Name: Voorlopige validatie van stereotaxische injectiecoördinaten via cryosectie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Leer een geoptimaliseerde methode voor stereotaxische injectiecoördinaten in muizen met behulp van kleurstoffen voor snelle verificatie. Deze techniek verkort de tijd voor voorlopige validatie aanzienlijk en verbetert de efficiëntie van virale traceringstudies in de neurowetenschap.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

National Natural Science Foundation of China (subsidie nr. 82101249 aan XY Sun), Postdoctorale onderzoeksstichting van China (subsidie nr. 2022M722125 aan XY Sun). Shanghai Sailing Program (subsidie nr. 21YF1425100 aan SH Chen). Speciaal project voor klinisch onderzoek van de gemeentelijke gezondheidscommissie van Shanghai (subsidie nr. 202340088 aan J Zhou). Nationale Natuurwetenschappelijke Stichting van China (subsidie nr. 82101262 aan X Zhang, subsidie nr. 82101287 aan SH Chen).

Alle dierproeven zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van Animal Research Reporting In Vivo Experiments (ARRIVE) en de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. De huidige studie werd goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van het Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Acht weken oude C57BL/6J mannelijke muizen werden gebruikt voor de huidige studie. De dieren werden commercieel verkregen (zie Materiaaltabel) en gehuisvest in standaardkooien (22 °C ± 2 °C, 12 uur/12 uur licht/donkercyclus, voedsel en water ad libitum).
1. Selectie van doelhersengebieden
LET OP: Dit is een steriele procedure. Zorg ervoor dat alle chirurgische instrumenten zijn gesteriliseerd. Spuit de handschoenen in met alcohol voordat u ze in contact brengt met chirurgische instrumenten. Raak de punt van de instrumenten of het operatiegebied niet aan met handschoenen. Zorg ervoor dat de muis voldoende verdoofd is voordat u met de procedure begint door te controleren op het verlies van oprichtreflexen en geen reactie op huidstimulatie. Houd vóór het boren en injecteren de ademhalingsfrequentie (60-220 ademhalingen per minuut, gemiddeld 100-150 ademhalingen per minuut) en de ademhalingsamplitude nauwlettend in de gaten (moet consistent zijn en niet te oppervlakkig of te diep). Eventuele significante veranderingen in de ademhalingsfrequentie of amplitude moeten worden opgemerkt.
<ol><li>Verdoof de muis met een intraperitoneale injectie van 1,25% tribroomethanol (250 mg/kg) met behulp van een naald van 29 G. Scheer het haar op de schedel zodra de oprichtende reflex verdwijnt. Zet de muis vast in het stereotaxische frame (zie Materiaaltabel) door de bovenste snijtanden vast te zetten met een neusklem en het hoofd te stabiliseren met behulp van twee oorstangen.</li>
	<li>Breng oogzalf aan om droge ogen te voorkomen. Desinfecteer de hoofdhuid door deze drie keer af te strijken met Anerdian (desinfecterende oplossing; zie Materiaaltabel). Injecteer 0,2 ml 1% lidocaïne subcutaan met behulp van een insulinenaald van 29 G om lokale analgesie te verkrijgen.</li>
	<li>Maak een incisie van 0,5 cm met een oogschaar om de schedel bloot te leggen. Gebruik een wattenstaafje gedrenkt in 3% H2O2 om de blootgestelde schedel te schrobben om het periost te verwijderen. Laat de schedel drogen.</li>
	<li>Bevestig de boor op het stereotaxische instrument. Stel de knoppen van de stereotaxische armen in om de boorpunt precies op de bregma te positioneren met behulp van een vergrootglas en registreer de waarde van de z-as met behulp van het digitale LCD-display.<ol><li>Stel de knoppen af en plaats de boorpunt op de lambda en noteer de waarde van de z-as. Pas de neusklem en oorstangen aan om twee z-waarden dichter bij elkaar te brengen en herhaal de bovenstaande stappen totdat het verschil tussen de twee z-waarden minder is dan 0.1 mm. OPMERKING: De x-, y- en z-assen op het digitale LCD-scherm komen overeen met respectievelijk mediolateraal (ML), anteroposterieur (AP) en dorsoventraal (DV). De bregma en lambda kunnen worden beschouwd als zich op hetzelfde horizontale vlak bevinden zodra het verschil tussen de twee z-waarden minder dan 0,1 mm is.</li>
	</ol></li>
	<li>Zorg voor de links-rechts niveauloosheid van de hersenen. Pas de oorbalken die aan het stereotaxische frame zijn bevestigd aan met dezelfde schaal. Neem bijvoorbeeld de laterodorsale tegmentale kern, ventrale deel (LDTgV); de stereotaxische coördinaten zijn -5,2 voor x, +0,8 voor y, -4,0 voor z, volgens Paxinos en Franklin's muizenhersenatlas16.<ol><li>Stel de oorstang af om de boor te maken op (-5.2, +0.8) om de z-waarde in dorsaal-ventrale richting te meten en verplaats de boor naar (-5.2, -0.8) om de z-waarde te meten. OPMERKING: De links-rechts wordt als gelijk beschouwd wanneer het verschil tussen de twee z-waarden minder dan 0,2 mm is. De oorbalken moeten op de juiste plaats worden ingebracht omdat de uitwendige auditieve meatus symmetrisch is. Als het verschil tussen de twee z-waarden meer dan 0,5 mm is, is de oorschelp mogelijk op de verkeerde plaats geplaatst.</li>
	</ol></li>
	<li>Plaats de boor weer op de bregma en zet drie coördinaten op het digitale LCD-display op nul. Plaats de boor boven het interessegebied met behulp van referentiecoördinaten. Start de oefening.<ol><li>Laat de boor geleidelijk zakken met behulp van de verticale arm totdat deze de schedel binnendringt. Verwijder puin en bloed met wattenstaafjes. OPMERKING: Pas op dat u het hersenweefsel niet beschadigt.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Het bereiden van kleurstofoplossing en hersenenmicroinjectie
<ol><li>Neem 25 μl SDS-PAGE-laadbuffer met broomfenolblauw (zie materiaaltabel) in een microcentrifugebuisje van 200 μl. Voeg 50 μL ddH2O toe aan de tube om de verfoplossing te bereiden.</li>
	<li>Bedek het schedelraam met een met zoutoplossing bevochtigd wattenschijfje. Zorg voor de doorgankelijkheid van de microspuit door herhaaldelijk zoutoplossing op te zuigen en te verdrijven. Laad 0,3 μL kleurstof in de microspuit. Bevestig de spuit en de gemotoriseerde stereotaxische microinjector aan de stereotaxische arm.</li>
	<li>Plaats de punt van de spuit op de bregma en stel de coördinaten in op nul op het digitale LCD-display. Stel de naald in het interessegebied af volgens de referentiecoördinaten. Stel de injectiesnelheid in op 0,1 μL/min en start de gemotoriseerde microinjector, die 0,3 μL blauwe kleurstof in het doelgebied aflevert. Laat de spuit ten minste 10 minuten op zijn plaats voordat u de injector langzaam terugtrekt. OPMERKING: Verschillende kleurstoffen kunnen in dezelfde muizen worden gebruikt om dicht bij elkaar gelegen regio's te onderscheiden. Test andere kleurstoffen op geschikte concentraties op basis van hun fysische eigenschappen. Het wordt aanbevolen om de broomfenolblauwe formule te gebruiken en de spuit voor en na gebruik grondig te spoelen om verstoppingen te voorkomen. Pas de injectievolumes aan op basis van kleurstofdiffusie.</li>
</ol>3. Oogst en cryosectie van hersenweefsel
<ol><li>Haal de muis uit het stereotaxische frame. Verdoof de muis met een intraperitoneale injectie van 50 mg/kg pentobarbitalnatrium met behulp van een naald van 29 G. Zet de muis vast op een foamboard met tape.</li>
	<li>Open beide zijden van de thorax om snelle verstikking te veroorzaken. Maak een incisie van 1-2 mm in het rechter hartoor. Steek een infuusnaald in de linker hartkamer. Laat 20 ml voorgekoelde zoutoplossing en 20 ml ijskoude 4% paraformaldehyde-oplossing trekken.</li>
	<li>Onthoofd de muis met een weefselontleedschaar (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Verwijder de huid door een incisie te maken langs de middellijn van de nek naar de neus en leg vervolgens de schedel bloot. Verwijder de resterende spier op de schedel met een tang of schaar.</li>
	<li>Plaats de punt van een mes van de fijne schaar tussen het foramen magnum en de hersenen, met de scherpe rand naar het bot gericht, aan het rostrale uiteinde van de mid-sagittale hechtdraad. Ga verder met het schuiven en snijden van de schedel langs de mid-sagittale hechtdraad. Gebruik een tang om de schedel te verwijderen en de blootgestelde hersenen te onthullen. OPMERKING: Wees voorzichtig om te voorkomen dat u tijdens de operatie schade aan de hersenen veroorzaakt. Voordat u de botschilfers verwijdert, moet u voorzichtig alle hersenvliezen verwijderen die aan de schedel zijn bevestigd. Deze voorzorgsmaatregel is cruciaal om te voorkomen dat tijdens het proces per ongeluk in het hersenweefsel wordt gesneden.</li>
	<li>Schakel de stroom van de roterende microtoom cryostaat in (zie Tabel met materialen) en stel de kamertemperatuur in op -20 °C. Giet een beetje OCT-compound om het oppervlak van de preparaatschijf gelijkmatig te bedekken. Plaats het in de cryokamer en laat de OCT stollen.</li>
	<li>Bevestig de schijf aan de preparaatkop. Breng het mes dichter bij het blok en snijd het OCT-blok bij om een plat vlak te maken dat evenwijdig is aan de schijf.</li>
	<li>Snijd de hersenen in coronale richting weg van de injectieplaats in een hersenschijfvorm met een scheermesje. Plaats het hersenweefsel met de injectieplaats met de snijkant naar beneden op het platte OCT-vlak.<ol><li>Giet OCT op de hersenen en plaats de schijf in de cryokamer, zodat het preparaatblok kan stollen. Giet OCT herhaaldelijk op de hersenen totdat de hersenen volledig zijn ingebed in OCT. OPMERKING: Voeg de OCT-verbinding laag voor laag toe. Zodra de vorige laag OCT is bevroren, giet je de volgende laag OCT-verbinding op de hersenen.</li>
	</ol></li>
	<li>Knip het preparaatblok bij totdat het doelgebied nadert. Maak verschillende secties vanaf het niveau van de injectieplaats. Verzamel de coronale hersenplakjes op een bord met 6 putjes PBS op kamertemperatuur met behulp van een klein schrijfborsteltje dat op -20 °C wordt gehouden. NOTITIE: Stel de snijdikte in op een grotere om het blok bij te snijden en stel vervolgens de snijdikte in op 40 μm wanneer het mes de injectieplaats nadert. Als neurale circuittracers worden gebruikt, worden de muizen niet onmiddellijk opgeofferd. Plaats de muis in een steriele, postoperatieve herstelkooi over een verwarmingsdeken voor herstel na anesthesie. Breng de muizen terug naar de oorspronkelijke kooi of een nieuwe kooi als ze wakker zijn.</li>
</ol>4. Beeldvorming
<ol><li>Was de OCT met PBS op kamertemperatuur. Gebruik een borstel om hersensecties op te pakken en plaats ze op een dia. Laat de secties aan de lucht drogen bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Observeer het geïnjecteerde gebied visueel of gebruik een microscoop wanneer de doelkernen minuscuul zijn. Vergelijk de locatie van de geïnjecteerde kleurstof met het overeenkomstige gebied in de hersenatlas. OPMERKING: Pas de waarden van de x-, y- en z-assen aan op basis van de richting en afstand van de injectiepuntafwijking. Het kan nodig zijn om alle stappen in dit protocol meerdere keren te herhalen om de coördinaten nauwkeurig te bepalen.</li>
</ol>

Optimalisatie van de nauwkeurigheid van stereotaxische micro-injectie bij muizen

<ol><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+neurotrophic+factor-mediated+projection-specific+regulation+of+depressive-like+and+nociceptive+behaviors+in+the+mesolimbic+reward+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Brain-derived neurotrophic factor-mediated projection-specific regulation of depressive-like and nociceptive behaviors in the mesolimbic reward circuitry.</a> Pain. 159 (1), 175(2018).</li>
<li>Gan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-specific+pain+relief+pathways+originating+from+primary+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Layer-specific pain relief pathways originating from primary motor cortex.</a> Science. 378 (6626), 1336-1343 (2022).</li>
<li>Laing, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+hypothalamic+parvalbumin+neurons+are+glutamatergic+and+promote+escape+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Anterior hypothalamic parvalbumin neurons are glutamatergic and promote escape behavior.</a> Curr Biol. 33 (15), 3215-3228 (2023).</li>
<li>Perens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+3D+mouse+brain+atlas+framework+with+the+skull-derived+coordinate+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">Multimodal 3D mouse brain atlas framework with the skull-derived coordinate system.</a> Neuroinformatics. 21 (2), 269-286 (2023).</li>
<li>Adhikari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basomedial+amygdala+mediates+top-down+control+of+anxiety+and+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Basomedial amygdala mediates top-down control of anxiety and fear.</a> Nature. 527 (7577), 179-185 (2015).</li>
<li>Tao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+from+infralimbic+cortex+to+paraventricular+thalamus+mediate+fear+extinction+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Bull%22%5BJournal%5D)">Projections from infralimbic cortex to paraventricular thalamus mediate fear extinction retrieval.</a> Neurosci Bull. 37 (2), 229-241 (2021).</li>
<li>Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+viral+vectors+in+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated viral vectors in neuroscience research.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 17, 69-82 (2020).</li>
<li>Ansarifar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+volume+and+expression+time+in+an+aav-delivered+channelrhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Impact of volume and expression time in an aav-delivered channelrhodopsin.</a> Mol Brain. 16 (1), 77(2023).</li>
<li>Gonzalez, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-guided+AAV+capsid+evolution+strategies+for+enhanced+CNS+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Structure-guided AAV capsid evolution strategies for enhanced CNS gene delivery.</a> Nat Protoc. 18 (11), 3413-3459 (2023).</li>
<li>Sun, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+parallel+medial+prefrontal+cortex-amygdala+pathways+mediate+memory+deficits+via+glutamatergic+projection+in+surgery+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Two parallel medial prefrontal cortex-amygdala pathways mediate memory deficits via glutamatergic projection in surgery mice.</a> Cell Rep. 42 (7), 112719(2023).</li>
<li>Koren, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insular+cortex+neurons+encode+and+retrieve+specific+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insular cortex neurons encode and retrieve specific immune responses.</a> Cell. 184 (25), 6211(2021).</li>
<li>Poller, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+motor+and+fear+circuits+regulate+leukocytes+during+acute+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Brain motor and fear circuits regulate leukocytes during acute stress.</a> Nature. 607 (7919), 578-584 (2022).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+visual+circuit+related+to+habenula+underlies+the+antidepressive+effects+of+light+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A visual circuit related to habenula underlies the antidepressive effects of light therapy.</a> Neuron. 102 (1), 128-142 (2019).</li>
<li>Hu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+visual+circuit+related+to+the+periaqueductal+gray+area+for+the+antinociceptive+effects+of+bright+light+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A visual circuit related to the periaqueductal gray area for the antinociceptive effects of bright light treatment.</a> Neuron. 110 (10), 1712-1727 (2022).</li>
<li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+stepwise+tracing+of+polysynaptic+neuronal+circuits+with+replication-deficient+pseudorabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed stepwise tracing of polysynaptic neuronal circuits with replication-deficient pseudorabies virus.</a> Cell Rep Methods. 3 (6), 100506(2023).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates.+2nd+ed%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates. 2nd ed</a>. , Academic Press. (2001).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.

Dit artikel heeft een stabiele strategie beschreven om de nauwkeurigheid van stereotaxische herseninjecties 5,6 sneller en eenvoudiger te verifiëren voordat het virus wordt getraceerd, maar het onvervangbare aspect van genexpressie van reporters in het hersengebied is cruciaal voor het labelen van hersengebieden. De blauwe kleurstof die we gebruikten, maakte het mogelijk om de injectieplaats onmiddellijk te visualiseren.
Verschillende cruciale stappen in dit protocol dragen bij aan het verbeteren van de nauwkeurigheid van de injectieplaats. Ten eerste, het waarborgen van de links-rechts nivellering van de hersenen in het stereotaxische instrument vanaf stap 1.5; Deze stap vereist dat operators bekend zijn met de anatomie van de schedel en ervoor zorgen dat de oorbalken in de juiste positie worden geplaatst. De schubben op de oorbellen en het stereotaxische frame dienen ook als referenties. Ten tweede, het vinden van het exacte nulpunt, de bregma, in stap 1.6 en stap 2.3. Af en toe is een significante discrepantie in de coördinaten in stap 1.6 en 2.3 te wijten aan een aanzienlijk verschil in de positionering van het nulpunt. Dit kan ertoe leiden dat de microinjectornaald niet door het schedelvenster kan dringen. In dergelijke gevallen is het noodzakelijk om het nulpunt te verplaatsen en indien nodig moet er een nieuw schedelraam worden gemaakt. Desondanks is het nog steeds essentieel om het nulpunt te herstellen en de coördinaten opnieuw te vinden in stap 2.3; Men kan de microspuit niet rechtstreeks vanuit het eerder gemaakte schedelvenster inbrengen.
Vergeleken met het snijden van een niet-bevroren brein in een muizenvorm, levert deze strategie een nauwkeuriger resultaat op, omdat het massieve preparaatblok voorkomt dat het mes de hersenen samenknijpt en ervoor zorgt dat de kleurstof van de injectiepunten wordt verplaatst. Bovendien zijn hersensecties die door een hersenschijfmal zijn gesneden relatief dikker en niet haalbaar om kleine hersenkernen te lokaliseren. Echter, in vergelijking met het standaard cryosectieproces van hersenweefsel 11,12,13,14,15, hebben we de verwerkingsduur met ten minste 72 uur verkort door de uitdrogingsstappen over te slaan, wat ertoe leidde dat de hersensecties kwetsbaarder waren en moeilijker op te pakken op een glasplaatje, wat een grote zwakte van dit protocol vertegenwoordigt.
Tijdens het maken van de schedelvensters voor kleurstofinjectie maakt het bevestigen van de tandartsboor stevig aan de stereotaxische arm, in plaats van deze met de hand vast te houden, het gemakkelijker om de boordiepte te regelen met behulp van de fijnafstellingsknop, waardoor de kans op beschadiging van het hersenweefsel wordt verkleind.
Concluderend heeft deze studie een veelbelovende methode opgeleverd om voorlopig de exacte stereotaxische coördinaten te verifiëren voordat ze viraal worden getraceerd, waardoor het daaropvolgende neuronlabelings- en traceerproces betrouwbaarder wordt.

Bijna alle moderne neuromodulatietools, waaronder in vivo calciumregistratie, optogenetische en chemogenetische tools, vereisen het gebruik van stereotaxische coördinaten om zich te richten op het interessegebied van de hersenen 1,2,3, dat de basis vormt van neurale manipulatie. Stereotaxische coördinaten voor hersengebieden van muizen worden gedefinieerd in relatie tot bregma en lambda, de benige oriëntatiepunten op de schedel, die het zogenaamde schedel-afgeleide stereotaxische coördinatensysteem vormen. Bregma of lambda kan dienen als het nulpunt van de driedimensionale coördinaten. De drie assen zijn anteroposterieur (AP), mediolateraal (ML) en dorsoventraal (DV) en vertegenwoordigen de y-, x- en z-assen op het digitale display van stereotaxische instrumenten. Voor bekende hersengebieden kunnen de stereotaxische coördinatenparameters van een specifiek gebied worden afgeleid uit muizenhersenatlassen4 (bijv. Paxinos en Franklin's muizenbrein in stereotaxische coördinaten) en/of de gepubliceerde literatuur 5,6. Verdere validatie is echter nodig vanwege variaties in stereotaxische apparatuur en de leeftijd/populaties van muizen die door verschillende onderzoekers worden gebruikt.
Structuur is de basis van functie. Neurale circuits vormen de basis voor veel hersenfuncties, zoals cognitieve activiteiten, emotie, geheugen, sensorische en motorischefuncties1. Het labelen van de structuur en het manipuleren van de activiteit van neurale circuits zijn van vitaal belang voor het begrijpen van de functie van een specifiek neuraal circuit. In de afgelopen decennia zijn neurale tracers door vele generaties heen geëvolueerd; vroeg onderzoek nam tarwekiemagglutinine (WGA) en phaseolus vulgaris-agglutinine (PHA) aan als anterograde tracers, en fluorogold (FG), choleratoxine subeenheid B (CTB), carbocyanine als retrograde tracers. In tegenstelling tot virale tracers kunnen deze traditionele neurale tracers echter geen exogene genen in de gastheer integreren en hebben ze ook geen selectiviteit van het celtype. Tegenwoordig is de virale strategie een belangrijke propositie geworden tijdens fundamenteel neurowetenschappelijk onderzoek. Voor verschillende onderzoeksdoeleinden kunnen verschillende virale tools worden geselecteerd 7,8. Er zijn niet-transsynaptische virussen, trans-multisynaptische virussen (retrograde en anterograde) en trans-monosynaptische virussen (retrograde en anterograde). Elke categorie bevat verschillende typen met respectievelijke kenmerken.
Het proces van virale toediening en expressie is zeer tijdrovend en arbeidsintensief en duurt vaak weken of zelfs langer. Van de verschillende virale vectoren is adeno-geassocieerd virus geïdentificeerd als een veelbelovend middel voor genafgifte, dat een breed venster biedt van 3 tot 8 weken na injectie voor de experimentele procedure 7,8. Naarmate AAV evolueert, kan analyse 2-3 weken na toediening worden uitgevoerd 9,10. Andere neurale circuittracers, zoals het pseudorabiësvirus (PRV) en het rabiësvirus (RV), vereisen ook een traceringsperiode van ten minste 2-7 dagen 11,12,13,14,15. Een voorafgaande verificatie van de injectieplaats voordat fluorescentiesignalen worden waargenomen, is dus zowel tijd- als kosteneffectief.
Om een eenvoudige en snelle verificatie van stereotaxische injecties mogelijk te maken, wordt in deze studie een kleurstof toegediend vóór virale vectoren, en cryosectie stelt onderzoekers in staat om de injectieplaats te observeren en deze binnen 30 minuten na injectie te volgen.

<table><tbody><tr><td>1.0 &micro;L, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3</td><td>Hamilton</td><td>65458-01</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;L pipette tips</td><td>biosharp</td><td>BS-200-T</td><td></td></tr><tr><td>20 mL syringe</td><td>Kindly group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3%H2O2 solution</td><td>Lircon Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Shengyou Biotech</td><td>20006</td><td></td></tr><tr><td>Anerdian</td><td>Likang High-tech</td><td>31001002</td><td></td></tr><tr><td>Anti roll plate</td><td>Leica</td><td>14047742497</td><td></td></tr><tr><td>BD insulin syringe</td><td>Becton,Dickinson and Company</td><td>328421</td><td></td></tr><tr><td>Bend toothed dissecting forceps</td><td>Jinzhong</td><td>JD1050</td><td></td></tr><tr><td>Cellsens dimension software</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotton swab</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-122</td><td></td></tr><tr><td>Dapi-Fluoromount-G</td><td>Southernbiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Longxiang</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine brushes</td><td>HWAHONG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine scissors</td><td>Jinzhong</td><td>y00030</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscopy</td><td>Olympus</td><td>BX63</td><td></td></tr><tr><td>freezing microtome</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>Hemostatic forceps straight with tooth</td><td>Jinzhong</td><td>J31010</td><td></td></tr><tr><td>Infusion needle 0.7 mm</td><td>Kindly group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine hydrochloride injection</td><td>Harvest Pharmaceutical Company</td><td>71230803</td><td></td></tr><tr><td>Magnifying glass</td><td>M&amp;G Chenguang Stationery</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Male C57/BL mice</td><td>The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research&ndash;BK Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mice coronal brain slice mold</td><td>RWD Life Science</td><td>68713</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube</td><td>biosharp</td><td>BS-02-P</td><td></td></tr><tr><td>Microtome blades</td><td>Leica</td><td>819</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic ointment</td><td>Cisen Pharmaceutical Company</td><td>G23HDM9M4S5</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Biosharp</td><td>BL539A</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pumps</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-4507</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Servicebio</td><td>G4202</td><td></td></tr><tr><td>Piette 2-200 &mu;L</td><td>thermofisher</td><td>4642080</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue</td><td>Beyotime</td><td>P0015A</td><td></td></tr><tr><td>Shaving blades</td><td>BFYING</td><td>91560618</td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>Citotest Scientific</td><td>188105</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxic apparatus</td><td>RWD Life Science</td><td>68807</td><td></td></tr><tr><td>Straight toothed dissecting forceps</td><td>Jinzhong</td><td>JD1060</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Holder</td><td>RWD Life Science</td><td>68206</td><td></td></tr><tr><td>Tissue scissors</td><td>Jinzhong</td><td>J21040</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T compound</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Tribromoethanol</td><td>Aibei Biotechnology</td><td>M2910</td><td></td></tr></tbody></table>

voorlopige validatie van stereotaxische injectiecoördinaten via cryosectie

Preliminary Validation of Stereotaxic Injection Coordinates via Cryosectioning

Stereotaxische injectie van een specifiek hersengebied vormt een fundamentele experimentele techniek in de fundamentele neurowetenschappen. Onderzoekers baseren hun keuze van stereotaxische injectieparameters gewoonlijk op muizenhersenatlassen of gepubliceerd materiaal dat verschillende populaties/leeftijden muizen en verschillende stereotaxische apparatuur gebruikte, waardoor verdere validatie van de stereotaxische coördinatenparameters nodig is. De werkzaamheid van calciumbeeldvorming, chemogenetische en optogenetische manipulaties is afhankelijk van de precieze expressie van reportergenen binnen het interessegebied, wat vaak enkele weken inspanning vereist. Het is dus een tijdrovende taak als de coördinaten van het doelhersengebied niet van tevoren worden geverifieerd. Door een geschikte kleurstof te gebruiken in plaats van een virus en cryosecties uit te voeren, kunnen onderzoekers de injectieplaats onmiddellijk na toediening van de kleurstof observeren. Dit vergemakkelijkt tijdige aanpassingen van de coördinatieparameters in gevallen waarin er discrepanties bestaan tussen de werkelijke injectieplaats en de theoretische positie. Dergelijke aanpassingen verbeteren de nauwkeurigheid van de virale expressie in het doelgebied in volgende experimenten aanzienlijk.

Deze studie identificeerde met succes de injectieplaats binnen 30 minuten met behulp van de gedemonstreerde methode. In eerste instantie werd een SDS-PAGE-oplossing voor het laden van monsters met broomfenolblauw geïnjecteerd in het LDTgV in de C57/BL-muizen. Figuur 1A toont een schematische weergave van de injectie met de kleurstofoplossing. De verdeling van de blauwe kleurstof in de LDTgV wordt geïllustreerd in figuur 1B.
Broomfenolblauw werd ook geïnjecteerd in de mPFC prelimbische cortex, mPFC infralimbische cortex en basomediale amygdala (BMA) om de universaliteit van dit protocol te beoordelen. Zoals te zien is in figuur 1C-E en figuur 2A, werd de blauwe kleurstof verdeeld in de mPFC prelimbische cortex, mPFC infralimbische cortex en BMA.
Bovendien werd een adeno-geassocieerd virus met een fluorescerend mCherry-eiwit in de LDTgV geïnjecteerd (de coördinaten werden geverifieerd met behulp van de kleurstofoplossing). De expressie van het virus duurde vier weken. De verdeling van mCherry+ neuronen in de LDTgV is weergegeven in figuur 2B.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66262/66262fig01.jpg"> Figuur 1: Injectie van de kleurstofoplossing. (A) Een schematisch diagram van de injectie van de kleurstofoplossing. (B) Verdeling van blauwe kleurstof in LDTgV. (C) Verdeling van blauwe kleurstof in mPFC prelimbische cortex. (D) Verdeling van blauwe kleurstof in mPFC infralimbische cortex. (E) Verdeling van blauwe kleurstof in BMA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66262/66262fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66262/66262fig02.jpg"> Figuur 2: Verdeling van blauwe kleurstof en mCherry verdeling bekeken onder de microscoop. (A) Verdeling van blauwe kleurstof in mPFC prelimbische cortex (10x vergroting, schaalbalk = 500 μm). (B) Representatief beeld van de mCherry-verdeling in het LDTgV-gebied verkregen door fluorescerende microscopie (10x vergroting, schaalbalk = 500 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66262/66262fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Het huidige protocol beschrijft een praktische strategie om de verificatiestap van stereotaxische injectiecoördinaten te versnellen voordat virale tracering wordt uitgevoerd met behulp van kleurstoffen en bevroren secties.

Voorlopige validatie van stereotaxische injectiecoördinaten via cryosectie

Stereotaxic injection of a specific brain region constitutes a fundamental experimental technique in basic neuroscience. Researchers commonly base their ...

Ons onderzoek richt zich voornamelijk op het onderzoeken van het neurale circuitmechanisme dat ten grondslag ligt aan cognitieve stoornissen bij muizen. En we gebruiken vaak stereotaxische technieken voor de hersenen in deze studies. Ons doel is om het verificatieproces voor stereotaxische injectieplaatsen met kleurstoffen te optimaliseren en te versnellen, zodat het een eenvoudige en snelle procedure wordt.Verschillende strategieën zijn cruciaal geworden in neurowetenschappelijk onderzoek door stereotaxische injectie van het virus. Dit wordt gevolgd door observatie van fluorescerende markers in weefselplak om de injectieplaatsen te bevestigen, een proces dat enkele weken in beslag neemt. Ons protocol biedt voordelen ten opzichte van andere technieken door ten minste drie dagen uitdrogingstijd te besparen en een kosteneffectieve kleurstof te gebruiken voor een snellere identificatie van injectieplaatsen.Het kan weken besparen in vergelijking met geen voorlopige verificatie.

preliminary-validation-stereotaxic-injection-coordinates-via

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Stereotaxische operatie aan knaagdieren zorgt voor doelgerichte toediening van geneesmiddelen of elektrische stimulatie en opnamen in wakker gedragen dieren. In deze video presentatie zullen we zien de laatste procedurele verfijningen aan deze langdurige procedure die met succes een verbeterde overleving en verminderde post-operatieve gewichtsverlies.

Knaagdier stereotaxische Chirurgie en Dierenwelzijn Outcome Verbeteringen voor Behavioral Neuroscience

Gerichte ablatie van specifieke gebied van de hersenen (en) via een infuus van een excitotoxin gebruik van stereotaxische coördinaten beschreven. Deze techniek kan ook worden aangepast voor infusie van andere stoffen in de rat.

Stereotaxische Chirurgie voor excitotoxische laesie van specifieke hersengebieden in de Adult Rat

Source: Joshi, K., et al. Stereotaxic Surgical Approach to Microinject the Caudal Brainstem and Upper Cervical Spinal Cord via the Cisterna Magna in Mice. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates the cisterna magna stereotaxic approach for targeted delivery to the brainstem and upper spinal cord. By accessing the cerebrospinal fluid-filled cisterna magna, this approach enables precise injections into areas that are difficult to reach using standard stereotaxic methods.

Stereotaxic Cisterna Magna Approach for Therapeutic Delivery in a Mouse Model

Source: Fricano-Kugler, C. J., et al. Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates stereotaxic viral injection for precise neuronal gene editing in the mouse brain. The protocol ensures accurate virus delivery to the dentate gyrus, enabling fluorescent labeling and CRISPR-mediated gene knockout to study neural circuits, gene function, and disease mechanisms in vivo.

Stereotaxic Viral Injection for Targeted Neuronal Gene Editing in the Mouse Brain

Stereotactische Electroencephalography (SEEG) is een operatietechniek gebruikt bij epilepsie chirurgie te helpen lokaliseren beslag brandpunten. Het biedt ook een unieke gelegenheid om de hersenfunctie te onderzoeken. Hier beschrijven we hoe SEEG kunnen worden gebruikt om cognitieve processen bij mensen te onderzoeken.

Bestudering van de functie van Deep Corticale en subcorticale structuren met behulp van stereotactische Electroencephalography: Lessen uit de anterior cingulate cortex

Hier presenteren we de methodologie voor het produceren van een focaal beroerte in muiswitte stof door lokale injectie van een irreversibele endotheel nitric oxide synthase (eNOS) remmer (L-Nio). Er worden twee stereotactische variaties, retrograad neurologisch traceren en verse weefsellabelling en dissectie gepresenteerd die de potentiële toepassingen van deze techniek uitbreiden.

Een veelzijdige muizenmodel van Subcortical White Matter Stroke voor de Studie van axonale degeneratie en White Matter Neurobiologie

Hier presenteren we een protocol om te bevriezen en afdeling hersenweefsel van meerdere dieren als een tijdbesparende alternatief voor één hersenen verwerken. Dit vermindert kleuring variabiliteit tijdens immunohistochemistry en vermindert de tijd cryosectioning en beeldvorming.

Gelijktijdige Cryosectioning van meerdere knaagdier hersenen

Dit protocol beschrijft een reeks methoden voor het identificeren van de cel-type specifieke functionele connectiviteit van lange-bereik ingangen van verre hersengebieden met behulp van optogenetische stimulaties in ex vivo hersenen segmenten.

In vivo intracerebrale Stereotaxic injecties voor Optogenetische stimulatie van lange-afstand ingangen in muis hersenen segmenten

Hier wordt een stereotactische procedure beschreven die zich kan richten op uitdagende en moeilijk bereikbare hersengebieden (vanwege ruimtelijke beperkingen) met behulp van een schuine coronale benadering. Dit protocol is aanpasbaar aan zowel muis- als rattenmodellen en kan worden toegepast op diverse neurowetenschappelijke toepassingen, waaronder canule-implantatie en micro-injecties van virale constructies.

Aanpasbare schuine stereotactische benadering voor veelzijdige neurowetenschappelijke technieken

Stereotaxische chirurgie om hersenlocaties bij muizen te targeten, omvat vaak toegang via de schedelbotten en wordt geleid door schedeloriëntatiepunten. Hier schetsen we een alternatieve stereotaxische benadering om de caudale hersenstam en het bovenste cervicale ruggenmerg te richten via de cisterna magna die afhankelijk is van directe visualisatie van hersenstamoriëntatiepunten.

Stereotaxische chirurgische benadering van micro-injecteren van de caudale hersenstam en het bovenste cervicale ruggenmerg via de Cisterna Magna bij muizen

Leer een geoptimaliseerde methode voor stereotaxische injectiecoördinaten in muizen met behulp van kleurstoffen voor snelle verificatie. Deze techniek verkort de tijd voor voorlopige validatie aanzienlijk en verbetert de efficiëntie van virale traceringstudies in de neurowetenschap.

Voorlopige validatie van stereotaxische injectiecoördinaten via cryosectie

Meer video's verkennen