Name: Isolatie van primaire müllercellen van de retinale glia van muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-30T12:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 39 s
Description: Leer de isolatie van primaire Müller-cellen uit muizenretina's voor onderzoek naar retinale glia en ziekteprocessen. Deze methode ondersteunt studies naar neuronale gezondheid en therapeutische doelwitten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het National Eye Institute (NEI), het National Eye Institute (NEI) fonds R01 EY029751-04. We willen graag Dr. Sylvia B. Smith erkennen, aangezien dit protocol een aangepaste versie is op basis van haar protocol van Müller-celisolatie.

Alle experimenten met dieren voldeden aan de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en oogheelkundig onderzoek en werden uitgevoerd volgens ons dierprotocol dat is goedgekeurd door het Institute for Animal Care and Use Committee (IACUC) en het beleid van Oakland University (protocolnummer 2022-1160)
1. Voorbereiding van media en oplossing
<ol><li>Bereid Müller cell oogoplossing door het Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM, details in de materiaaltabel) aan te vullen met penicilline/streptomycine in een verdunning van 1:1000. Voeg bijvoorbeeld voor 10 ml DMEM 10 μl penicilline/streptomycine toe. OPMERKING: Dit is een eenvoudig serumvrij medium dat is bereid. Verwarm ook het volledige medium in een waterbad van 37 °C voordat u het gebruikt voor celkweekwerk.</li>
	<li>Bereid volledige primaire Müller-celgroeimedia voor door DMEM aan te vullen met 10% foetaal runderserum (FBS, warmte-geïnactiveerd) en 1% penicilline/streptomycine. Bijvoorbeeld (500 ml DMEM-media + 50 ml FBS + 5 ml penicilline/streptomycine).</li>
	<li>Bereid een 0,05% trypsine-EDTA-oplossing met collagenase IV in een concentratie van 200 E/ml (trypsine-EDTA wordt gebruikt om de berekende hoeveelheid collagenase IV-poeder op te lossen om de benodigde concentratie te bereiken).</li>
</ol>2. Enucleatie
<ol><li>Euthanaseer de muis ethisch door CO2 -inhalatie volgens de IACUC-richtlijnen.<ol><li>Plaats het dier of de dieren in de CO2 -kamer om 100% CO2 te introduceren met een vulsnelheid van 30-70% van de kamer vol/min met CO2 om het doel van snelle bewusteloosheid binnen 2-3 minuten te bereiken met minimaal ongemak voor de muizen.</li>
		<li>Aangezien muizen op jonge leeftijd zijn (~10 dagen), voert u cervicale dislocatie uit als secundaire methode om een goede euthanasie te garanderen.</li>
	</ol></li>
	<li>Nadat u het werkgebied met 70% ethanol hebt gesteriliseerd, plaatst u de muis op een steriel onderkussen.</li>
	<li>Trek de ogen door de armen van het pincet aan de achterkant van het oog te plaatsen, voorzichtig uit het ooggebied te trekken en de ogen te verwijderen door druk uit te oefenen met een pincet in 5/45-stijl op het oogkas om proptosis te veroorzaken. OPMERKING: Steriliseer de dissectie-instrumenten met 70% ethanol, gevolgd door fosfaatbufferzoutoplossing voorafgaand aan de dissectie.</li>
	<li>Zorg ervoor dat de oogzenuw nog steeds verbonden is met het oog door het oog langzaam te enucleeren. Zorg ervoor dat u de oogzenuw (visueel herkenbaar als een wit koord) achter het oog trekt. OPMERKING: Deze stap hoeft niet onder een microscoop te worden uitgevoerd en kan op een gesteriliseerde bank worden uitgevoerd.</li>
</ol>3. Behandeling van de ontkernde ogen
<ol><li>Dek een centrifugebuisje van 15 ml af met aluminiumfolie en vul het buisje met 10 ml van de Müller cell oogoplossing.</li>
	<li>Plaats de ontlede ogen in de tube van 15 ml met Müller-cel oogoplossing en laat ze een nacht, of ongeveer 18 uur, op kamertemperatuur staan.</li>
	<li>Decanteer na 18 uur de oogoplossing en spoel de ogen kort met 2-3 ml verwarmde (37 °C) fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
	<li>Decanteer de PBS en verplaats de ogen naar een petrischaaltje van 100 mm met 10 ml trypsineoplossing. (opgesteld in stap 1.3). OPMERKING: Trypsine wordt gebruikt op het hele ontkernde oog en werkt als een dissociatief middel om de celscheiding van de retinale lagen tijdens dissectie te vergemakkelijken. Het ontlede netvlies heeft veel cellen, waaronder RPE-cellen, die plakkerig zijn en hoogstwaarschijnlijk de Müller-celcultuur besmetten14. Microscopisch onderzoek toonde duidelijk aan dat RPE-cellen na 5 dagen isolatie (tijdens de eerste mediawissel) loskwamen van de plaat en stierven13. Het medium dat wordt gebruikt voor RPE-isolatie is DMEM/F-12, met een andere samenstelling dan DMEM (gebruikt bij de isolatie van Müller-cellen), dat natriumpyruvaat en lage glucose bevat.</li>
	<li>Plaats de schaal in een broedmachine en incubeer gedurende 1,5 tot 2 uur bij 37 °C en 5% CO2 .</li>
	<li>Breng de ogen na het broeden over in een petrischaaltje van 60 mm met ongeveer 5 ml volledig primair Müller-celgroeimedium.</li>
</ol>4. Ontleding
NOTITIE: Deze procedure moet worden uitgevoerd in de steriele omgeving van de kweekkap. Daarom is het essentieel om de kapoppervlakken grondig te steriliseren met 70% alcohol, samen met alle gereedschappen en de dissectiemicroscoop. Het is vermeldenswaard dat de video buiten de motorkap is opgenomen voor een betere zichtbaarheid en duidelijkere demonstratiedoeleinden.
<ol><li>Plaats een klein stukje gesteriliseerd weefsel van laboratoriumkwaliteit in de schaal om de ogen tijdens de dissectie te helpen stabiliseren. Plaats de ogen onder een ontleedmicroscoop om de dissectie te starten. OPMERKING: Het gebruik van weefsel van laboratoriumkwaliteit vergemakkelijkt het manoeuvreren van de ogen in een met vloeistof gevulde schaal (volledige media), waardoor een nauwkeurige dissectie wordt gegarandeerd.</li>
	<li>Gebruik een Vannas-schaar en een pincet in M5S-stijl om het bindweefsel, de extraoculaire spieren en de oogzenuw te verwijderen.<ol><li>Pak het oog vast met een pincet in M5S-stijl en maak een incisie in het ora serrata-gedeelte met een Vannas-schaar of een naald van een spuit. OPMERKING: Er is een lichtblauwe cirkelvormige lijn tussen het voorste en achterste deel van het oog, ora serrata genaamd, die kan worden gebruikt als een oriëntatiepunt voor nauwkeurige richting tijdens dissectie.</li>
		<li>Pak de incisie vast met een pincet in M5S-stijl en trek of scheur het hoornvlies uit het achterste deel van het oog. Trek in kleine stappen om ervoor te zorgen dat de integriteit van het netvlies intact blijft. OPMERKING: Deze stappen zijn bedoeld om het voorste deel van het oog (hoornvlies, iris en lens) uit het achterste deel van de oogschelp (neurale en gepigmenteerde netvliezen) te verwijderen.</li>
		<li>Om de integriteit van de retinale lagen te behouden, trekt u voorzichtig en verwijdert u het retinaal gepigmenteerde epitheel van het neurale netvlies. Het neurale netvlies moet vrij zijn van zwarte stippen om de zuiverheid van de isolatie zoveel mogelijk te garanderen, aangezien de RPE-laag meestal plakkerig is en aan het neuronale netvlies vastzit.</li>
		<li>Snijd het ontlede neurale netvlies in kleine stukjes voordat u het op een plaat verzamelt om een homogene verspreiding van de cellen op de plaat te garanderen.</li>
	</ol></li>
	<li>Plaats de neurale netvliezen in een T25-kolf met 4 ml volledig primair Müller-celgroeimedium.</li>
	<li>Plaats de kolf ten slotte in een broedmachine en incubeer bij 37 °C en 5% CO2 .</li>
</ol>5. Kweek van primaire Müller-gliacellen
<ol><li>Verplaats de kolf gedurende 3-5 dagen niet om de celgroei te bevorderen.</li>
	<li>Vervang de media na de vijfde dag en daarna om de dag totdat de cellen voor 90% samenvloeien.</li>
</ol>6. Passatie van primaire Müller-gliacellen
<ol><li>Zuig het Müller-celkweekmedium op, gevolgd door 2 ml wash in PBS, en zuig het PBS op. Voeg 2 ml 0,25% trypsine-EDTA (1x) toe, of genoeg om het bord te bedekken.</li>
	<li>Incubeer 5-10 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Zorg ervoor dat de cellen onder de microscoop loskomen van de plaat. Verzamel vervolgens de celsuspensie en voeg 4 ml voorverwarmd (37 °C) volledig primair Müller-celgroeimedium (bereid in stap 1.2) toe aan de verzamelbuis.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 7 minuten op 300 x g. Na het opzuigen van het supernatant, resuspendeert u de pellet in 10 ml volledige primaire Müller-celgroeimedia. Omdat het aantal cellen kan variëren afhankelijk van het aantal ontleedde ogen, is het daarom beter om de cellen te tellen voordat u gaat zaaien en incuberen. De aanbevolen zaaidichtheid is 3,0 x 106 cellen in een T75-kolf. OPMERKING: Cellen kunnen tot 4-5 keer worden gepasseerd. De meest consistente experimentresultaten worden echter gevonden na 1-2 passages.</li>
</ol>7. Immunofluorescentie
OPMERKING: Gebruik het immunofluorescentieprotocol om de specificiteit van Müller-cellen te kleuren en te valideren. Hier is een kort overzicht van het immunofluorescerende protocol. Deze stap wordt uitgevoerd na de eerste passage12.
<ol><li>Zaai de cellen in een Cell Culture Chamber Slide (30.000 cellen per putje voor een kamerglaasje met 8 putjes).</li>
	<li>Kweek de geïsoleerde cellen gedurende 24-48 uur in een volledig Müller-celkweekmedium (bereid in stap 1.2) bij 37 °C en 5% CO2 .</li>
	<li>Zuig de media op en was het kamerglaasje met 250-300 μL 1x PBS op elk putje wanneer de cellen voor 80-90% samenvloeien.</li>
	<li>Bevestig het glaasje gedurende 10 tot 15 minuten in 250-300 μL 4% paraformaldehyde op elk putje, gevolgd door wassen met PBS/TX-100 (elk 5 min/3x).</li>
	<li>Voeg een blokkeerbuffer toe gedurende 1 uur bij 37 °C (zie de Materiaaltabel).</li>
	<li>Aspireer de blokkerende oplossing op en voeg vervolgens de primaire antilichamen toe die specifiek zijn voor Müller-cellen om de zuiverheid van de geïsoleerde cellen te bevestigen met behulp van glutaminesynthetase en vimentine 5,12. Incubeer gedurende 3 uur bij 37 °C (met een antilichaamconcentratie van 1:100-1:200 in de blokkeerbuffer in een volume van 150-200 μL/glaasje). Was de glijbaan met PBS/TX-100 wasbeurten (elk 5 en 10 minuten). OPMERKING: Deze antilichamen zijn gekozen omdat ze kenmerken zijn voor het identificeren van Müller-cellen en het waarborgen van het succes en de zuiverheid van de Müller-celcultuur.</li>
	<li>Voeg het secundaire antilichaam toe (met een antilichaamconcentratie variërend van 1:1000 in blokkeerbuffer in een 150-200 μL/objectglaasje) en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C. Was vervolgens drie keer (elk 5-10 min) met PBS/Triton X-100.</li>
	<li>Breng een druppel DAPI-montagemedium aan om de kernen te labelen voordat u het glaasje afdekt met een dekglaasje. Vermijd luchtbellen bij het plaatsen van het dekbriefje.</li>
	<li>Gebruik een fluorescentiemicroscoop om het objectglaasje te controleren en beelden vast te leggen (zie Tabel met materialen). OPMERKING: Cellen bevinden zich met DAPI op ex/em 359/461 bij een vergroting van 10x om cellen te lokaliseren; Een hogere vergroting kan cellen vastleggen. Andere golflengten zijn afhankelijk van de gekozen kleur. Groene kleur (GFP) - ex/em 488/510. Rode kleur (Cy3) - ex/em 555/569.</li>
</ol>

<ol><li>Liu, Y., Wang, C., Su, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+signaling+in+m%C3%BCller+glia%3A+Progenitor+cells+for+regenerative+and+neuroprotective+responses+in+pharmacological+models+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ophth%22%5BJournal%5D)">Cellular signaling in müller glia: Progenitor cells for regenerative and neuroprotective responses in pharmacological models of retinal degeneration.</a> J Ophth. 2019, 5743109(2019).</li>
<li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (7), 431-442 (2014).</li>
<li>Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell-dependent+regeneration+of+the+neural+retina%3A+An+overview+across+vertebrate+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems.</a> Dev Dyn. 245 (7), 727-738 (2016).</li>
<li>Kobat, S. G., Turgut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+M%C3%BCller+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Beyoglu+Eye+J%22%5BJournal%5D)">Importance of Müller cells.</a> Beyoglu Eye J. 5 (2), 59-63 (2020).</li>
<li>Liu, X., Tang, L., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+M%C3%BCller+cell+isolation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Mouse Müller cell isolation and culture.</a> Bio Protoc. 7 (15), e2429(2017).</li>
<li>Bringmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+cells+in+the+healthy+and+diseased+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Ret+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Müller cells in the healthy and diseased retina.</a> Prog Ret Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).</li>
<li>de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L. M., Schitine, C. S., de Mello, M. C. F., de Mello, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glia+as+an+active+compartment+modulating+nervous+activity+in+the+vertebrate+retina%3A+neurotransmitters+and+trophic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Müller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors.</a> Neurochem Res. 33 (8), 1466-1474 (2008).</li>
<li>Fischer, A. J., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glia+are+a+potential+source+of+neural+regeneration+in+the+postnatal+chicken+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Müller glia are a potential source of neural regeneration in the postnatal chicken retina.</a> Nat Neurosci. 4 (3), 247-252 (2001).</li>
<li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+%28Danio+rerio%29+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+of+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J of Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).</li>
<li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+of+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> J of Vis Exp. (133), 56997(2018).</li>
<li>Sarthy, P. V., Bunt, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultrastructure+of+isolated+glial+%28M%C3%BCller%29+cells+from+the+turtle+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">The ultrastructure of isolated glial (Müller) cells from the turtle retina.</a> Anat Rec. 202 (2), 275-283 (1982).</li>
<li>Shanmugam, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+receptor+membrane+component+1+%28PGRMC1%29+expression+in+murine+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Progesterone receptor membrane component 1 (PGRMC1) expression in murine retina.</a> Curr Eye Res. 41 (8), 1105-1112 (2016).</li>
<li>Moustafa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((12-HETE+activates+M%C3%BCller+glial+cells%3A+The+potential+role+of+GPR31+and+miR-29%5BTitle%5D)+AND+%22Prostag+Oth+Lipid+M%22%5BJournal%5D)">12-HETE activates Müller glial cells: The potential role of GPR31 and miR-29.</a> Prostag Oth Lipid M. 171, 106805(2024).</li>
<li>Pereiro, X., Ruzafa, N., Acera, A., Urcola, A., Vecino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+method+to+isolate+and+culture+adult+porcine%2C+rats+and+mice+m%C3%BCller+glia+in+order+to+study+retinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a method to isolate and culture adult porcine, rats and mice müller glia in order to study retinal diseases.</a> Front Cell Neurosci. 14, 7(2020).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren die relevant zijn voor de inhoud van dit artikel.

De isolatie van primair retinaal gepigmenteerd epitheel (RPE) uit muizen werd eerder gedocumenteerd door ons laboratorium. Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd demonstratieprotocol voor de isolatie van primaire Müller-cellen. Deze procedure omvat enucleatie, behandeling, dissectie, verzameling, zaaien, kweken en karakteriseren van Müller-cellen geïsoleerd uit muizenogen. Het is gebaseerd op een eerder succesvol protocol dat in eerdere publicaties te vinden was en ons aangepaste protocol dat we in een recente publicatie hebben gebruikt1 2,13. Hoewel de stappen eenvoudig zijn, vereist een succesvolle Müller-celisolatie naleving van specifieke beperkingen en essentiële vereisten. Na talloze pogingen met vallen en opstaan om dit protocol te optimaliseren, werden meerdere factoren geïdentificeerd die van invloed zijn op het succes ervan.
De ideale leeftijd van de muis, zoals waargenomen in onze experimenten, bleek tussen de 5-11 dagen te liggen om de geïsoleerde cellen tot vier passages te laten groeien. De cultuur wordt ook beïnvloed door het aantal ogen dat geïsoleerd en beschaafd is. Voor enkelvoudige isolatie zijn ten minste twee ogen nodig om voldoende cellen te verkrijgen om te kunnen groeien en zich te vermenigvuldigen. Een ander belangrijk aspect is de duur tussen enucleatie en plating; Daarom moet deze stap relatief snel worden uitgevoerd. Er werd waargenomen dat langdurige manipulatie van het oogweefsel een nadelig effect heeft op het vermogen van de cellen om zich aan de kolf te hechten en zich te vermenigvuldigen. Om er zeker van te zijn dat de nabijheid van geïsoleerde cellen dichtbij genoeg is om proliferatie aan te moedigen, raden we aan om een T25-kolf te gebruiken. Zodra de eerste doorgang is gemaakt, kunnen de cellen op een T75 worden geplateerd. Ook mogen cellen na isolatie en zaaien niet worden verstoord door de weefselkweekkolf uit de incubator te halen of door de media gedurende ten minste 5 dagen te verwisselen. Ten slotte kunnen cellen slechts ongeveer vier keer worden gepasseerd voordat ze stoppen met hechten. Hoewel deze procedure eenvoudig en gemakkelijk uit te voeren is, heeft deze enkele beperkingen, waaronder de leeftijd van de muizen, een beperkt aantal celpassages, enz.
Er zijn niet veel protocollen voor Müller-celisolatie, maar er zijn enkele opmerkelijke verschillen tussen dit protocol en de protocollen die beschikbaar zijn 5,14. Ten eerste is de tijd tussen enucleatie en isolatie significant verschillend. Andere protocollen suggereren dissectie kort na enucleatie, meestal binnen 10 minuten. Terwijl het huidige protocol een rustperiode van ten minste 18 uur voorstelt, omdat dit in dit protocol de beste resultaten opleverde voor isolatie. Een ander belangrijk verschil tussen dit protocol en andere protocollen is het punt waarop de ogen met enzymen worden behandeld. In dit protocol worden de ogen behandeld voordat er een dissectie is uitgevoerd, zelfs voordat bindweefsel en extraoculaire spieren zijn verwijderd. Terwijl andere protocollen het netvlies van het oog isoleren voorafgaand aan de enzymbehandeling. Verder is het enzymrecept ook anders. In dit protocol bestaat de enzymoplossing uit trypsine en collagenase type IV. In vergelijkbare protocollen worden papaïne en DNase gebruikt voor weefselvertering . Bovendien is het kweekvat anders, dit protocol stelt voor om na de eerste passage op een T25 te kweken en vervolgens op een T75. Terwijl andere protocollen petrischalen of borden met meerdere putten gebruiken. Ten slotte suggereert dit protocol dat de kolf niet mag worden verstoord (gedurende 5-7 dagen) om de celgroei te bevorderen. Terwijl in andere protocollen de mediawissel na één dag wordt uitgevoerd.

Müller-cellen (MC's) zijn de belangrijkste en meest voorkomende gliacellen die in het netvliesweefsel worden aangetroffen. Zij zijn de belangrijkste spelers bij het bieden van structurele integriteit en metabolische functies in het netvlies1. De strategische structuur van MC's is verspreid over de gehele dikte van het netvlies en biedt zo ondersteuning aan het netvlies. Naast hun steigerachtige eigenschappen hebben ze metabolische functies voor retinale neuronen, die ze voorzien van energiesubstraten, waaronder glucose en lactaat. Deze functies zijn cruciaal om een gezonde neuronale functie te behouden. Van verminderde MC's is gemeld dat ze bijdragen aan verschillende netvliesaandoeningen, waaronder leeftijdsgebonden maculaire degeneratie, diabetische retinopathie en glaucoom 2,3. MC's kunnen endogene cellulaire bronnen zijn voor regeneratieve therapie in het netvlies1. Ze omvatten ook een aanzienlijk deel van het netvlies, en er zijn sterke aanwijzingen dat deze cellen bij verschillende soorten kunnen worden gestimuleerd om ontbrekende neuronen te vervangen2. Ze werken gunstig samen met neuronen, en de uiteinden van de conisch vertakkende Müller-cellen onthullen de bloedvaten dicht en verbinden de neurale componenten van het netvlies. Om de neuronale ontwikkeling en neuronale plasticiteit te behouden, fungeren Müller-cellen als een zacht substraat voor neuronen en beschermen ze tegen mechanisch trauma3. Bovendien kunnen Müller-cellen onder pathologische omstandigheden differentiëren tot neurale voorlopercellen of stamcellen die de verloren fotoreceptoren en neuronen repliceren of regenereren 2,3,4. Müller-cellen behouden de kenmerken van retinale stamcellen, waaronder verschillende niveaus van potentieel voor zelfvernieuwing en differentiatie 5,6. De Müller-gliacel heeft een aanzienlijke netvliesafstamming die neurotrofe factoren produceert, neurotransmitters opneemt en recyclet, ionen ruimtelijk buffert en de bloed-netvliesbarrière in stand houdt om het netvlies in homeostase te houden 7,8,9. Dit benadrukt het potentieel van Müller-cellen als een veelbelovend hulpmiddel in celgebaseerde therapieën voor de behandeling van ziekten die verband houden met degeneratie van het netvlies. Müller-cellen zijn de primaire glia die door het netvlies zijn verspreid en verbinding maken met zowel neuronen als bloedvaten. Ze spelen een cruciale beschermende rol en bieden essentiële structurele en metabolische ondersteuning om de levensvatbaarheid en stabiliteit van netvliescellen te behouden. Helaas zijn er in de literatuur maar heel weinig protocollen te vinden voor primaire Müller-celisolatie van het netvlies 10,11.
We presenteren een verbeterde aanpak voor het betrouwbaar isoleren en kweken van primaire Müller-cellen van muizen. Dit protocol werd in onze groep gebruikt om Müller-cellen te isoleren van de wildtype C57BL/6-muizen en transgene muizen12,13. Voor dit protocol worden muizen gebruikt tussen de 5 en 11 dagen oud, zonder geslachtsvoorkeur. Cellen zijn tot 4 keer gepasseerd; bij P4 hechten ze zich echter niet meer aan de kolf en wordt het moeilijk om een gezonde cultuur te laten groeien. De cultuur is vaak besmet met retinale gepigmenteerde epitheelcellen (RPE), dus de cellen moeten minstens één keer worden gepasseerd voordat aanvullende experimenten op de cellijn worden uitgevoerd. Passeren zorgt voor verdere isolatie van verontreinigingen. Daarom biedt het gepresenteerde protocol een snelle en effectieve manier om Müller-muizencellen te isoleren, die vervolgens kunnen worden gebruikt als een betrouwbaar platform om therapeutische doelen te onderzoeken en mogelijke behandelingen voor netvliesaandoeningen teevalueren14.

<table><tbody><tr><td>Beaker : 100mL</td><td>KIMAX</td><td>14000</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV&nbsp;</td><td>Worthington&nbsp;</td><td>LS004188</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile</td><td></td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1X)&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>11885084</td><td>Media om M&uuml;ller cellen te kweken&nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>gibco</td><td>26140079</td><td>Voor compleet Muller cel kweekmedium</td></tr><tr><td>Glutamine synthase</td><td>Cell signalling</td><td>80636</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VISO 160i CO2 Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL</td><td>B-D</td><td>309577</td><td></td></tr><tr><td>Micro Centrifuge Tube: 2 mL</td><td>Grainger</td><td>11L819</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>gibco</td><td>15140-122</td><td>Voor compleet M&uuml;ller cel kweekmedium</td></tr><tr><td>Phosphate Buffer saline (PBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>J62851.AP</td><td></td></tr><tr><td>Positive Action Tweezers, Style 5/45</td><td>Dumont</td><td>72703-DZ</td><td></td></tr><tr><td>Scissors Iris Standard Straight 11.5cm</td><td>GARANA INDUSTRIES</td><td>2595</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall St8 Centrifuge</td><td>ThermoScientific</td><td>75007200</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 305 Microscope</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Blade, #11, Stainless Steel</td><td>Bard-Parker</td><td>371211</td><td></td></tr><tr><td>Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style</td><td>Corning</td><td>430589</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Dish : 100x20mm style</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Tornado Tubes: 15mL</td><td>Midsci</td><td>C15B</td><td></td></tr><tr><td>Tornado Tubes: 50mL</td><td>Midsci</td><td>C50R</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips</td><td>Dumont</td><td>501764</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL</td><td>Electron Microscopy Sciences Dumont</td><td>50-241-57</td><td></td></tr><tr><td>Underpads, Moderate : 23" X 36"</td><td>McKesson</td><td>4033</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin&nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>MA5-11883</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioImager Z2</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Zen Blue 2.6</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie van primaire müllercellen van de retinale glia van muizen

Isolation of Primary Mouse Retinal Glial M&#252;ller Cells

De primaire ondersteunende cel van het netvlies is de retinale glia Müller-cel. Ze bedekken het gehele netvliesoppervlak en bevinden zich in de nabijheid van zowel de bloedvaten van het netvlies als de neuronen van het netvlies. Vanwege hun groei voeren Müller-cellen verschillende cruciale taken uit in een gezond netvlies, waaronder de opname en recycling van neurotransmitters, retinoïnezuurverbindingen en ionen (zoals kalium K+). Naast het reguleren van de bloedstroom en het onderhouden van de bloed-retinale barrière, reguleren ze ook de stofwisseling en de toevoer van voedingsstoffen naar het netvlies. Een gevestigde procedure voor het isoleren van primaire Müller-cellen van muizen wordt in dit manuscript gepresenteerd. Om de onderliggende moleculaire processen die betrokken zijn bij de verschillende muismodellen van oogaandoeningen beter te begrijpen, is Müller-celisolatie een uitstekende aanpak. Dit manuscript schetst een gedetailleerde procedure voor Müller-celisolatie van muizen. Van enucleatie tot zaaien, het hele proces duurt ongeveer een paar uur. Gedurende 5-7 dagen na het zaaien mogen de media niet worden veranderd om de geïsoleerde cellen ongehinderd te laten groeien. Celkarakterisering met behulp van morfologie en verschillende immunofluorescerende markers komt vervolgens in het proces. Maximale passages voor cellen zijn 3-4 keer.

Validatie van de specificiteit, zuiverheid en barrièrefunctie van geïsoleerde Müller-cellen Om de levensvatbaarheid, morfologie en onderscheidende eigenschappen van de geïsoleerde Müller-cellen te bevestigen, werden de cellen onder een lichtmicroscoop onderzocht. Er werden P0- en P1-beelden opgenomen (figuur 1A). Om de contaminatie van geïsoleerde Müller-cellen met RPE-cellen te controleren en de zuiverheid ervan te bevestigen, werd immunofluorescentiekleuring (IF) uitgevoerd met behulp van antilichamen die specifiek zijn voor RPE-celmarker, RPE65. Menselijke retinale gepigmenteerde cellen (ARPE -19) werden gebruikt als positieve controle. RPE65 gekleurde RPE-cellen (rood en blauw voor nucleaire kleuring) worden weergegeven in figuur 1B (onderste paneel). RPE65-specifieke antilichamen kleurden de geïsoleerde Müller-cellen niet (Figuur 1B, bovenste paneel). Het feit dat de RPE65 de ARPE-19-cellen (rood) kleurde en de geïsoleerde cellen niet kleurde, geeft aan dat de geïsoleerde cellen geen RPE-cellen zijn. De aanwezigheid van pyruvaat en lage glucose in de media zorgt voor ongunstige omstandigheden voor de groei van RPE-cellen. Daarom zullen ze, zelfs in het geval van RPE-celcontaminatie, uiteindelijk loskomen van de kolf.
Om de identiteit van geïsoleerde cellen te bevestigen, werd bovendien een Müller-cellen immunofluorescentiekleuring voor Müller-cellen specifieke markers gebruikt om de succesvolle isolatie van Müller-cellen te bevestigen. Het cytoskelet intermediaire filamenteiwit, vimentine genaamd, werd gebruikt12,13. Daarnaast werd ook glutaminesynthetase (GS) gebruikt, dat de reactie van condensatie van glutamaat en ammoniak katalyseert om glutamine te vormen, als een sleutelfunctie van retinale gliale Müller-cellen.
Gezamenlijk kleurden geïsoleerde cellen negatief voor RPE65 (rood, figuur 1B), positief voor vimentine (groen, figuur 1C) en GS (groen, figuur 1D). IF-kleuring bevestigt een succesvolle isolatie (zuiverheid en specificiteit) van de geïsoleerde Müller-cellen. Figuur 1E is een negatieve controle voor vimentin (bovenste paneel) en GS (onderste paneel), wat de specificiteit van de antilichamen bevestigt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66237/66237fig01.jpg"> Figuur 1: Validatie van Müller-celisolatie (zuiverheid en specificiteit). (A) Lichtmicroscopiebeeld voor passages: passage nul(P0)en(P1)morfologie. (B) RPE65-immunokleuring in combinatie met DAPI-nucleaire kleuring. (C) Vimentin-immunokleuring met DAPI-nucleaire kleuring bij sterke vergroting. (D) GS-immunokleuring bij dezelfde hoge vergroting. (E) negatieve controles om de specificiteit van de kleuring van vimentine en GS-antilichamen te bevestigen. schaalbalk = respectievelijk 300 μm, 300 μm, 50 μm, 20 μm, 20 μm, 50 μm, 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66237/66237fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor het isoleren van retinale gliacellen Müller uit muizenogen. Het protocol begint met enucleatie en dissectie van muizenogen, gevolgd door isolatie, zaaien en kweken van Müller-cellen.

Isolatie van primaire müllercellen van de retinale glia van muizen

The primary supporting cell of the retina is the retinal glial M&#252;ller cell. They cover the entire retinal surface and are in close proximity to both ...

isolation-of-primary-mouse-retinal-glial-mller-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In deze video, zullen we laten zien hoe je netvlies stamcellen uit het ciliaire epitheel van de muis oog te isoleren en te groeien ze in cultuur tot klonale netvlies bollen te vormen. De bollen die zijn geïsoleerd beschikken over de kardinale eigenschappen van stamcellen: self-vernieuwing en multipotentiality.

Isolatie van het netvlies stamcellen van de muis Eye

This video demonstrates the culturing of Müller glial (MG) cells isolated from mouse retinas. Retinas are dissociated into a single-cell suspension using digestive enzymes. Cells are then grown in a medium with a growth factor that promotes MG cell proliferation and neuronal cell mortality. Dead neuronal cells are removed while passaging, and MG cells are grown for further analysis.

Establishing a M&#252;ller Glial Cell Culture Obtained from Mouse Retinas

Miljoenen mensen lijden aan retinale degeneratieve ziekten die leiden tot onomkeerbare blindheid. Een gemeenschappelijk element van veel van deze ziekten is het verlies van retinale ganglioncellen (RGC's). Dit gedetailleerde protocol beschrijft de isolatie van primaire murine RGC's door positieve en negatieve selectie met flowcytometrie.

Isolatie van Primaire Murine Retinale Ganglioncellen (RGC&#39;s) door Flow Cytometry

Een protocol voor de isolatie van primaire microglia vanuit lymfkliertest brains wordt gepresenteerd. Deze techniek helpt bij het bevorderen van het huidige begrip van neurologische aandoeningen. Dichtheid kleurovergang centrifugeren en magnetische scheiding worden gecombineerd om voldoende opbrengst van een zeer zuivere monster. Voorts schetsen we de stappen voor de karakterisering van microglia.

Karakterisering en isolatie van de primaire Microglia muis door dichtheid kleurovergang centrifugeren

We beschrijven de immunomagnetic isolatie van primaire muisknop oligodendrocyten, waarmee het snelle en specifieke isolement van de cellen voor in vitro cultuur.

Snelle en specifieke Immunomagnetic isolatie van de primaire oligodendrocyten muis

Hier beschrijven we de isolatie van darmen-gliale cellen uit de intestinale submucosa-sequentiële EDTA incubations met divalente kationen en vervolgens incubatie in de oplossing van de gegevensterugwinning van de niet-enzymatische cel chelaat. De resulterende celsuspensie op poly-D-lysine en laminin plating resulteert in een sterk verrijkt cultuur van submucosal gliacellen voor functionele analyse.

Isolatie van darmen gliale cellen uit de Submucosa en de Lamina Propria van de volwassen muis

Hier presenteren we een protocol om primaire microglia te isoleren en te zuiveren in diermodellen van demyeliniserende ziekten, met behulp van kolomvormige magnetisch geactiveerde celsortering.

Isolatie van primaire microglia van muizen door magnetisch geactiveerde celsortering in diermodellen van demyelinisatie

Dit manuscript beschrijft een vereenvoudigd protocol voor de isolatie van retinale gepigmenteerde epitheelcellen (RPE) uit muizenogen op een stapsgewijze manier. Het protocol omvat de enucleatie en dissectie van muizenogen, gevolgd door de isolatie, zaaiing en kweek van RPE-cellen.

Isolatie van primaire retinale gepigmenteerde epitheelcellen van muizen

Müller glia primaire culturen verkregen uit het netvlies van muizen vormen een zeer robuust en betrouwbaar hulpmiddel om de gliale omzetting in retinale voorlopercellen na microRNA-behandeling te bestuderen. Afzonderlijke moleculen of combinaties kunnen worden getest voordat ze vervolgens in vivo worden toegepast.

Primaire celculturen om het regeneratiepotentieel van Murine Müller Glia na microRNA-behandeling te bestuderen

Retinaal pigmentepitheel (RPE) fungeert als een cruciale barrière tussen het vaatvlies en het netvlies en bevordert de gezondheid en functie van retinale celtypen, zoals fotoreceptoren. Hierin beschrijven we een eenvoudig en effectief protocol voor het isoleren en kweken van RPE van volwassen muizen.

Een vereenvoudigde methode voor isolatie en kweek van retinale pigmentepitheelcellen van volwassen muizen

Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor het isoleren van primaire retinale Müller-cellen van neonatale Sprague-Dawley (SD) ratten. De procedure omvat enucleatie van de oogbollen, dissectie van netvliesweefsel, extractie en identificatie van cellen en belangrijke overwegingen voor latere celkweek.

Isolatie en kweek van primaire retinale Müller-cellen van Sprague-Dawley (SD) ratten

Leer de isolatie van primaire Müller-cellen uit muizenretina's voor onderzoek naar retinale glia en ziekteprocessen. Deze methode ondersteunt studies naar neuronale gezondheid en therapeutische doelwitten.

Isolatie van primaire müllercellen van de retinale glia van muizen

Meer video's verkennen