Name: In Vitro Cultuurtechnieken voor het Modelleren van Lever Organogenese, het Bouwen van Assembloids en het Ontwerpen van Synthetisch Weefsel met behulp van Menselijk Cellijnen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Leer hoe leverorganogenese wordt gemodelleerd met behulp van menselijke stamcellijnen en miniaturisatietechnieken. Deze methode ondersteunt regeneratieve geneeskunde en synthetisch weefselontwerp.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen hun oprechte dank uiten aan Ogechi Ogoke en Osama Yousef voor hun onschatbare bijdragen aan de gegevens die in dit artikel zijn gebruikt. NP werd ondersteund door de UB CBE opstartfondsen, een Mark Diamond Fellowship, de New York State Stem Cell Science C024316, het UB Stem Cells in Regenerative Medicine (ScIRM) centrum, het University at Buffalo Center for Cell, Gene, Tissue Engineering (CGTE).

De details van de reagentia en het materiaal dat in het onderzoek is gebruikt, staan vermeld in de Tabel van materialen. De afkortingen die in dit artikel worden gebruikt, worden gedefinieerd in Aanvullend bestand 1.
1. Bereiding van 1% lage elektro-endosmose (EEO) agarose-oplossing
<ol>
	<li>Weeg 2,5 g laag EEO agarosepoeder af en breng het over in een beker. 
	OPMERKING: Zorg ervoor dat de beker minstens twee keer zo groot is als het gewenste volume om bellen tijdens de bereiding van de oplossing te voorkomen.</li>
	<li>Gebruik een gemeten cilinder om 250 ml gedistilleerd water af te meten en giet het in de beker, met als doel een uiteindelijke concentratie (w/v) van 1%.</li>
	<li>Bedek de opening van de beker met plasticfolie en laat een klein gaatje voor ventilatie. Verwarm de beker 30 s in de magnetron.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig de beker en slinger de inhoud. Herhaal dit proces elke 30 s tot volledige oplossing. 
	VOORSICHT: Gebruik voorzichtigheid bij het hanteren van in de magnetron verwarmd glaswerk en gebruik de juiste handschoenen. Houd de oplossing nauwlettend in de gaten om oververhitting of overkoken te voorkomen.</li>
	<li>Zodra een homogene oplossing is bereikt, verwijder de beker uit de magnetron. Zwaai voorzichtig met de oplossing voordat je deze overbrengt naar een voorgesteriliseerde fles. Autoclaveer de oplossing en bewaar de agarose-oplossing bij kamertemperatuur (RT) tot het klaar is om te gebruiken.</li>
</ol>
2. Coating 96-well plate
OPMERKING: 384-well ultra-laag gehechte sferische microplates kunnen worden gebruikt in deze en verdere experimenten.
<ol>
	<li>Maak de dop los van de fles met de steriele 1% agarose-oplossing. Verwarm de oplossing in de magnetron in intervallen van 30 s totdat deze overgaat in de vloeibare fase; draai dan de dop vast. 
	VOORSICHT: Gebruik voorzichtigheid bij het hanteren van in de magnetron verwarmd glaswerk en gebruik de juiste handschoenen. Houd de oplossing nauwlettend in de gaten om oververhitting of overkoken te voorkomen. 
	OPMERKING: Voer deze stappen uit onder een steriele weefselkweek-laminaire stroomkap.</li>
	<li>Breng 55-65 µL van de 1% agarose-oplossing per putje over om de 96-well weefselkweekplaat te coaten en draai onmiddellijk de plaat.</li>
	<li>Zodra de 1% agarose-oplossing is overgebracht naar het gewenste aantal putjes, plaats de platen 20-30 min in een koelkast van 4 °C om de agarose te laten stollen. Breng de plaat voor gebruik naar kamertemperatuur (Figuur 1A).</li>
</ol>
3. Bereiding van HEP sferen
<ol>
	<li>Kweek HepG2-WT cellen in een T-75 kolf met gebruik van compleet groeimedium (cDMEM) bestaande uit Dulbecco's Aangepast Eagle Medium (DMEM), aangevuld met 10% Foetaal Rund Serum (FBS) en 1% Penicilline-Streptomycine (Pen-Strep). Houd de celkweek op 37 °C en 5% CO2, waarbij het groeimedium dagelijks wordt ververst.</li>
	<li>Bij het bereiken van 80% confluentie, spoel de cellen af met 1x fosfaat-gebufferd zout (PBS) en gooi de spoeling weg. Voeg 5 mL van 0,05% Trypsin-EDTA toe aan de kolf en incubeer op 37 °C en 5% CO2 gedurende 5-10 min.</li>
	<li>Voeg gelijke hoeveelheden cDMEM toe en spoel de cellen van de kolf. Zodra de cellen loslaten, breng de mengsel over naar een steriele conische centrifugeerbuis van 15 mL en centrifugeer de celsuspensie bij 300 x g gedurende 5 min bij RT. 
	OPMERKING: Alle centrifugatie stappen die in dit protocol zijn beschreven, werden uitgevoerd bij kamertemperatuur (RT). Deze centrifugatie procedures kunnen echter ook worden uitgevoerd bij koude temperaturen.</li>
	<li>Re-suspendeer de celsuspensie in verse cDMEM en tel de cellen om de uiteindelijke concentratie in cellen/mL te bepalen (Figuur 1B).</li>
	<li>Verven van de cellen 
	OPMERKING: Dit is een optionele stap.
	<ol>
		<li>Breng de gewenste hoeveelheid celsuspensie over naar een steriele conische centrifugeerbuis van 15 mL en centrifugeer de celsuspensie bij 300 x g gedurende 5 min.</li>
		<li>Re-suspendeer het cellenpellet in een serumvrij groeimedium om een uiteindelijke concentratie van 1,0 x 106 cellen/mL te bereiken. Voeg 5 µL van fluorescente cel-labeling oplossing toe per mL van de celsuspensie en incubeer de celsuspensie bij 37 °C en 5% CO2 tijdens rotatie gedurende 20 min. 
		OPMERKING: Het serumvrije groeimedium is DMEM en wordt alleen aangevuld met 1% pen-strep. Pas de incubatietijd aan voor uniforme kleuring op basis van de dichtheid van de celsuspensie.</li>
		<li>Zodra de incubatie is voltooid, centrifugeer de celsuspensie bij 450 x g gedurende 5 min en re-suspendeer het cellenpellet in verse cDMEM. Herhaal dit wasproces nog twee keer (Figuur 1C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sfeervorming
	<ol>
		<li>Suspendeer de cellen in verse cDMEM om een uiteindelijke concentratie van 5,0 x 104 cellen/mL te bereiken op basis van het celtelling. Meng de celsuspensie goed en breng 100 µL van de celsuspensie per putje over naar de agarose-gecoate 96-well plaat. 
		OPMERKING: De dichtheid van de celsuspensie is ingesteld om 5.000 cellen per putje te bereiken in de agarose-gecoate 96-well plaat. Voor het gebruik van 384-well platen, worden cellen in suspensie gebracht op een uiteindelijke concentratie

Assembloid Technology: Pioneering Liver Development Research

<ol><li>Bort, R., Signore, M., Tremblay, K., Martinez Barbera, J. P., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hex+homeobox+gene+controls+the+transition+of+the+endoderm+to+a+pseudostratified%2C+cell+emergent+epithelium+for+liver+bud+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Hex homeobox gene controls the transition of the endoderm to a pseudostratified, cell emergent epithelium for liver bud development.</a> Dev Biol. 290 (1), 44-56 (2006).</li>
<li>Gualdi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+specification+of+the+gut+endoderm+in+vitro%3A+Cell+signaling+and+transcriptional+control%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Hepatic specification of the gut endoderm in vitro: Cell signaling and transcriptional control.</a> Genes Dev. 10 (13), 1670-1682 (1996).</li>
<li>Ogoke, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+imaging+and+analysis+of+mouse+and+human+liver+bud+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal imaging and analysis of mouse and human liver bud morphogenesis.</a> Dev Dyn. 251 (4), 662-686 (2022).</li>
<li>Ogoke, O., Oluwole, J., Parashurama, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+considerations+in+liver+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Eng%22%5BJournal%5D)">Bioengineering considerations in liver regenerative medicine.</a> J Biol Eng. 11, 46(2017).</li>
<li>Petkov, P. M., Kim, K., Sandhu, J., Shafritz, D. A., Dabeva, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+differentially+expressed+genes+in+epithelial+stem%2Fprogenitor+cells+of+fetal+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Identification of differentially expressed genes in epithelial stem/progenitor cells of fetal rat liver.</a> Genomics. 68 (2), 197-209 (2000).</li>
<li>Yang, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+the+independent+effect+of+twist+and+snail+in+promoting+metastasis+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of the independent effect of twist and snail in promoting metastasis of hepatocellular carcinoma.</a> Hepatology. 50 (5), 1464-1474 (2009).</li>
<li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+and+integration+of+transplanted+hepatocytes+in+rat+liver+plates+occur+by+disruption+of+hepatic+sinusoidal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Entry and integration of transplanted hepatocytes in rat liver plates occur by disruption of hepatic sinusoidal endothelium.</a> Hepatology. 29 (2), 509-519 (1999).</li>
<li>Koenig, S., Stoesser, C., Krause, P., Becker, H., Markus, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+repopulation+after+hepatocellular+transplantation%3A+Integration+and+interaction+of+transplanted+hepatocytes+in+the+host%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Liver repopulation after hepatocellular transplantation: Integration and interaction of transplanted hepatocytes in the host.</a> Cell Transplant. 14 (1), 31-40 (2005).</li>
<li>Rajvanshi, P., Kerr, A., Bhargava, K. K., Burk, R. D., Gupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+liver+repopulation+using+the+dipeptidyl+peptidase+iv-deficient+rat+and+other+rodent+recipients%3A+Cell+size+and+structure+relationships+regulate+capacity+for+increased+transplanted+hepatocyte+mass+in+the+liver+lobule%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Studies of liver repopulation using the dipeptidyl peptidase iv-deficient rat and other rodent recipients: Cell size and structure relationships regulate capacity for increased transplanted hepatocyte mass in the liver lobule.</a> Hepatology. 23 (3), 482-496 (1996).</li>
<li>Matchett, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+decoding+of+human+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Multimodal decoding of human liver regeneration.</a> bioRxiv. , 10.1101/2023.02.24.529873 2023.2002.2024.529873 (2023).</li>
<li>Matsumoto, K., Yoshitomi, H., Rossant, J., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+organogenesis+promoted+by+endothelial+cells+prior+to+vascular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Liver organogenesis promoted by endothelial cells prior to vascular function.</a> Science. 294 (5542), 559-563 (2001).</li>
<li>Sosa-Pineda, B., Wigle, J. T., Oliver, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+migration+during+liver+development+requires+prox1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte migration during liver development requires prox1.</a> Nat Genet. 25 (3), 254-255 (2000).</li>
<li>Suzuki, A., Sekiya, S., Büscher, D., Izpisúa Belmonte, J. C., Taniguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tbx3+controls+the+fate+of+hepatic+progenitor+cells+in+liver+development+by+suppressing+p19ARF+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tbx3 controls the fate of hepatic progenitor cells in liver development by suppressing p19ARF expression.</a> Development. 135 (9), 1589-1595 (2008).</li>
<li>Rossi, J. M., Dunn, N. R., Hogan, B. L., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mesodermal+signals%2C+including+BMPs+from+the+septum+transversum+mesenchyme%2C+are+required+in+combination+for+hepatogenesis+from+the+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Distinct mesodermal signals, including BMPs from the septum transversum mesenchyme, are required in combination for hepatogenesis from the endoderm.</a> Genes Dev. 15 (15), 1998-2009 (2001).</li>
<li>Ng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+actopaxin+impairs+hepatocellular+carcinoma+metastasis+through+modulation+of+cell+migration+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Suppression of actopaxin impairs hepatocellular carcinoma metastasis through modulation of cell migration and invasion.</a> Hepatology. 58 (2), 667-679 (2013).</li>
<li>Fransvea, E., Angelotti, U., Antonaci, S., Giannelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+transforming+growth+factor-beta+up-regulates+e-cadherin+and+reduces+migration+and+invasion+of+hepatocellular+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Blocking transforming growth factor-beta up-regulates e-cadherin and reduces migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells.</a> Hepatology. 47 (5), 1557-1566 (2008).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+silencing+of+c-myc+inhibits+cell+migration%2C+invasion%2C+and+proliferation+in+hepg2+human+hepatocellular+carcinoma+cell+line%3A+C-myc+silencing+in+hepatocellular+carcinoma+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">RNAi silencing of c-myc inhibits cell migration, invasion, and proliferation in hepg2 human hepatocellular carcinoma cell line: C-myc silencing in hepatocellular carcinoma cell.</a> Cancer Cell Int. 13 (1), 23(2013).</li>
<li>Fitamant, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yap+inhibition+restores+hepatocyte+differentiation+in+advanced+HCC%2C+leading+to+tumor+regression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Yap inhibition restores hepatocyte differentiation in advanced HCC, leading to tumor regression.</a> Cell Rep. 10 (10), 1692-1707 (2015).</li>
<li>Xue, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goosecoid+promotes+the+metastasis+of+hepatocellular+carcinoma+by+modulating+the+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Goosecoid promotes the metastasis of hepatocellular carcinoma by modulating the epithelial-mesenchymal transition.</a> PLoS One. 9 (10), e109695(2014).</li>
<li>Biname, F., Lassus, P., Hibner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor+beta+controls+the+directional+migration+of+hepatocyte+cohorts+by+modulating+their+adhesion+to+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor beta controls the directional migration of hepatocyte cohorts by modulating their adhesion to fibronectin.</a> Mol Biol Cell. 19 (3), 945-956 (2008).</li>
<li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-338-3p+inhibits+epithelial-mesenchymal+transition+and+metastasis+in+hepatocellular+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">MiR-338-3p inhibits epithelial-mesenchymal transition and metastasis in hepatocellular carcinoma cells.</a> Oncotarget. 8 (42), 71418-71429 (2017).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-1301+inhibits+hepatocellular+carcinoma+cell+migration%2C+invasion%2C+and+angiogenesis+by+decreasing+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+through+targeting+BCL9%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">MiR-1301 inhibits hepatocellular carcinoma cell migration, invasion, and angiogenesis by decreasing Wnt/beta-catenin signaling through targeting BCL9.</a> Cell Death Dis. 8 (8), e2999(2017).</li>
<li>Zeng, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRNA-135a+promotes+hepatocellular+carcinoma+cell+migration+and+invasion+by+targeting+forkhead+box+o1%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">MiRNA-135a promotes hepatocellular carcinoma cell migration and invasion by targeting forkhead box o1.</a> Cancer Cell Int. 16, 63(2016).</li>
<li>Ogoke, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+the+niche+and+transcription+trigger+early+murine+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+liver+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in the niche and transcription trigger early murine and human pluripotent stem cell-derived liver organogenesis.</a> bioRxiv. , 10.1101/2022.07.24.501313 (2023).</li>
<li>Ogoke, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+liver+organogenesis+by+recreating+three-dimensional+collective+cell+migration%3A+A+role+for+TGF-beta+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Modeling liver organogenesis by recreating three-dimensional collective cell migration: A role for TGF-beta pathway.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 621286(2021).</li>
<li>Kanton, S., Pasca, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+assembloids%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Human assembloids.</a> Development. 149 (20), dev201120 (2022).</li>
<li>Bayley, H., Cazimoglu, I., Hoskin, C. E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Top+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Synthetic tissues.</a> Emerg Top Life Sci. 3 (5), 615(2019).</li>
</ol>

NP is de oprichter van Khufu Therapeutics, een organoïd engineering bedrijf dat behandelingen ontwikkelt voor acute en chronische leverziekte.

Het huidige protocol omvat meerdere methoden voor het cultiveren van zowel eenvoudige als complexe assembloids, evenals technieken voor het induceren van 3D collectieve celmigratie in vroege leverorganogenese24,25. De beschreven protocollen benadrukken verschillende kritieke stappen, waarbij de vorming van sfeervormige structuren (spheroids) een centraal aspect is in alle methodologieën. Microputjes (96- of 384-putjes) worden gebruikt met niet-adhesieven of met a...

Levercelmigratie speelt een belangrijke rol bij leverorganogenese, ziekte en celtherapie. Tijdens leverorganogenese (E8,5-9,0, muis) begint het ventrale voordarm pre-hepatische epitheel levergenen te gaan expresseren als gevolg van inductief signaal dat uitgaat van het omringende mesenchym en hart. Op E9,0 verdik het voordarm epitheel als de cellen overgaan van een kuboïdale naar een pseudostratificeerde kolomvormige morfologie, waardoor het leverdivertikel wordt gevormd1,2. Op dit kritieke stadium bestaat het leverdivertikel uit slechts ~1.500 cellen. Vervolgens verdik het hepatische endoderm dat het leverdivertikel bekleedt, delamineert en vormt koorden van migrerende hepatoblasten (HB's). Deze HB's co-migreren met endotheelcellen en mesenchymale cellen, vertakken zich in het omringende mesenchymale weefsel en initiëren driedimensionale collectieve celmigratie om de leverknop te vormen3,4. In feite ondergaan cellen tijdens dit stadium gezamenlijk (1) co-migratie, of beweging samen met andere celtypen, (2) vertakkingsmorfogenese of vorming van vertakkende buisvormige structuren, en (3) interstitiële migratie, of migratie bovenop of tussen andere cellen. Tegen E11,5 stopt de migratie en is de primitieve lever gevormd, uitbreidend met 103 keer3. Levercelmigratie kan ook vereist zijn in latere stadia van leverorganogenese, aangezien expressie van rattenfoetale HB's bewijs heeft gegeven van sterk opgereguleerde genen geassocieerd met 3D collectieve celmigratie, morfogenese en remodellering van de extracellulaire matrix5. Naast zijn rol in vroege leverorganogenese, is 3D collectieve migratie nauw verbonden met de lokale verspreiding en metastase van gevorderd hepatocellulair carcinoom (HCC), wat uiteindelijk leidt tot een verslechterde prognose en verhoogde behandelingsresistentie6. Volwassen en foetale hepatocyten gebruiken ook collectieve migratie bij het bewegen van de milt naar binnen in de lever tijdens leverherbevolking. In vivo beeldvormingsstudies hebben aangetoond dat getransplanteerde hepatocyten binnen enkele uren de poortader binnengaan en vervolgens de capillairen, waarbij ze migreren door de lever sinusoïden en door het leverweefsel7,8,9. Ten slotte tonen recente studies aan dat migrerende HB's zich voordoen tijdens leverregeneratie bij muizen en mensen, met enig bewijs van beweging in vellen10. Al met al speelt levercollectieve migratie, die in staat is tot meerdere modi van morfogenese, een belangrijke rol bij organogenese, kanker, hepatocytcellentherapie en leverregeneratie.
Talrijke genetische studies hebben de moleculaire paden onderzocht die ten grondslag liggen aan 3D collectieve levercelmigratie. Deze studies onthullen dat de afwezigheid van leverkoorden de levervorming belemmert, wat de noodzaak onderstreept van leverkoordvorming en hun interacties met ondersteunende cellen voor levervorming1,11,12,13. Deze studies tonen ook aan dat levergroei wordt geïnitieerd door verschillende factoren, waaronder FGF-2 uitgescheiden door het cardiale mesoderm, BMP4 uitgescheiden door het omringende mesenchym, HGF en interacties met endotheelcellen. Daarnaast spelen transcriptiefactoren geassocieerd met migratie, waaronder HEX, PROX1 en TBX3, cruciale rollen2,14. Concluderend bieden genetische studies bewijs dat oplosbare factorsignalering, die leidt tot transcriptiefactorexpressie, migratie, signalering en moleculaire interacties tussen HB's en hun omringende mesenchym aandrijft.
Hoewel celmigratie in de vroege leverorganogenese uitgebreid is onderzocht, gebruiken huidige in vitro studies van hepatische migratie vaak 2D-assays met zeer migrerende HCC-cellen naast in vivo tumormodellen15. Deze studies hebben inzicht gegeven in verschillende factoren die de hepatische migratie beïnvloeden, waaronder TGFβ-116, c-Myc17, YAP18, goosecoid19, actopaxin20 en miRNA's21,22,23. Hoewel er opmerkelijke vooruitgang is geboekt in het begrijpen van de moleculaire mechanismen in 3D hepatische celmigratie, suggereren de duidelijke verschillen tussen 2D en 3D cellulaire migratie dat 2D-assays inherente beperkingen hebben. Bovendien missen deze modellen vaak de inbedding van mesenchymale celtypen, die essentieel zijn voor zowel migratie als groei. Hoewel er vooruitgang is geboekt in de ontwikkeling van 3D-modellen voor levermigratie die het ondersteunende mesenchym integreren, leggen deze modellen voornamelijk de nadruk op co-migratie in plaats van het onderzoeken van de verschillende modi van collectieve migratie.
Het vermogen om weefsels te genereren uit sferoïden via verschillende zelfassemblage- en morfogenetische processen vergemakkelijkt de wetenschappelijke verkenning van synthetische weefsels. Deze weefsels hebben brede toepassingen in medicijnontwikkeling en -screening, ziektemodellering, therapie en andere biomedische en biotechnologietoepassingen. De methodologische details van verschillende 3D in vitro cultivatiesystemen die zijn ontworpen om verschillende modi van lever 3D collectieve migratie te vertonen, worden gegeven. Deze systemen omvatten (1) co-sferoïdcultuur met HEP en MES sferoïden in een matrix, (2) HEP sferoïdmatrix druppel gekweekt met M-CM, (3) HEP-MES gemengde sferoïden en (4)

<table><tbody><tr><td>384-well Black/Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Spheroid Microplate</td><td>Corning</td><td>3830</td><td></td></tr><tr><td>96-wl Cell Culture Plate Flat,TC,STRL,1/pk,100/CS</td><td>Laboratory Products Sales</td><td>701001</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0576</td><td>Low EEO</td></tr><tr><td>Axiovision Software</td><td>ZEISS</td><td></td><td>versie 4</td></tr><tr><td>Cell Culture Dish, 60mm, TC, STRL, 20/pk, 500/CS</td><td>Laboratory Products Sales</td><td>705001</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Flask,175cm&sup2;, Vent,TC,STRL,5/pk,40/CS</td><td>Laboratory Products Sales</td><td>709003</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Flask,75cm&sup2;, Vent,TC,STRL,5/pk,100/CS</td><td>Laboratory Products Sales</td><td>708003</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Tubes, 15mL,PP,STRL,grad,50/bg,500/CS</td><td>Laboratory Products Sales</td><td>L226010</td><td></td></tr><tr><td>Collagen I, Rat Tail, 100 mg</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, hoge glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10569010</td><td></td></tr><tr><td>EVOS Fluorescent, fasecontrastmicroscoop</td><td>EVOS</td><td>AMEFC4300R</td><td>1.360 x 1.024 pixeldichtheid</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, gekwalificeerd, Verenigde Staten</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen uit humaan plasma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4883-500MG</td><td>500 mg</td></tr><tr><td>Hep G2 [HEPG2]</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>HERAcell vios 160i</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51033557</td><td></td></tr><tr><td>HFF-1</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1041</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>IJ1.46r; https://imagej.net/ij/</td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-vrij, 10 mL</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>MRC-5</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>MSCGMT Human Mesenchymal Stem Cell Growth BulletKit</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Thrombine uit humaan plasma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6884-100UN</td><td>100 eenheden</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,05%), fenolrood</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25%), fenolrood</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiD Cell-Labeling Solution</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22887</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiI Cell-Labeling Solution</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22885</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiO Cell-Labeling Solution</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22886</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio fluorescentiemicroscoop</td><td>ZEISS</td><td></td><td>SE64, 1.344 &times; 1.024 pixeldichtheid</td></tr></tbody></table>

in vitro cultuurtechnieken voor het modelleren van lever organogenese, het bouwen van assembloids en het ontwerpen van synthetisch weefsel met behulp van menselijk cellijnen

In Vitro Cultivation Techniques for Modeling Liver Organogenesis, Building Assembloids, and Designing Synthetic Tissues using Human Cell Lines

Chronische leverziekte heeft epidemische proporties bereikt en treft wereldwijd meer dan 800 miljoen mensen. De huidige behandeling, orthotopische levertransplantatie, heeft verschillende beperkingen. Er zijn veelbelovende oplossingen opgedoken op het gebied van regeneratieve levergeneeskunde, waarbij de ontwikkeling van de lever (organogenese) een groot potentieel heeft. Vroege leverorganogenese, die plaatsvindt tussen E8.5 en 11.5, omvat de vorming van epitheel-mesenchymale interacties die leiden tot morfogenese, leverkoordvorming en collectieve migratie. Er is echter een gebrek aan methoden voor in vitromodellering van dit proces. In deze studie wordt een gedetailleerde reeks methoden gepresenteerd die de modellering van verschillende stadia en aspecten van leverorganogenese mogelijk maken met behulp van menselijke cellijnen. In één methodereeks wordt assembloïdtechnologie met hepatische (HEP) en mesenchymale (MES) sferoïden gebruikt, waarbij vroege structuren die in leverorganogenese worden aangetroffen, worden gerepliceerd, vroege morfogenese wordt gemodelleerd en interstitiële celmigratie wordt gedemonstreerd zoals in vivo wordt waargenomen. Deze innovatieve assembloïdsystemen helpen bij het identificeren van factoren die de vorming en migratie van assembloïden beïnvloeden. Ook werden HEP-sferoïdekweeksystemen gebruikt om collectieve migratie en vertakkingsmorfogenese te modelleren. Mesenchymaal-geconditioneerd medium (M-CM) speelt een belangrijke rol bij het initiëren van dosisafhankelijke vertakkingsmigratie. Alle gepresenteerde methoden bleken zeer reproduceerbaar te zijn met een hoge succesratio. Door deze gebeurtenissen aan elkaar te koppelen, zal ons werk het mogelijk maken sequentiële, morfogenetische gebeurtenissen na te bootsen om organogenese in vitro en in vivo te reverse engineeren.

De interesse in synthetische weefsels voor diverse biomedische toepassingen, zoals ziektemodellering, geneesmiddelenontwikkeling en tissue engineering (Figuur 7), neemt toe. Binnen dit vakgebied worden organoïden, sferoïden en cellen afgeleid van humane pluripotente stamcellen (hPSC) getransformeerd tot meer synthetische, complexe en grotere weefsels. Deze transformatie omvat de toepassing van principes van morfogenese, het gebruik van instrumenten zoals microfabricage en de integratie van b...

Organoïden revolutioneren gepersonaliseerde weefselmodellering voor orgaanontwikkeling, medicijnontdekking en ziekteonderzoek. De voortgang in organoïdengineering leidt tot het creëren van ingewikkelde synthetische weefsels. Het doel is om morfogenese, assembloïdtechnologie en biomatrices te integreren om weefselengineering te bevorderen. Dit protocol helpt bij het modelleren van leverorganogenese en het vaststellen van richtlijnen voor de constructie van synthetisch weefsel.

In Vitro Cultuurtechnieken voor het Modelleren van Lever Organogenese, het Bouwen van Assembloids en het Ontwerpen van Synthetisch Weefsel met behulp van Menselijk Cellijnen

Chronic liver disease has reached epidemic proportions, affecting over 800 million people globally. The current treatment, orthotopic liver ...

in-vitro-cultivation-techniques-for-modeling-liver-organogenesis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Dit artikel zal zich richten op het genereren van humane lever endoderm van menselijke embryonale stamcellen populaties.

Robuuste Generatie van hepatocyt-achtige cellen uit menselijke embryonale stamcellen Populaties

Er wordt een techniek beschreven om menselijke hepatocyten en niet-parenchymale levercellen van dezelfde donor te isoleren. De verschillende leverceltypen vormen de basis voor functionele levermodellen en weefselengineering. Deze nieuwe methode streeft ernaar om levercellen met een hoge opbrengst en levensvatbaarheid te isoleren.

Protocol voor isolatie van primaire menselijke hepatocyten en Overeenkomstige Major Populaties van niet-parenchymale Liver Cells

Deze procedure werd vastgesteld om te worden gebruikt voor de ontwikkeling van geavanceerde 3D-leverculturen in vitro, die een meer fysiologisch relevante beoordeling kunnen bieden van de genotoxische gevaren die gepaard gaan met blootstelling aan nanomaterialen gedurende zowel acute als langdurige, herhaalde dosisschema's.

Geavanceerde 3D-levermodellen voor in vitro genotoxiciteitstests na langdurige blootstelling aan nanomaterialen

Dit protocol presenteert een 3D biomimetisch model met bijbehorend fibrotisch stromaal compartiment. Bereid met fysiologisch relevante hydrogels in verhoudingen die de biofysische eigenschappen van de stromale extracellulaire matrix nabootsen, een actieve bemiddelaar van cellulaire interacties, tumorgroei en uitzaaiingen.

Een biomimetisch model voor leverkanker om tumor-stroma-interacties te bestuderen in een 3D-omgeving met afstembare bio-fysische eigenschappen

Een langdurig ex vitro 3D-organoïde kweeksysteem werd opgezet uit muizenhepatocyten. Deze organoïden kunnen worden gepasseerd en genetisch gemanipuleerd door lentivirusinfectie van shRNA / ectopische constructie, siRNA-transfectie en CRISPR-Cas9-engineering.

Vaststelling en genetische manipulatie van Murine Hepatocyte Organoïden

Dit protocol beschrijft het genereren van snelle en reproduceerbare endodermale leverorganoïden (eHEPO's). Met dit protocol kunnen eHEPO's binnen 2 weken worden geproduceerd en op lange termijn (meer dan 1 jaar) worden uitgebreid zonder hun differentiatie en functionaliteit te verliezen.

Genereren van functionele endodermale leverorganoïden

We bieden een uitgebreid overzicht en verfijning van bestaande protocollen voor de vorming van hepatocellulair carcinoom (HCC), die alle stadia van de organoïdeteelt omvatten. Dit systeem dient als een waardevol model voor de identificatie van potentiële therapeutische doelwitten en de beoordeling van de effectiviteit van kandidaat-geneesmiddelen.

Ontwikkeling en optimalisatie van een humaan hepatocellulair carcinoom-patiënt-afgeleid organoïdemodel voor potentiële doelidentificatie en ontdekking van geneesmiddelen

Deze studie introduceert een geautomatiseerde methode om van patiënten afgeleide glioblastoom 3-dimensionale organoïden te genereren met behulp van een weefselhakselaar. De methode biedt een geschikte en effectieve aanpak om dergelijke organoïden te verkrijgen voor therapeutisch onderzoek.

Ex vivo van patiënten afkomstige glioomorganoïden kweken met behulp van een weefselhakselaar

Recente technische ontwikkelingen maakten de grootschalige productie mogelijk van een in vitro platform voor toepassingen op het gebied van geneesmiddelmetabolisme en toxiciteit. Een volledig menselijk 2D+ leversysteem (TV2D+) levert fysiologisch relevante resultaten met behulp van traditionele tweedimensionale kweekmethoden. Dit protocol ondersteunt eindgebruikers bij de installatie, het onderhoud en de toepassing van het systeem.

Een volledig menselijk leverkweeksysteem voor toepassingen bij de ontwikkeling van geneesmiddelen

Dit protocol presenteert een geoptimaliseerde tweestaps collagenase-leverperfusietechniek in een rattenmodel en toont het gebruik van geïsoleerde hepatocyten voor in vitro langdurige kweek van 3D-organoïden.

Perfusie van rattenlever en isolatie van primaire hepatocyten: een oude procedure die cruciaal is voor geavanceerde 3D-organoïdencultuur

Leer hoe leverorganogenese wordt gemodelleerd met behulp van menselijke stamcellijnen en miniaturisatietechnieken. Deze methode ondersteunt regeneratieve geneeskunde en synthetisch weefselontwerp.

In Vitro Cultuurtechnieken voor het Modelleren van Lever Organogenese, het Bouwen van Assembloids en het Ontwerpen van Synthetisch Weefsel met behulp van Menselijk Cellijnen (Video) | JoVE Journal

In Vitro Cultuurtechnieken voor het Modelleren van Lever Organogenese, het Bouwen van Assembloids en het Ontwerpen van Synthetisch Weefsel met behulp van Menselijk Cellijnen

Meer video's verkennen