Epon Post Inbedding van correlatieve licht- en elektronenmicroscopie
12 januari 2024
We presenteren een gedetailleerd protocol voor Epon post-embedding correlatieve licht- en elektronenmicroscopie met behulp van een fluorescerend eiwit genaamd mScarlet. Deze methode kan de fluorescentie en de ultrastructuur tegelijkertijd behouden. Deze techniek is geschikt voor een breed scala aan biologische toepassingen.
Correlatieve licht- en elektronenmicroscopie is een volledig stabiele microscopietechniek, die de lokalisatie-informatie van fluorescerende microscopie kan combineren en de ultrastructuur is door elektronenmicroscopie. De mentaliteit van deze techniek is echter om de fluorescentie te behouden nadat je een eenvoudige bereiding hebt gehad. Met behulp van dit fluorescerende eiwit kunnen we correlatief licht bereiken en de elektronenmicroscoop die tegelijkertijd fluorescentie en ultrastructuur kan behouden.
Overzicht
Deze studie presenteert een gedetailleerd protocol voor Epon post-embedding correlatieve licht- en elektronenmicroscopie met gebruik van het fluorescente eiwit mScarlet. De methode bewaart succesvol zowel de fluorescentie als de ultrastructuur, waardoor deze toepasbaar is voor diverse biologische toepassingen.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Onderzoeksgebied
- Correlatieve licht- en elektronenmicroscopie
- Toepassingen van fluorescerende eiwitten
- Microscopietechnieken
Achtergrond
- Combinatie van fluorescentiemicroscopie met elektronenmicroscopie
- Uitdagingen bij het behoud van fluorescentie tijdens de preparatie
- Gebruik van mScarlet voor verbeterde beeldvorming
Gebruikte methoden
- Correlatieve licht- en elektronenmicroscopietechnieken
- Muizenhersenweefsel als biologisch model
- Post-embedding met gebruik van Epon en mScarlet
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle behoud van fluorescentie en ultrastructuur
- Gedetailleerde beeldvorming van hersenweefsel
- Effectieve uitlijning van fluorescentie- en elektronenmicroscopiesignalen
Conclusies
- De studie demonstreert een betrouwbare methode voor correlatieve licht- en elektronenmicroscopie
- Benoemt het potentieel voor bredere toepassingen in biologisch onderzoek
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (CLEM) na Epon-inbedding maakt gelijktijdige preservatie van fluorescentie en ultrastructuur mogelijk, waarmee een kritieke uitdaging in cellulaire beeldvorming in de ontdekkingsfase wordt aangepakt. Deze mogelijkheid verbetert het mechanistische de-riskingproces en de targetvalidatie door een ruimtelijke context met hoge resolutie te bieden voor moleculaire lokalisatie. De methode ondersteunt de voorspellende betrouwbaarheid bij belangrijke overgangspunten in vroege ontdekkings- en preklinische onderzoekspijplijnen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt nauwkeurige lokalisatie van moleculaire targets binnen behouden cellulaire ultrastructuur mogelijk.
- Ondersteunt functionele target-validatie door fluorescentiesignalen te correleren met ultrastructurele kenmerken.
- Faciliteert mechanische risicoreductie door directe visualisatie van moleculaire en structurele relaties.
- Verbetert het voorspellende vertrouwen voor het verder brengen van targets in de discovery-pipeline.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde biologische coupes voor voor downstream high-content imaging-workflows.
- Waarborgt reproduceerbaarheid en kwantitatieve imaging-outputs door zowel fluorescentie als ultrastructuur te behouden.
- Ondersteunt assay-standaardisatie en schaalbaarheid voor screening-applicaties die ruimtelijke resolutie vereisen.
- Maakt een betrouwbare evaluatie mogelijk van de effecten van verbindingen op subcellulaire structuren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt moleculaire lokalisatiegegevens aan ziekterelevante ultrastructurele veranderingen in preklinische modellen.
- Zorgt voor continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door integratie van multimodale imaginggegevens.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling op basis van robuust ruimtelijk en moleculair bewijs.
- Verbetert de ontwikkeling van translationele biomarkers door fluorescentie te correleren met ultrastructurele pathologie.
Integratie van Pipeline en Workflow
Deze methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege validatie van targets tot preklinisch onderzoek, en slaat een brug tussen moleculaire lokalisatie en ultrastructurele analyse.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden door moleculaire en structurele gegevens te correleren.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve imaging-outputs voor assayontwikkeling en evaluatie van verbindingen.
- Analytica: Biedt hogeresolutie-metingen en image registration-outputs voor vergelijkende analyse.
- Translationeel onderzoek: Maakt het mogelijk om moleculaire markers af te stemmen op ziekterelateerde ultrastructuur in preklinische modellen.
- Bedrijfsbrede hergebruikbaarheid: Creëert een herbruikbare imaging-capaciteit voor diverse R&D-programma's waarvoor correlatieve microscopie vereist is.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij target-validatie.
- Operationele waarde: Standaardiseert imaging-workflows en waarborgt reproduceerbaarheid over verschillende experimenten heen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door het leveren van robuuste spatiale gegevens.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van discovery- en preklinische assets mogelijk.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in zowel fluorescentie- als elektronenmicroscopietechnieken.
- Vereist toegang tot geavanceerde beeldvormingsinstrumentatie en software voor beeldregistratie.
- Noodzaak van standaardisatie tussen teams voor monstervoorbereiding en beeldvormingsprotocollen.
- Kan aanpassing vereisen voor verschillende weefseltypen of modelsystemen.
- Afhankelijk van de compatibiliteit van fluorescerende eiwitten met Epon-inbedding en EM-voorbereiding.
Veelgestelde vragen over Biofarmacie
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:44
Ultrathin Sectioning for Epon Post‐Embedding Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM)
1:33
Creating the Navigation Map for CLEM and Preparation of the Ultrathin Sections for Electron Microscopy
4:07
Image Analysis of Brightfield and Fluorescence Images of the Mouse Brain Sections for Epon Post‐Embedding Correlative Light and Electron Microscopy
6:16
Registration of the Fluorescence Microscopy Image with the Electron Microscopy Image for Correlative Light and Electron Microscopy
