij het midden van de buikholte en zich uitstrekkend naar de bovenkant van de borst.</li>
	<li>Open de borstkas met een chirurgische schaar en vouw de xiphoid naar boven met behulp van een hemostaat. Verwijder voorzichtig de long en het middenrif om het hart bloot te leggen.</li>
	<li>Steek de punt van de perfusienaald in de linkerventrikel en prik met een schaar in het rechteratrium. Doordrenk het hart met 20 ml normale zoutoplossing via de linker hartkamer.</li>
	<li>Onthoofd de muis en snijd de hoofdhuid open langs de middellijn tussen de ogen. Snijd het bot langs beide kanten door, beginnend bij de schedelbasis en open naar de oogkas.</li>
	<li>Til het calvarium op en maak de hersenen voorzichtig los van de schedelbasis met behulp van een pincet. OPMERKING: Hersenen van de helft van de muizen werden onderworpen aan 2,3,5-trifenyltetrazoliumchloride (TTC) kleuring, terwijl hersenen van de andere helft histologisch onderzoek ondergingen.</li>
	<li>Week de hersenen een nacht in 4% paraformaldehyde-oplossing voor follow-up histologische analyse.</li>
</ol>6. Identificatie van het infarctvolume
<ol><li>Plaats de hersenen in een vriesvak van -20 °C van de koelkast gedurende 20 min.</li>
	<li>Plaats de hersenen in de hersenmatrix van 1 mm en snijd de hersenen in kransslagaders met een dikte van 2 mm met behulp van microtoombladen.</li>
	<li>Breng de hersensecties over naar een kweekplaat met 24 putjes en voeg 2% TTC toe om het hersenweefsel te bedekken. Zet de kweekplaat met 24 putjes 30 minuten in een oven met constante temperatuur en een temperatuur ingesteld op 37 °C.</li>
	<li>Til de hersensecties voorzichtig op en fixeer ze gedurende 15 minuten in 4% paraformaldehyde-oplossing.</li>
	<li>Voer optische scans uit van deze hersensecties met een resolutie van 1200 x 1200 dpi door een scanist.</li>
	<li>Meet het volume van het herseninfarct door het infarctgebied van elke sectie op te tellen (oppervlakte van de rechterhersenhelft minus het niet-beschadigde gebied van de linkerhersenhelft) met behulp van Image J-software (https://imagej.net/software/imagej/index)18. Bereken het infarctvolumepercentage als infarct volume/volume van de rechterhersenhelft × 100%.</li>
</ol>7. Histopathologische en immunofluorescerende kleuringsanalyse
<ol><li>Neem de hersenmonsters van de paraformaldehyde-oplossing en spoel ze gedurende 1 uur met stromend water.</li>
	<li>Breng de hersenmonsters over in de geautomatiseerde weefsel-dehydratatiemachine. Start het vooraf ingestelde programma voor uitdroging, vitrificatie en wasonderdompeling. Sluit de gedehydrateerde hersenmonsters in paraffine in en snijd ze met een microtoom in stukken van 5 μm dik.</li>
	<li>Hematoxyline en eosine (H&E) kleuring<ol><li>Dewax de secties met xyleen 3 keer gedurende 8 minuten elk.</li>
		<li>Rehydrateer de secties door ze achtereenvolgens gedurende 5 minuten onder te dompelen in gradiënt ethanol (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) en gedestilleerd water.</li>
		<li>Kleuring van de secties met de hematoxyline-oplossing gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Spoel de secties af met gedestilleerd water om het restant hematoxyline te wassen en dompel ze vervolgens in 5% zoutzuuralcohol voor een differentiatie van 5 seconden. Was de secties met gedestilleerd water gedurende 2 minuten.</li>
		<li>Kleur de secties gedurende 30 s met eosine-oplossing en spoel overtollige kleurvloeistof af met gedestilleerd water.</li>
		<li>Dompel de secties onder in 90% ethanol, 95% ethanol, 100% ethanol en xyleen (2 keer) achtereenvolgens gedurende 5 minuten per keer. Monteer de secties met een neutraal balsem montagemedium.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunofluorescentie kleuring<ol><li>Ontwax de secties met xyleen 3 keer gedurende 8 minuten per keer.</li>
		<li>Rehydrateer de secties door ze achtereenvolgens gedurende 5 minuten onder te dompelen in gradiënt ethanol (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) en gedestilleerd water.</li>
		<li>Verwarm de citraat-antigeenextractie-oplossing voor om in de magnetron te koken. Dompel de secties onder in de oplossing voor het ophalen van antigeen. Verwarm de buffer voor het ophalen van antigeen met laag vermogen (20 W) gedurende 20 minuten opnieuw.</li>
		<li>Zet de magnetron uit en laat de buffer voor het ophalen van antigeen afkoelen tot kamertemperatuur (RT).</li>
		<li>Was de secties driemaal met 0,1 mM fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 5 minuten per keer.</li>
		<li>Incubeer de secties met een blokkerende oplossing (5% runderserumalbumine) bij RT gedurende 1 uur om de niet-specifieke binding van immunoglobuline te blokkeren.</li>
		<li>Incubeer de coupes met konijn anti-NeuN antilichaam (1: 300), konijn anti-Iba-1 antilichaam (1: 500) en muis anti-GFAP antilichaam (1: 500) bij 4°C 's nachts.</li>
		<li>Was de secties driemaal met 0,1 mM PBS gedurende 5 minuten per keer.</li>
		<li>Incubeer de secties met geit anti-konijn Alexa 594-geconjugeerd IgG (1:500) of geit anti-muis Alexa 488-geconjugeerd IgG (1:500) gedurende 1 uur bij RT.</li>
		<li>Was de secties met 0,1 mM PBS en monteer ze met een antifade montagemedia die 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) bevatten.</li>
		<li>Maak foto's van drie microscopische velden (300 μm × 300 μm) in de ischemische halfschaduw met behulp van een fluorescerende microscoop bij respectievelijk 594 nm en 488 nm.</li>
		<li>Met behulp van de ImageJ-software (https://imagej.net/software/imagej/index) schat u de positief gekleurde celdichtheid door het gemiddelde te nemen van het aantal in ischemische penumbra19.</li>
	</ol></li>
</ol>

Occlusie van de distale middelste slagader om een muismodel met ischemische beroerte te ontwikkelen

<ol><li>Patel, P., Yavagal, D., Khandelwal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperacute+management+of+ischemic+strokes%3A+JACC+Focus+Seminar%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Hyperacute management of ischemic strokes: JACC Focus Seminar.</a> J Am Coll Cardiol. 75 (15), 1844-1856 (2020).</li>
<li>GBD 2016 Stroke Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+burden+of+stroke%2C+1990-2016%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+study+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national burden of stroke, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease study 2016.</a> Lancet Neurol. 18 (5), 439-458 (2019).</li>
<li>Joo, H., Wang, G., George, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+literature+review+of+cost-effectiveness+of+intravenous+recombinant+tissue+plasminogen+activator+for+treating+acute+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke+Vasc+Neurol%22%5BJournal%5D)">A literature review of cost-effectiveness of intravenous recombinant tissue plasminogen activator for treating acute ischemic stroke.</a> Stroke Vasc Neurol. 2 (2), 73-83 (2017).</li>
<li>Jones, A. T., O'Connell, N. K., David, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+functional+stroke+mimic+patients%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurol%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of functional stroke mimic patients: a systematic review and meta-analysis.</a> Eur J Neurol. 27 (1), 18-26 (2020).</li>
<li>Tamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+cerebral+ischaemia+in+the+rat%3A+Description+of+technique+and+early+neuropathological+consequences+following+middle+cerebral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Focal cerebral ischaemia in the rat: Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 1 (1), 53-60 (1981).</li>
<li>Kuraoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+experimental+occlusion+of+the+distal+middle+cerebral+artery+induces+high+reproducibility+of+brain+ischemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Anim%22%5BJournal%5D)">Direct experimental occlusion of the distal middle cerebral artery induces high reproducibility of brain ischemia in mice.</a> Exp Anim. 58 (1), 19-29 (2009).</li>
<li>Orset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+in+situ+thromboembolic+stroke+and+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion.</a> Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).</li>
<li>Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+ischemic+stroke+and+their+application+in+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Des+Devel+Ther%22%5BJournal%5D)">Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research.</a> Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).</li>
<li>Candelario-Jalil, E., Paul, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+aging+and+comorbidities+on+ischemic+stroke+outcomes+in+preclinical+animal+models%3A+A+translational+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Impact of aging and comorbidities on ischemic stroke outcomes in preclinical animal models: A translational perspective.</a> J Exp Neurol. 335, 113494(2021).</li>
<li>Zuo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+secondary+damage+and+A%CE%B2+deposits+in+the+ipsilateral+thalamus+of+dMCAO+rats+through+reduction+of+cathepsin+B+by+bis%28propyl%29-cognitin%2C+a+multifunctional+dimer%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Attenuation of secondary damage and Aβ deposits in the ipsilateral thalamus of dMCAO rats through reduction of cathepsin B by bis(propyl)-cognitin, a multifunctional dimer.</a> Neuropharmacology. 162, 107786(2020).</li>
<li>Shabani, Z., Farhoudi, M., Rahbarghazi, R., Karimipour, M., Mehrad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular%2C+histological%2C+and+behavioral+pathological+alterations+associated+with+the+mouse+model+of+photothrombotic+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Cellular, histological, and behavioral pathological alterations associated with the mouse model of photothrombotic ischemic stroke.</a> J Chem Neuroanat. 130, 102261(2023).</li>
<li>Caleo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rehabilitation+and+plasticity+following+stroke%3A+Insights+from+rodent+models%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rehabilitation and plasticity following stroke: Insights from rodent models.</a> Neuroscience. 311, 180-194 (2015).</li>
<li>Llovera, G., Roth, S., Plesnila, N., Veltkamp, R., Liesz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+stroke+in+mice%3A+permanent+coagulation+of+the+distal+middle+cerebral+artery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Modeling stroke in mice: permanent coagulation of the distal middle cerebral artery.</a> J Vis Exp. (89), e51729(2014).</li>
<li>Lavayen, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotection+by+the+cannabidiol+aminoquinone+VCE-004.8+in+experimental+ischemic+stroke+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Neuroprotection by the cannabidiol aminoquinone VCE-004.8 in experimental ischemic stroke in mice.</a> Neurochem Int. 165, 105508(2023).</li>
<li>Hu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+B+knockout+confers+significant+brain+protection+in+the+mouse+model+of+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cathepsin B knockout confers significant brain protection in the mouse model of stroke.</a> J Exp Neurol. 368, 114499(2023).</li>
<li>Yu, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optochemogenetic+stimulation+of+transplanted+iPS-NPCs+enhances+neuronal+repair+and+functional+recovery+after+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optochemogenetic stimulation of transplanted iPS-NPCs enhances neuronal repair and functional recovery after ischemic stroke.</a> J Neurosci. 39 (33), 6571-6594 (2019).</li>
<li>Lin, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opening+a+new+time+window+for+treatment+of+stroke+by+targeting+HDAC2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Opening a new time window for treatment of stroke by targeting HDAC2.</a> J Neurosci. 37 (28), 6712-6728 (2017).</li>
<li>Shi, X. F., Ai, H., Lu, W., Cai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAT%3A+Free+software+for+the+semi-automated+analysis+of+rodent+brain+sections+with+2%2C3%2C5-triphenyltetrazolium+chloride+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SAT: Free software for the semi-automated analysis of rodent brain sections with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride staining.</a> Front Neurosci. 13, 102(2019).</li>
<li>Jensen, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+histological+staining+and+fluorescence+using+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ.</a> Anat Rec. 296 (3), 378-381 (2013).</li>
<li>Donahue, J., Wintermark, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+CT+and+acute+stroke+imaging%3A+foundations%2C+applications%2C+and+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroradiol%22%5BJournal%5D)">Perfusion CT and acute stroke imaging: foundations, applications, and literature review.</a> J Neuroradiol. 42 (1), 21-29 (2015).</li>
<li>Sun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+L-3-n-butylphthalide+pretreatment+attenuates+ischemic+brain+injury+in+mice+with+permanent+distal+middle+cerebral+artery+occlusion+through+the+Nrf2+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">Long-term L-3-n-butylphthalide pretreatment attenuates ischemic brain injury in mice with permanent distal middle cerebral artery occlusion through the Nrf2 pathway.</a> Heliyon. 8 (7), e09909(2022).</li>
<li>Balkaya, M. G., Trueman, R. C., Boltze, J., Corbett, D., Jolkkonen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+outcome+measures+to+improve+experimental+stroke+research%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioral outcome measures to improve experimental stroke research.</a> Behav Brain Res. 352, 161-171 (2018).</li>
<li>Hao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+mechanism+of+cerebral+ischemia-reperfusion+injury+with+treatment+of+stepharine+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Inflammatory mechanism of cerebral ischemia-reperfusion injury with treatment of stepharine in rats.</a> Phytomedicine. 79, 153353(2020).</li>
<li>Pietrogrande, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+oxygen+post+conditioning+prevents+thalamic+secondary+neuronal+loss+caused+by+excitotoxicity+after+cortical+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Low oxygen post conditioning prevents thalamic secondary neuronal loss caused by excitotoxicity after cortical stroke.</a> Sci Rep. 9 (1), 4841(2019).</li>
<li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroke+subtype-dependent+synapse+elimination+by+reactive+gliosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Stroke subtype-dependent synapse elimination by reactive gliosis in mice.</a> Nat Commun. 12 (1), 6943(2021).</li>
<li>Chen, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aryl+hydrocarbon+receptor+modulates+stroke-induced+astrogliosis+and+neurogenesis+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22JNeuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Aryl hydrocarbon receptor modulates stroke-induced astrogliosis and neurogenesis in the adult mouse brain.</a> JNeuroinflammation. 16 (1), 187(2019).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen om bekend te maken.

In het huidige protocol van het craniotomie-elektrocoagulatie-dMCAO-model worden de chirurgische ingrepen uitgevoerd met minimale invasiviteit, waarbij slechts een deel van de temporalis-spier wordt gescheiden om de nadelige effecten op de kauwfunctie te verminderen. De muizen herstelden allemaal goed na de procedure, zonder waargenomen gevallen van voedingsproblemen. De MCA kan gemakkelijk worden onderscheiden in het slaapbeen van de muis, waardoor een nauwkeurige identificatie van geschikte craniotomielocaties mogelijk...

Beroerte is een veel voorkomende acute cerebrovasculaire aandoening die wordt gekenmerkt door een hoge incidentie van invaliditeit en sterfte1. Van alle gevallen van een beroerte behoort bijna 80% tot ischemische beroerte2. Tot nu toe blijft intraveneuze trombolyse een van een beperkt aantal productieve benaderingen voor de behandeling van acute ischemische beroerte. De effectiviteit van trombolytische behandeling wordt echter beperkt door het smalle effectieve tijdvenster en het optreden van hemorragische transformatie3. In de langdurige revalidatiefase na een ischemische beroerte zal een aanzienlijk aantal patiënten waarschijnlijk duurzame neurologische disfuncties ervaren4. Verder onderzoek is dringend nodig om de onderliggende pathofysiologische mechanismen van ischemische beroerte te ontrafelen en om de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën gericht op ischemische beroerte te vergemakkelijken. De oprichting van een betrouwbaar en reproduceerbaar model van ischemische beroerte is cruciaal voor fundamenteel onderzoek en daaropvolgend translationeel onderzoek op het gebied van ischemische beroerte.
In 1981 ontwikkelden Tamura et al. een focaal cerebraal ischemiemodel door gebruik te maken van transcraniële elektrocoagulatie op de proximale plaats van de middelste hersenslagader (MCA)5. Sindsdien hebben talloze onderzoekers verschillende methodologieën gebruikt, zoals ligatie, compressie of clipping om distale MCA-occlusie (dMCAO) te induceren voor het opstellen van voorbijgaande of permanente ischemische beroertemodellen 6,7,8. Vergeleken met het filamentmodel vertoont het dMCAO-model opmerkelijke voordelen, zoals een kleinere infarctgrootte en een hoger overlevingspercentage, waardoor het geschikter is voor het onderzoeken van functioneel herstel op lange termijn na ischemische beroerte9. Bovendien vertoont het dMCAO-model een hoger overlevingspercentage bij oudere knaagdieren in vergelijking met het filamentmodel, waardoor het een voordelig hulpmiddel is voor het onderzoeken van ischemische beroerte bij oudere en comorbide diermodellen10. Het is aangetoond dat het fototrombotische (PT) beroertemodel de kenmerken bezit van minder chirurgische invasiviteit en een significant laag sterftecijfer. Het PT-model vertoont echter een grotere mate van cellulaire necrose en weefseloedeem in vergelijking met het dMCAO-model, wat leidt tot de afwezigheid van collaterale circulatie11. Bovendien is het opmerkelijk dat de ischemische laesies die in het PT-model worden waargenomen, voornamelijk het gevolg zijn van microvasculaire occlusie, wat aanzienlijk verschilt van de cerebrale ischemie geïnduceerd door embolie van grote bloedvaten in het dMCAO-model12.
In dit artikel presenteren we de methodologie voor het induceren van het dMCAO-model van muizen door de distale MCA te coaguleren via craniotomie van een klein botvenster. Daarnaast hebben we histologische onderzoeken en gedragsevaluaties uitgevoerd om de ischemische beledigingen en beroerte-uitkomsten in dit experimentele model uitgebreid te karakteriseren. We willen onderzoekers kennis laten maken met dit model en verder onderzoek naar de pathologische mechanismen van ischemische beroerte vergemakkelijken.

<table><tbody><tr><td>2,3,5-Trifenyltetrazolium Chloride (TTC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108380</td><td>Kleurstof voor TTC-kleuring</td></tr><tr><td>24-well kweekplaat</td><td>Corning (USA)</td><td>CLS3527</td><td>Vat voor TTC-kleuring</td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.</td><td>G1101</td><td>Weefselfixatie</td></tr><tr><td>5% bovine serum albumine</td><td>Wuhan BOSTER Bio Co., Ltd.</td><td>AR004</td><td>Niet-specifieke antigeenblokkering</td></tr><tr><td>5-0 Polyglycolzuurnaad</td><td>Jinhuan Medical Co., Ltd</td><td>KCR531</td><td>Materiaal voor chirurgie</td></tr><tr><td>Anesthesiemachine</td><td>Midmark Corporation</td><td>VMR</td><td>Ganesthetiseerd dier</td></tr><tr><td>Antifade montagemedium</td><td>Beyotime Biotech</td><td>P0131</td><td>Versluiting voor IF-kleuring</td></tr><tr><td>Automatisering-weefsel-dehydratering&nbsp; machine</td><td>Leica Biosystems (Duitsland)</td><td>TP1020</td><td>Weefsel dehydrateren</td></tr><tr><td>Ontharingsroom</td><td>Veet (Frankrijk)</td><td>20220328</td><td>Materiaal voor chirurgie</td></tr><tr><td>Diclofenac&nbsp;natrium&nbsp;gel</td><td>Wuhan Ma Yinglong Pharmaceutical &nbsp;Co., Ltd.</td><td>H10950214</td><td>Analgeticum voor dieren</td></tr><tr><td>Boortip (0,8 mm)</td><td>Rwd Life Science Co., Ltd.</td><td></td><td>Uitrusting voor chirurgie</td></tr><tr><td>Eosine kleuringsoplossing</td><td>Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.</td><td>G1001</td><td>Kleurstof voor H&amp;E kleuring</td></tr><tr><td>Oogzalf</td><td>Guangzhou Pharmaceutical Co., Ltd</td><td>H44023098</td><td>Materiaal voor chirurgie</td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop</td><td>Olympus (Japan)</td><td>BX51</td><td>Beeldverwerving</td></tr><tr><td>GFAP Muis monoklonaal antilichaam</td><td>Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)</td><td>3670</td><td>Primair antilichaam voor IF-kleuring</td></tr><tr><td>Geit anti-muis Alexa 488-geconjugeerd IgG</td><td>Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)</td><td>4408</td><td>Tweede antilichaam voor IF-kleuring</td></tr><tr><td>Geit anti-konijn Alexa 594-geconjugeerd IgG</td><td>Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)</td><td>8889</td><td>Tweede antilichaam voor IF-kleuring</td></tr><tr><td>Grijpsterktemeter</td><td>Shanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd.</td><td>XR501</td><td>Uitrusting voor gedragstest</td></tr><tr><td>Hematoxyline kleuringsoplossing</td><td>Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.</td><td>G1004</td><td>Kleurstof voor H&amp;E kleuring</td></tr><tr><td>Iba1 Konijn monoklonaal antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab178846</td><td>Primair antilichaam voor IF-kleuring</td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Rwd Life Science Co., Ltd.</td><td>R510-22-10</td><td>Ganesthetiseerd dier</td></tr><tr><td>Laser Doppler bloedstroommeter</td><td>Moor Instruments (UK)</td><td>moorVMS</td><td>Bloedstroommonitoring</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Boehringer-Ingelheim</td><td>J20160020</td><td>Analgeticum voor dieren</td></tr><tr><td>Microboor</td><td>Rwd Life Science Co., Ltd.</td><td>78001</td><td>Uitrusting voor chirurgie</td></tr><tr><td>Set microchirurgische instrumenten</td><td>Rwd Life Science Co., Ltd.</td><td>SP0009-R</td><td>Uitrusting voor chirurgie</td></tr><tr><td>Microtoom</td><td>Thermo Fisher Scientific (USA)</td><td>HM325</td><td>Weefselsectieproductie</td></tr><tr><td>Microtoomblad</td><td>Leica Biosystems (Duitsland)</td><td>819</td><td>Weefselsectieproductie</td></tr><tr><td>Monopolaire elektrocoagulatiegenerator</td><td>Spring Scenery Medical Instrument Co., Ltd.</td><td>CZ0001</td><td>Uitrusting voor chirurgie</td></tr><tr><td>Mupirocine zalf</td><td>Tianjin Smith Kline &amp; French Laboratories Ltd.</td><td>H10930064</td><td>Anti-infectie voor dieren</td></tr><tr><td>NeuN Konijn monoklonaal antilichaam</td><td>Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)</td><td>24307</td><td>Primair antilichaam voor IF-kleuring</td></tr><tr><td>Neutrale balsem</td><td>Absin Bioscience</td><td>abs9177</td><td>Versluiting voor H&amp;E kleuring</td></tr><tr><td>Paraffine inbeddingscentrum</td><td>Thermo Fisher Scientific (USA)</td><td>EC 350</td><td>Paraffineblokjes produceren</td></tr><tr><td>Pentobarbital natrium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3761</td><td>Ganesthetiseerd dier</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>Shanghai Beyotime Biotech Co., Ltd</td><td>C0221A</td><td>Spoelen voor weefselsectie</td></tr><tr><td>Shaver</td><td>Shenzhen Codos Electrical Appliances Co.,Ltd.</td><td>CP-9200</td><td>Uitrusting voor chirurgie</td></tr><tr><td>Natriumcitraatoplossing</td><td>Shanghai Beyotime Biotech Co., Ltd.</td><td>P0083</td><td>Antigeenretrieval voor IF-kleuring</td></tr></tbody></table>

inductie van acute ischemische beroerte bij muizen met behulp van de distale occlusietechniek van de middelste slagader

Induction of Acute Ischemic Stroke in Mice Using the Distal Middle Artery Occlusion Technique

Ischemische beroerte blijft de belangrijkste oorzaak van mortaliteit en functionele beperkingen onder de volwassen populaties wereldwijd. Slechts een minderheid van de patiënten met een ischemische beroerte komt in aanmerking voor intravasculaire trombolyse of mechanische trombectomietherapie binnen het optimale tijdvenster. Van de overlevenden van een beroerte lijdt ongeveer tweederde gedurende een langere periode aan neurologische disfuncties. Het opzetten van een stabiel en herhaalbaar experimenteel model voor ischemische beroertes is uiterst belangrijk voor verder onderzoek naar de pathofysiologische mechanismen en het ontwikkelen van effectieve therapeutische strategieën voor ischemische beroerte. De middelste hersenslagader (MCA) vertegenwoordigt de overheersende locatie van ischemische beroerte bij mensen, waarbij de MCA-occlusie dient als het vaak gebruikte model van focale cerebrale ischemie. In dit protocol beschrijven we de methodologie voor het vaststellen van het distale MCA-occlusiemodel (dMCAO) door middel van transcraniële elektrocoagulatie bij C57BL/6-muizen. Aangezien de occlusieplaats zich aan de corticale tak van MCA bevindt, genereert dit model een matig infarct laesie dat beperkt is tot de cortex. Neurologische gedrags- en histopathologische karakterisering hebben zichtbare motorische disfunctie, neurondegeneratie en uitgesproken activering van microglia en astrocyten in dit model aangetoond. Dit dMCAO-muismodel biedt dus een waardevol hulpmiddel voor het onderzoeken van de ischemieberoerte en de waarde van popularisering.

De belangrijkste instrumenten die worden gebruikt om de dMCAO uit te voeren, zijn de set microchirurgische instrumenten, de isofluraanverdamper en de monopolaire microchirurgische elektrocoagulatiegenerator die in figuur 1 wordt weergegeven. De experimentele procedure van deze studie wordt geïllustreerd in figuur 2. Kortom, een craniotomie met een klein botvenster werd gebruikt om de distale MCA bloot te leggen, die vervolgens werd gecoaguleerd om permanente foc...

Hier presenteren we een protocol om een distaal occlusiemodel van de middelste hersenslagader (dMCAO) op te stellen door middel van transcraniële elektrocoagulatie bij C57BL/6J-muizen en evalueren we het daaropvolgende neurologische gedrag en histopathologische kenmerken.

Inductie van acute ischemische beroerte bij muizen met behulp van de distale occlusietechniek van de middelste slagader

Ischemic stroke remains the predominant cause of mortality and functional impairment among the adult populations globally. Only a minority of ischemic ...

In het huidige onderzoek streven we ernaar een uitgebreid en gedetailleerd protocol te bieden voor het vaststellen van een occlusiemodel voor de middelste hersenslagader bij C57BL/6J-muizen met behulp van transcraniële elektrocoagulatie en we evalueerden het daaropvolgende neurologische gedrag en histopathologische kenmerken. De middelste hersenslagader of MCA wordt erkend als de primaire plaats van ischemische beroerte bij mensen. De MCA-occlusiemethoden, waaronder techniek, fotochemische introductie en occlusie, zijn op grote schaal gebruikt om focale cerebrale ischemie bij knaagdieren te induceren.In vergelijking met andere modellen voor ischemie-beroerte heeft dit model het voordeel van minder chirurgische invasiviteit, een kleinere infarctgrootte en een hoger overlevingspercentage, waardoor het geschikter is voor onderzoek naar functioneel herstel op lange termijn na ischemische beroerte. Over het algemeen genereert de huidige aanpak effectief een betrouwbaar experimenteel ischemisch beroertemodel dat een hoge overlevingskans en uitstekende herhaalbaarheid vertoont. Bijgevolg dient deze methodologie als een hulpmiddel van onschatbare waarde voor zowel fundamenteel als translationeel onderzoek op het gebied van beroerte.In de toekomst zullen we gedragsparadigma's zoals nieuwe objectherkenning en waterdoolhof gebruiken om de dynamische veranderingen in langetermijnleren en geheugencapaciteiten bij distale MCA-occludeerde muizen te onderzoeken. Dit zal ons in staat stellen om de levensvatbaarheid vast te stellen van het gebruik ervan als diermodel voor cognitie-stoornisstudies na een beroerte.

induction-acute-ischemic-stroke-mice-using-distal-middle-artery

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Filamenteuze occlusie van het Midden-cerebrale slagader is een gemeenschappelijk model voor het bestuderen van ischemische beroerte in muizen.

Modellering Stroke in Muizen - midden cerebrale slagader occlusie met de gloeidraad Model

We zien in de video een methode voor het produceren van een midden cerebrale slagader occlusie bij volwassen muizen met behulp van een intraluminale monofilament. We laten ook zien hoe de omvang van herseninfarct beoordelen door 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) kleuring.

Muis model van de midden cerebrale slagader Occlusion

De intraluminale midden cerebrale slagader occlusie (MCAO) model is de meest frequente gebruikte model onder experimentele ischemische beroerte modellen. Hier zullen we demonstreren het gehele model in detail met de gids van Laser Doppler flowmetry, en zijn vertegenwoordiger resultaten.

Intraluminale midden cerebrale slagader Occlusie (MCAO) Model voor ischemische beroerte met Laser Doppler Flowmetry Begeleiding in Muizen

De intraluminale cerebralis occlusie bij muizen wordt hierin gepresenteerd. De omvang van herseninfarct wordt beoordeeld door een neurologische score en cresyl violet kleuring, een kleuring met TTC alternatief biedt het grote voordeel te testen in parallel veel belang markers.

Muis Model van Intraluminale mCaO: herseninfarct Evaluatie door cresyl Violet Staining

Verschillende muismodellen van midden cerebrale slagader occlusie (MCAO) worden veel gebruikt in experimenteel onderzoek hersenen. Hier tonen we het model van transcraniële permanente distale MCAO die consistent zijn corticale infarct van een omvang die overeenkomt met die door de meerderheid van de menselijke ischemische beroertes schade veroorzaakt.

Modellering Stroke in Muizen: Permanente Coagulatie van de distale midden cerebrale slagader

Om de pathofysiologie van beroerte te begrijpen, is het belangrijk betrouwbare modellen. Dit document zal een van de meest gebruikte takt modellen beschrijven in muizen, genaamd de middelste cerebrale slagader occlusie (MCAo) model (ook aangeduid als de intraluminale filament of hechtdraad model) met reperfusie.

Chirurgische Aanpak voor midden cerebrale slagader occlusie en reperfusie Induced Stroke in Muizen

We beschrijven een muismodel van een beroerte veroorzaakt door de occlusie van de middelste hersenslagader met behulp van een met siliconen omhulde naald. Het protocol kan worden toegepast om een permanente occlusie of een tijdelijke ischemie te induceren, gevolgd door reperfusion.

Inductie van ischemische beroerte en ischemie-reperfusie in Muizen met behulp van het Midden-slagader occlusie Techniek en Visualisatie van Infarct Area

Intraluminale gloeidraad occlusie van de middelste cerebrale slagader is het meest gebruikte in vivo model van experimentele beroerte in knaagdieren. Een alternatieve chirurgische benadering om gemeenschappelijke halsslagader reparatie gebeurt hier, waardoor de reperfusie van de gemeenschappelijke halsslagader en een volledige reperfusie naar het grondgebied van de middelste cerebrale slagader.

Occlusie van de middelste cerebrale slagader waardoor reperfusie via gemeenschappelijke halsslagader reparatie in muizen

Een muismodel van cerebrale ischemie-reperfusie is gevestigd te onderzoeken de pathofysiologie van een beroerte. We distally de rechts midden cerebrale slagader en rechts gemeenschappelijke halsslagader afbinden en bloedstroom herstellen na 10 of 40 min van ischemie.

Muismodel van twee-schip occlusie van cerebrale ischemie-reperfusie

Dit protocol demonstreert een uniek muizenslagmodel met een middelgroot infarct en een uitstekende overlevingskans. Dit model stelt preklinische beroerte-onderzoekers in staat om de duur van de ischemie te verlengen, verouderde muizen te gebruiken en functionele resultaten op lange termijn te beoordelen.

Een aangepast transcraniaal occlusiemodel voor de middelste cerebrale slagader om de uitkomsten van een beroerte bij oudere muizen te bestuderen

Dit protocol beschrijft het model van voorbijgaande focale cerebrale ischemie bij muizen door intraluminale occlusie van de middelste hersenslagader. Daarnaast worden voorbeelden van uitkomstbeoordeling getoond met behulp van magnetische resonantiebeeldvorming en gedragstests.

Voorbijgaand occlusiemodel van de middelste cerebrale slagader van een beroerte

Leer de distale middelste slagaderocclusiemethode met transcraniële elektrocoagulatie bij C57BL/6J muizen. Dit protocol evalueert neurologisch gedrag en histopathologische kenmerken voor betrouwbaar beroerteonderzoek.

Inductie van acute ischemische beroerte bij muizen met behulp van de distale occlusietechniek van de middelste slagader

Meer video's verkennen