Name: Neuronale celkweken van Aplysia voor High-Resolution Imaging van Groei Cones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-20T18:40:00.000+00:00
Duration: 16 min 29 s
Description: Leer hoe je neuronale celkweken van Aplysia californica opzet voor high-resolution imaging van groeikegels. Dit protocol toont dissectie, cultuur en live cel imaging van bag cell neuronen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag Ryan Maneri (Scholekster Productions, LLC) bedanken voor het filmen onze procedure en Rodney McPhail (Department of Biological Sciences, Purdue University) voor hulp bij het bewerken van de dissectie video. Onderzoek in het lab Suter wordt ondersteund door subsidies van de NIH (R01 NS049233) en de Bindley bio-Center aan de Purdue University naar DMS

Oplossingen <ul><li> L15-ASW celcultuurmedium (1l) <ul><li> 1 zakje poeder L15 </li><li> Voeg 800 ml H 2 O ultrapuur </li><li> NaCl 400 mM </li><li> MgSO 4 27 mM </li><li> MgCl 2 28 mM </li><li> L-Glutamine 4 mM </li><li> Gentamicine 50 ug / ml </li><li> HEPES 5 mM </li><li> Aan te passen aan de pH 7,9 </li><li> Voeg druppelsgewijs CaCl2 9,3 mM (stoppen als precipitaten) </li><li> Voeg H 2 O ultrapuur tot 1 l </li><li> Controleer osmolariteit (950-1000 mmol / kg) met osmometer (dampspanning, Wescor # 5520) </li><li> Filter 0,22 urn met behulp van een positieve druk filtratie-eenheid (Filters: Millipore SVGV010RS) </li><li> Bewaren bij 4 ° C gedurende maximaal 1 maand </li></ul></li><li> Poly-L-lysine (70-150 kD) 200 ug / ml stockoplossing in een steriele H 2 O ultrapuur bewaard bij -20 o C </li><li> 0,5 M MgCl 2-oplossing </li></ul> Dag 1: Dissectie van Aplysia buik ganglion Voorbereiding van de enzymatische dissociatie oplossing <ol><li> Weeg 9-10 mg Dispase enzym (Worthington, Cat: LS02111) in een Eppendorf buis </li><li> Voeg 900 ul van L15-ASW cultuur medium, en 100 ul van steriele H 2 O ultrapuur </li><li> Meng en plaats bij kamertemperatuur (RT) </li></ol> Dissectie van de abdominale ganglion <ol><li> Vul een 50 ml spuit met 0,5 M MgCl 2-oplossing. </li><li> Neem een ​​dier van de tank, zacht handvat dier inktgeving verdediging reactie te vermijden. </li><li> Plaats de Aplysia op zijn kant op een dissectie board (piepschuim bord), rostraal kant aan de rechterkant, caudale zijde aan de linkerkant. </li><li> Steek de naald in dier net achter het hoofd en injecteer alle MgCl 2-oplossing in het lichaam holte. </li><li> Wrijf het dier naar de MgCl 2-oplossing te verspreiden door het lichaam holte, wacht een paar minuten voor het dier volledig verdoofd. </li><li> Pin de kop en de staart van het dier aan de dissectie bord met twee naalden. </li><li> Gebruik een tang om de huid lift, door de huid en de spierlaag met grote schaar naar het hoofd en staart geknipt om een ​​grote opening aan de zijkant maken. </li><li> Vind de buik ganglion onder de borstel-achtige eierstok. Een tang om de verbindende zenuwen ongeveer 1 cm in de voorkant van de buik ganglion te houden, knip de zenuwen met dissectie schaar in de voorkant van de tang houden positie en achter de buik ganglion. </li><li> Plaats ganglion in de Dispase oplossing en incubeer 15-16 uur bij 22 ° C met behulp van een temperatuur-gecontroleerde waterbad. </li></ol> Dag 2: Plating van Aplysia zak cellen Voorbereiden van poly-lysine-gecoate dekglaasjes <ol><li> In een flow bank, voor te bereiden drie 35mm petrischaaltjes als werkende gerechten voor dissectie van het ganglion, ze te vullen met 4 ml L15-medium ASW elk. Breng de buik ganglion van de dispase oplossing voor een van de werkende gerechten na 15,5 uur van de spijsvertering. </li><li> Met behulp van een tang te nemen zuur gereinigd # 1.5 dekglaasjes (22x22 mm) zijn opgeslagen in ethanol, verwijder alcohol en steriliseer dekglaasjes door vlammende ze kort boven bunsenbrander. Laat ze even afkoelen voordat u de dekglaasjes in de cultuur gerechten. </li><li> Bereid een gebogen plating tip door het buigen van een gele punt boven de bunsenbrander (vlam slechts kort aan het smelten van plastic te vermijden!). </li><li> Bereid juiste hoeveelheid van 20 ug / ml poly-lysine oplossing door verdunnen van 200 ug / ml stockoplossing met een steriele H 2 O ultrapuur. </li><li> Bedek elk dekglaasje met 500 ul van 20 ug / ml poly-lysine en incubeer gedurende 20 minuten bij KT. </li><li> Was elke dekglaasje 3-5 keer met 500 ul steriel H 2 O ultrapuur elk. </li><li> Verwijder het water uit dekglaasjes, vul elk gerecht met 4 ml van L15-ASW kweekmedium. </li></ol> Dissociatie van de tas cellen <ol><li> Onder een microscoop dissectie, snijd de buik ganglion in de helft met behulp van schaar en pincet dissectie vooraf gereinigd met 95% ethanol (zie figuur 1 lijn 1). </li><li> Op de ene helft van het ganglion, snijd tussen tas cel cluster en de hemiganglion cellen (figuur 1 lijn 2), en weggesneden resterende zenuwen extensies aan de andere kant van de tas cellen (Figuur 1 lijn 3). Werk aan de ene helft van ganglion op een moment, laat de andere helft in de schaal, terwijl cellen van eerste cluster worden verzilverd. </li><li> Met behulp van twee pincet (of een pincet en een schaar dissectie), laat zak cel cluster door op vernietiging van de bindweefsel omhulsel rond de tas cel cluster. Weggesneden bindweefsel met dissectie schaar indien nodig. Pas op niet te knijpen en de tas cel cluster raken te veel tijdens dit proces. </li><li> Wanneer de meeste van het bindweefsel wordt verwijderd, de overdracht van de bag cel cluster in een nieuwe manier van werken schotel met de gebogen gele punt bereid eerder. Wees voorzichtig niet te laten de zak cel cluster worden gevangen in de gele tip of steken op de lucht / medium-interface. </li><li> Vermaal het cluster met gele tip om afzonderlijke zak cellen te verwijderen. Doe dit door pipetteren de cluster in en uit de tip. Begin met een lage schuifkrachten en verhoging van kracht als nodig is. Gebruik altijd de laagste kracht die nodig is om neuronen te verwijderen zonder het doden van al te veel cellen. </li><li> Verzamel 3-5 gezonde zak cellen en overbrengen naar een schotel met een poly-lysine-gecoate dekglaasje aan. Vermijd het oppakken van dode cellen (ze zijn zwart / transparant in het midden) en het bindweefsel puin. </li><li> Herhaal stap 6. en plaats ongeveer 15-25 wonen neuronen in het midden van elke dekglaasje aan. Als dode cellen of vuil worden overgebracht en, verwijdert u het ongewenst materiaal door picking it up of waait het weg van de gezonde cellen. Dit proces duurt ongeveer 2-3 uur voor beide clusters. </li><li> Eenmaal klaar houden de cultuur gerechten op de flow bank voor minimaal 2 uur bij kamertemperatuur, zodat cellen te hechten (blijven stromen bench ventilator af om ongewenste trillingen te voorkomen). </li><li> Plaats de vaat in een incubator bij 14 ° C gedurende de nacht, of tot verder gebruik. Groei kegels kunnen ontwikkelen in 4-10 uur. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/old/662_2008_2_10_0/image001.jpg" alt="Figuur 1. Schematische voorstelling van Aplysia californica buik ganglion. Gekleurde lijnen geven aan waar te snijden om zak cel clusters te verkrijgen." /> Figuur 1. Schematische voorstelling van Aplysia californica buik ganglion. Gekleurde lijnen geven aan waar te snijden om zak cel clusters te verkrijgen. Dag 3: Het opzetten van kamer voor live beeldvorming van Aplysia zak cellen Montage van imaging kamer <ol><li> Voordat u tas cellen voor live-cell imaging experimenten, inspecteren cellen op een laag vermogen microscoop. Als cellen niet hebben ontwikkeld gezonde groei kegels, levering vers medium en laat bij kamertemperatuur gedurende 1-2 uur. </li><li> Te leveren platen met verse L15-ASW medium, verwijder dan de helft (~ 2 ml) van het oude medium met een vacuüm lijn, en voeg 2 ml van de nieuwe L15-ASW medium per petrischaal. Het is belangrijk om niet alle medium volledig te verwijderen van de schotel in een keer, want dit zal verwijderen cellen van het dekglaasje. </li><li> Voor de tas cell imaging, we monteren twee dekglaasjes en twee plastic afstandhouders in een sandwich-achtige beeldvorming kamer. De top dekglaasje in de sandwich is korter geknipt om eenvoudige uitwisseling van de middelgrote en reagentia mogelijk te maken. Bij de montage moet dekglaasjes met aangebouwde zak cellen worden ondergedompeld in L15-ASW medium te allen tijde om cellen van verdrijven te voorkomen. </li><li> Ter voorbereiding op de kamer, afgesneden ~ 2 mm van de rechterkant van een # 1 coverslips 22x22 mm met diamant pen (glassnijder) en de liniaal. </li><li> Met behulp van een 1 ml injectiespuit van toepassing hoog vacuüm vet aan twee kanten van de kortere dekglaasje, en bevestig kunststof afstandhouders aan elke kant. Van toepassing zijn vacuüm vet aan op de top van beide afstandhouders. </li><li> Keer de dekglaasje en spacer vergadering, en te plaatsen in petrischaaltje met tas cellen op een dekglaasje. Uitlijnen en zachtjes druk naar boven dekglaasje houden aan onderkant dekglaasje met het omgekeerde einde van de twee Q-tips. </li><li> Met behulp van een tang, Til sandwich montage uit de petrischaal zonder het medium lekken. Lijn de twee dekglaasjes, indien nodig, en veeg overtollige medium met een Kimwipe. Leg de sandwich op het onderste deel van de microscoop diahouder en bevestig het deksel met zorg met behulp van clips. </li><li> Reinig het midden van de bovenkant van de sandwich met Q-tips gedept in glasreiniger (Sparkle wordt gebruikt als glasreiniger). Drogen snel uit het glas reiniger met een tweede, droge Q-tip om streak lijnen te voorkomen. Doe hetzelfde voor de onderkant dekglaasje aan. Schoon coverslips vrij van streak lijnen zijn belangrijk voor een hoge beeldkwaliteit. </li></ol> Tas cellen op de microscoop Sinds Aplysia zak cel neuronale culturen zijn bij een lage dichtheid, is het het beste als uw microscoop setup heeft podium positionering functies te faciliteren schakelen tussen cellen. Tas cellen kunnen gemakkelijk worden bewaard bij RT gedurende enkele uren op het podium tijdens imaging experimenten. Periodiek Exchange op de middellange tot verdamping te voorkomen.

<ol><li>Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+induces+changes+in+distribution+and+transport+of+organelles+within+growth+cones+of+Aplysia+bag+cell+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons.</a> J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).</li>
<li>Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ig+superfamily+cell+adhesion+molecule%2C+apCAM%2C+mediates+growth+cone+steering+by+substrate-cytoskeletal+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling.</a> J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).</li>
<li>Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodia+and+actin+arcs+guide+the+assembly+and+transport+of+two+populations+of+microtubules+with+unique+dynamic+parameters+in+neuronal+growth+cones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones.</a> J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).</li>
<li>Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+are+necessary+for+SRC+family+kinase-dependent+growth+cone+steering%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering.</a> Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).</li>
</ol>

Aplysia zak cel neuronen zorgen voor een serumvrij neuronale celkweek systeem met zeer weinig niet-neuronale cellen. Deze neuronen vormen zeer grote toename kegels geschikt is om een ​​aantal belangrijke celbiologische vragen te beantwoorden. Tas cel neuronen kunnen gemakkelijk worden gemanipuleerd en afgebeeld op kamertemperatuur gedurende enkele uren. Het gebruik van TL-Speckle Microscopy (FSM) kan men kwantitatief de verschillende parameters van F-actine en microtubuli polymerisatie en translocatie dynamiek te analyseren. Deze imaging-to...

<table><tbody><tr><td>#1 glazen dekglasjes 22x22 mm</td><td>Instrument</td><td>VWR international</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>#1.5 glazen dekglasjes 22x22 mm</td><td>Instrument</td><td>Corning</td><td>2870-22</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petrischalen</td><td>Instrument</td><td>Falcon BD</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Filters voor mediumfiltratie</td><td>Instrument</td><td>EMD Millipore</td><td>SVGV010RS</td><td></td></tr><tr><td>Hoogvacuümvet</td><td>Instrument</td><td>Dow Corning</td><td>1597418</td><td></td></tr><tr><td>Osmometer</td><td>Instrument</td><td>Wescor</td><td>5520</td><td></td></tr><tr><td>Plastic shims</td><td>Instrument</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>SHSP-200</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Reagens</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4030</td><td></td></tr><tr><td>L15 medium</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>41300-039</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Reagens</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>5958-04</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaat</td><td>Reagens</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>6070-12</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine (70-150 kD)</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6282</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Reagens</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7581</td><td></td></tr><tr><td>Neutrale protease (Dispase)</td><td>Reagens</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS02111</td><td></td></tr></tbody></table>

neuronale celkweken van aplysia voor high-resolution imaging van groei cones

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronale groei kegels zijn de zeer beweeglijke structuren op het puntje van axonen die leiding signalen kan detecteren in de omgeving en transduceren deze informatie in directionele beweging in de richting van de juiste doelcel. Om volledig te begrijpen hoe begeleiding informatie wordt doorgestuurd vanaf de cel oppervlak naar de onderliggende dynamische cytoskelet-netwerken, moet men een model dat geschikt is voor live-cell imaging van eiwitten dynamiek bij hoge temporele en ruimtelijke resolutie. Typische gewervelde groei kegels zijn te klein om kwantitatief te analyseren F-actine en microtubuli dynamiek. Neuronen van de zee haas Aplysia californica zijn 5-10 keer groter dan gewervelde neuronen, kan gemakkelijk worden bewaard bij kamertemperatuur en zijn zeer robuust cellen voor micromanipulatie en biofysische metingen. Hun groei kegels zijn zeer gedefinieerd cytoplasmatische regio&#39;s en een goed beschreven cytoskelet systeem. De neuronale cellichamen kan worden gemicroinjecteerd met een verscheidenheid van sondes voor het bestuderen van de groei kegel beweeglijkheid en begeleiding. In het huidige protocol waarin we aantonen dat er een procedure voor dissectie van de abdominale ganglion, de cultuur van de tas cel neuronen en het opzetten van een imaging kamer voor live-cell imaging van de groei kegels.

Aplysia californica neuronen ontwikkelen van grote groei van kegels in de cultuur die zijn uitstekend geschikt voor hoge-resolutie beeldvorming van groeikegel motiliteit en begeleiding. Hier presenteren we een protocol voor dissectie en plating van Aplysia zak cel neuronen, alsook voor het opzetten van een kamer voor live cell imaging.

Neuronale celkweken van Aplysia voor High-Resolution Imaging van Groei Cones

Neuronale groeikegels zijn de zeer beweeglijke structuren aan de uiteinden van axonen die sturingssignalen in de omgeving kunnen detecteren en deze informatie kunnen transduceren ...

In het pseudo-lab kweken we neuronen uit de ganglioncellen van de waterslak Plegia californica. Deze neuronen vormen zeer grote groeikegels, waardoor ze een uitstekend modelsysteem zijn voor studies met een hoge resolutie naar de mobiliteit en begeleiding van groeikegels, in het bijzonder voor het analyseren van cytoskeletdynamiek. In deze video laten we zien hoe u een dissectie van Plegia uitvoert en een kweek van ganglioncellen start.Hoi, ik ben Daniel Suter van het Department of Biological Sciences aan de Purdue University. Vandaag gaan we u de procedure laten zien voor de dissectie, cultuur en beeldvorming van neuronen uit de glia back cell. Neuronen uit de C, her apia CAA zijn uitgebreid gebruikt voor studies naar leren en geheugen.Aangezien Apia een eenvoudig zenuwstelsel en grote neuronen heeft die geschikt zijn voor elektrofysiologie, gebruiken we deze neuronen in ons laboratorium omdat hun groeikegels groot zijn en zeer geschikt voor resolutiebeeling van proteïnedynamiek met betrekking tot de motiliteit en geleiding van de groeikegels. De volledige procedure omvat de volgende stappen.Op dag één wordt het dier geofferd en gedissekeerd om de abdominale ganglia te verkrijgen. Op dag twee worden de kweekplaten voorbereid. Rugcelclusters worden gedissekeerd en individuele neuronen worden uitgeplaat.Op dag drie wordt er een beeldkamer geconstrueerd voor time-lapse imaging van de cellen met DIC-differentiaalinterferentiecontrastmicroscopie, inclusief demonstratie en toelichting. De procedure van vandaag wordt uitgevoerd door iTune Lee, een promovendus in mijn laboratorium. Zij zal u nu laten zien hoe u neuronen uit de rugmergcellen prepareert.Laten we beginnen. De neuronen van de bag-cellen maken deel uit van het abdominale ganglion van het zenuwstelsel van de plegia, dus we zullen het volledige abdominale ganglion uitdissecteren voor enzymatische digestie. Vervolgens zullen we de twee clusters van bag-cellen scheiden van de rest van het ganglion.Het abdominale ganglion wordt in deze fase-twee-oplossing gedurende 15 tot 16 uur gedigesteerd om het bindweefsel los te maken. Nu moeten we een grote spuit van 60 milliliter vullen met 0,5 M magnesiumchloride om het dier te offeren, en de dissectie-instrumenten schoonmaken: één dissectiepincet, een schaartje en een grote schaar. We gebruiken Plesiocauda California van de Californische kust, met een gewicht van ongeveer 150 gram.We houden de dieren gedurende maximaal drie tot vier weken in een kreeftentank. Het dier krijgt een injectie met de magnesiumchloride-oplossing in de lichaamsholte, nabij de kop. Door het dier te wrijven, wordt de verspreiding van de oplossing bevorderd en wordt samentrekking voorkomen.Zet het dier bij de kop en staart vast op een piepschuimplaat met behulp van injectienaalden. Til de spier van de lichaamswand op met een pincet en knip de lichaamsholte open met een grote schaar. Knip vervolgens de lichaamswand langs de zijkant open van kop tot staart en zet de spier vast op de plaat.Vervolgens moet het abdominaal ganglion worden gelokaliseerd onder het ovarium, wat een borstelachtig geelachtig orgaan is. Het abdominaal ganglion kan nu worden gevonden. Koppel het ganglion los door de zenuwen aan de anterieure en posterieure zijde van het ganglion door te knippen met de dissectieschaar.Breng het ganglion vervolgens over naar een reageerbuis met één milliliter van de verplaatsingsoplossing en plaats deze gedurende 15,5 uur in een waterbad van 22 °C. Tijdens deze incubatie zal het bindweefsel zodanig verslappen dat de clusters van back-cellen gemakkelijk kunnen worden verwijderd. Voordat we beginnen met de kweek van de back-cellen, bereiden we de dekglasjes voor waarop de neuronen worden gekweekt.We kweken ruggenmergneuronen op met lyine gecoate dekglasjes in Petri-schalen van 35 millimeter. Deze worden vervolgens ondergedompeld in L 15 A SW-medium, wat een cultuurmedium met een hoog zoutgehalte is. Voor dit type cellen bereiden we doorgaans acht tot 10 Petri-schalen met dekglasjes per dier voor.Laten we nu de instrumenten bespreken die worden gebruikt voor het uitplaten van de zakcelneuronen. Voor de dissectie van zakcelclusters hebben we drie petrischalen zonder dekglas nodig, gevuld met L 15 A SW, fijne pincetten en scharen gesteriliseerd met alcohol, en een gebogen gele tip bevestigd op een P 20 pipette. De gele tip wordt gebogen door deze kortstondig door de vlam van een Bunsenbrander te halen en met een pincet te buigen.Zorg ervoor dat het gebogen gedeelte niet wordt platgedrukt. Anders kunnen de cluster van bag-cellen later daar vast komen te zitten. De dissectie en het uitplaten van plegia bag-cellen wordt bij kamertemperatuur onder de dissectiescoop uitgevoerd.Nu is de enzymincubatie van 15,5 uur beëindigd en kunnen we het abdominale ganglion vanuit de disc-ruimte overbrengen naar een van de werkbakjes met L 15 A SW-medium. Voordat we laten zien hoe de bag-cellen worden geïsoleerd, kijken we eerst naar het schema. Om te visualiseren hoe het abdominale ganglion wordt gedissecteerd, snijden we het abdominale ganglion eerst door het midden door.Zoals u aan deze lijn kunt zien. Vervolgens maken we twee sneden voor en achter de achterzijde. Dus cluster, zoals u hier kunt zien.Kijk nu door het stereomicroscoop; u kunt zien dat het abdominale ganglion in het midden is doorgesneden en dat er nu twee sneden zijn gemaakt aan de voor- en achterzijde van de bagcellcluster. Gebruik vervolgens een pincet om een opening in het bindweefsel te vinden en duw voorzichtig de bindweefselschede rondom de bagcellcluster naar beneden. Verwijder het bindweefsel, indien mogelijk als één geheel, van de cluster met behulp van de dissectieschaar.Zorg er echter voor dat het cluster van zakcellen niet beschadigd raakt. Breng met een medium in een gebogen pipetpunt het cluster van zakcellen voorzichtig over naar een andere werkschaal. Tik voorzichtig tegen het cluster van zakcellen met een gele punt om individuele zakcellen uit het cluster te scheiden.Om dit te doen, neemt u het cluster op in de pipetpunt en drukt u het uit zonder luchtbellen te veroorzaken. Breng de levende cellen vanuit het cluster over naar schaaltjes met poly-gecoate dekglasjes. Dode cellen zien er in het centrum zwart uit, terwijl levende cellen wit zijn.Het is belangrijk om de cellen in het midden van het dekglas te plaatsen voor microscopie en om celresten en dode cellen zo snel mogelijk te verwijderen. Door het ongewenste materiaal op te zuigen of weg te blazen, zullen gezonde cellen zich snel hechten aan de polylysineplaat. Plaats ongeveer 15 tot 25 cellen op elk dekglas.Wanneer alle cellen van de eerste cluster zijn gepositioneerd, wordt het bindweefsel van de tweede cluster verwijderd en wordt dezelfde procedure voor het uitplaten van de cellen voortgezet. Laat alle platen na voltooiing minimaal twee uur bij kamertemperatuur op de werkbank staan om de cellen de kans te geven zich correct te hechten, terwijl eventuele trillingen worden vermeden. Plaats de schalen vervolgens op een styrofoam of plastic dienblad en breng ze over naar een incubator van 14 graden voor verder gebruik.Meestal maken we beelden van de groeikegels één of twee dagen na het uitplaten. Voor time-lapse beelden van de dynamiek van neurale groeikegels maken we een kleine beeldkamer van twee dekglasjes die door plastic tussenstukken gescheiden zijn. De neuronen zijn aan het onderste dekglasje gehecht.Het bovenste dekglas wordt met een diamantstift korter gesneden om een eenvoudige mediumverversing mogelijk te maken. Op de microscooptafel wordt de sandwich van dekglas vervolgens in een op maat gemaakte houder geplaatst voor montage op de microscoop. Er wordt vacuümvet voor microscooptafels gebruikt om de kameronderdelen bij elkaar te houden zonder dat er medium weglekt. Met een kleine spuit wordt vacuümvet op het bovenste dekglas aangebracht; vervolgens gebruiken we een pincet om de spacers te positioneren en brengen we daarop opnieuw wat vacuümvet aan.Vervolgens pakken we de gehele assemblee op, draaien deze om en drukken deze voorzichtig op het dekglas met de cellen die nog in de schaal zijn ondergedompeld. Gebruik wattenstaafjes om de dekglazen uit te lijnen en druk het bovenste dekglas aan zonder het te breken. Daarna verwijderen we de sandwich voorzichtig uit de schaal, vegen we eventueel overtollig medium af en plaatsen we deze op de basis van de houder.Plaats de sandwich in de houder zonder het dekglas door druk te laten barsten. Reinig beide dekglazen met sparkle glasreiniger op een wattenstaafje; wij geven de voorkeur aan sparkle omdat dit minder strepen op het glas achterlaat. Reinig het dekglas met een cirkelvormige beweging vanuit het midden en volg dit direct op met een droog wattenstaafje om strepen te voorkomen.Schoon, bedekt glas is zeer belangrijk voor beeldvorming van hoge kwaliteit, vooral bij DIC-optiek. Neuronale culturen van plegia-rugcellen zijn culturen met een lage dichtheid, jadi het is zeer nuttig als uw microscoop beschikt over functies voor platshouderpositionering op de tafel voor eenvoudig schakelen tussen verschillende cellen. Nu zijn we klaar om de groei, kernmorfologie en motiliteit waar te nemen.We visualiseren de groei in morfologie en motiliteit met resolutie-rijke differential interference contrast, DIC time-lapse imaging. DIC-imaging is nuttig voor deze toepassing omdat het een bovenaanzicht biedt van de groeikegelstructuur in deze 60 XDIC time-lapse film. De drie domeinen van een typische groeikegel zijn duidelijk zichtbaar.Het perifere domein dat is opgebouwd uit actinerijke lamellipodia en filopodia. De transitiezone die wordt gekenmerkt door ruffling-activiteit en het centrale domein dat voornamelijk microtubuli en organellen bevat. Om de mechanismen van groeikegelbesturing te bestuderen, hebben we de restrained bead interaction (RBI)-assay ontwikkeld; in deze assay.Microbeads gecoat met artesine-eiwitten worden gebruikt om cellulaire doelsubstraten na te bootsen. In de DIC time-lapse movie wordt de bead met een micronaald op het perifere domein van de groeikegel geplaatst. Men kan het retrograde effect en de stroom waarnemen aan de hand van retrograden bewegende golven in het centrale domein.Organellen bewegen zich over microtubuli. Na een initiële periode waarin geen significante veranderingen optreden, is een plotselinge voorwaartse beweging van de grens van het centrale domein richting het gefixeerde kraaltje waarneembaar. In combinatie met groei van de leidende rand en een toename van de spanning kan specifiek langs de interactie-as van het kraaltje een effect van stroomverzwakking en microtubuli-extensie worden waargenomen.Om de dynamiek van het cytoskelet in groeikegels te analyseren, maken we gebruik van fluorescentie-speckelmicroscopie. We injecteren fluorescent gelabelde tubuline- en actine-probes in het neuronale cellichaam en maken time-lapse-films. Van de dynamische bewegingen van het cytoskelet wordt het in rood weergegevene actine geassembleerd langs de voorrand, retrograad getransloceerd door retrograde flow en gerecycled in de transitiezone.Dynamische microtubuli, in het groen weergegeven, verkenden de groei van de periferie door een combinatie van assemblage- en translocatiegedrag. De geringe hoeveelheid labeling resulteert in het gespikkelde patroon, waardoor we de verschillende parameters van de cytoskeletdynamiek kwantitatief kunnen analyseren. We hebben u getoond hoe u de dissectie van cellen uit de ruggenmergplexus, de kweek en de beeldvorming uitvoert als u resolutiebeelden van neuronale groeikegels wilt maken.Dit is echt het systeem om te gebruiken vanwege de grote omvang van de groeikegels, de gedefinieerde cytoplasmatische regio's en het goed beschreven cytoskelet. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

neuronal-cell-cultures-from-aplysia-for-high-resolution-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De voorbereiding van Aplysia Sensory-motor Neuronale Cell Cultures

In deze video laten we zien visualisatie van PKC translocatie in levende cellen met behulp van fluorescent gelabelde PKCS.

Live-beeldvorming van PKC Translocatie in Sf9 cellen en in Aplysia sensorische neuronen

We zien hoe veranderingen in de intracellulaire vrije calciumconcentratie en synaptische werkzaamheid kan gelijktijdig monitoren in een ganglion bereiding...

Volgen van veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie en Synaptic werkzaamheid in de Mollusc<em&gt; Aplysia</em

Neurale Explantatie Culturen van<em&gt; Xenopus laevis</em

This video demonstrates an in vitro assessment of neuronal growth cone collapse by amyloid-β (Aβ) aggregates. Treating the neurons with Aβ aggregates causes cytoskeletal destabilization, leading to the collapse of growth cones at the tip of the axons. The treated cells are compared with control cells to assess the extent of growth cone collapse.

In Vitro Assessment of Aggregated Amyloid-&beta; on Neuronal Growth Cone Collapse

We beschrijven de ontleding van het zenuwstelsel van het mariene...

Isolatie van sensorische neuronen van<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Voor Patch Clamp Recordings van Glutamaterge Currents

Zeeslak Aplysia californica is veel gebruikt als een neurobiologisch model voor de studies op cellulaire en moleculaire basis van gedrag. Hier wordt een methodologie beschreven voor het verkennen van het zenuwstelsel van Aplysia voor de elektrofysiologische en moleculaire analyses van enkele neuronen van geïdentificeerde neurale circuits.

Aplysia Ganglia voorbereiding voor elektrofysiologische en moleculaire analyses van enkele neuronen

Deze procedure beschrijft hoe snel neurieten georganiseerd in microfluïdische kamers kunnen initiëren, verlengen en verbinden met behulp van poly-D-lysine beklede kralen die zijn bevestigd aan micropipetten die leiden tot neuriet verlenging.

Rewiring Neuronal Circuits: een nieuwe methode voor snelle neuritische verlenging en functionele neuronale verbinding

Hier beschreven we een protocol om de assemblage en structuur van de axon initiële segmenten (AIS) van hippocampale neuronen die geen vooraf geassembleerde AIS missen vanwege de afwezigheid van een gigantische ankyrine-G kwantitatief te bestuderen.

Gebruik van primaire gekweekte hippocampale neuronen om de assemblage van axon-initiële segmenten te bestuderen

Dit protocol demonstreert een eenvoudige en robuuste methode om in situ axongroei en groeikegeldynamiek te bestuderen. Het beschrijft hoe ex vivo fysiologisch relevante acute hersenplakken kunnen worden bereid en biedt een gebruiksvriendelijke analysepijplijn.

In situ Visualisatie van Axon-groei en groeikegeldynamiek in acute ex vivo embryonale hersenplakculturen

Om vooruit te komen, moeten groeikegels tractiekrachten uitoefenen tegen de externe omgeving. Het genereren van trekkrachten is afhankelijk van actinedynamiek en koppeling. De huidige studie beschrijft methoden voor het analyseren van actinedynamica, koppelingskoppeling en tractiekrachten voor groeikegelvoortgang.

Analyses van actinedynamica, koppelingskoppeling en tractiekracht voor groeiconusvooruitgang

Leer hoe je neuronale celkweken van Aplysia californica opzet voor high-resolution imaging van groeikegels. Dit protocol toont dissectie, cultuur en live cel imaging van bag cell neuronen.

Neuronale celkweken van Aplysia voor High-Resolution Imaging van Groei Cones

Meer video's verkennen