Name: Fluorescentie-micropipetaspiratietest om mechanosensing van rode bloedcellen te onderzoeken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Leer de fluorescentie-micropipetaspiratietechniek om mechanosensing van rode bloedcellen te onderzoeken. Deze methode meet calciumionenflux bij toenemende aspiratiedruk en onthult mechanobiologische responsen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Nurul Aisha Zainal Abidin en Laura Moldovan voor extra donorwerving, bloedafname en ondersteuning bij aderlaten. We danken Tomas Anderson en Arian Nasser voor het organiseren van de apparatuur en reagentia. Dit onderzoek werd gefinancierd door het Australian Research Council (ARC) Discovery Project (DP200101970-L. A.J.); de National Health and Medical Research Council (NHMRC) van Australië Ideas Grant (APP2003904-L. A.J.); NHMRC-subsidie voor apparatuur-L.A.J.; NSW Cardiovasculair Capaciteitsopbouwprogramma (Early-Mid Career Researcher Grant-LAK); NSW CVRN-VCCRI Subsidie voor onderzoeksinnovatie; Bureau voor wereldwijde en onderzoeksbetrokkenheid (Sydney-Glasgow Partnership Collaboration Award-L.A.J.); L.A.J. is een National Heart Foundation Future Leader Fellow Level 2 (105863) en een Snow Medical Research Foundation Fellow (2022SF176).

Dit protocol volgt de richtlijnen van en is goedgekeurd door de Human Research Ethics Committee van de Universiteit van Sydney. Voor dit onderzoek werd geïnformeerde toestemming verkregen van de donoren.
1. Isolatie van menselijke RBC
OPMERKING: Stap 1.1 moet worden uitgevoerd door een getrainde flebotomist met behulp van een protocol dat is goedgekeurd door de Institutional Review Board.
<ol><li>Neem 5 ml bloed op uit de mediane cubitale ader met behulp van een vlindernaald van 19 G.</li>
	<li>Breng het verzamelde bloed over in een buisje van 15 ml met 1:200 enoxaparine om stolling te voorkomen.</li>
	<li>Verdun 5 μL enoxaparine-antistollingsbloed in 1 ml carbonaat/bicarbonaatbuffer (C-buffer, pH = 8,5-9; Tabel met materialen).</li>
	<li>Centrifugeer het verdunde bloedmonster bij 900 × g gedurende 1 minuut om de rode bloedcellen te bezinken. Decanteer het supernatans voorzichtig zonder de pellet te verstoren.</li>
	<li>Voer twee wasbeurten van de RBC-pellet uit met 1 ml C-buffer (materiaaltabel) en centrifugeer elke keer op 900 × g gedurende 1 minuut.</li>
	<li>Was vervolgens de RBC-pellet 2x met 1 ml Tyrode-buffer onder dezelfde centrifugatieomstandigheden en resuspendeer vervolgens de uiteindelijke pellet in 1 ml Tyrode-buffer om de gewassen voorraad RBC-suspensie te verkrijgen.</li>
</ol>2. Belasting van de calciumindicator
<ol><li>Stel de concentratie van de gewassen RBC-oplossing in op 10 × 106 cellen/ml in de buffer van Tyrode, op basis van het celgetal dat is verkregen met behulp van een automatische celteller (Tabel met materialen).</li>
	<li>Label het calcium in de rode bloedcellen door te incuberen met 16,67 μM Cal-520 AM, een calciumgevoelige kleurstof, terwijl u gedurende 1 uur op een roterende buismixer roert.</li>
	<li>Verdun de rode bloedcellen in de buffer van Tyrode die 0,5% runderserumalbumine (BSA) bevat in een verhouding van 1:50. De cellen zijn nu klaar voor experimenteel gebruik.</li>
</ol>3. Fabricage van micropipetten
<ol><li>Monteer de capillaire buis van borosilicaatglas (1 mm buitendiameter x 0,6 mm binnendiameter) op de P-1000 micropipettrekker om twee overeenkomstige micropipetten met gesloten punten op de trekplaats te produceren met behulp van het vooraf ingestelde trekprogramma. Gebruik voor deze opstelling de volgende waarden van het trekprogramma: warmte 516, trekkracht 150, snelheid 75, tijd 250 en druk 500. OPMERKING: Verwarmings- en trekparameters die in het trekprogramma zijn ingesteld, kunnen worden aangepast en zijn afhankelijk van de gewenste instellingen van het experimentele ontwerp12. CONTROLEPUNT (zie aanvullende tabel S1).</li>
	<li>Open de gesloten punt door een van de micropipetten met gesloten uiteinde te monteren die zijn verkregen nadat u aan de micropipetsnijder hebt getrokken. Stel de verwarmingstemperatuur in op ongeveer 50-60 °C.</li>
	<li>Lokaliseer de micropipet met behulp van een 10x oculair. Beweeg de micropipet dicht bij de borosilicaatglaskraal met behulp van de knoppen voor afstelling.</li>
	<li>Verander het oculair op 30x voordat u de micropipet zo dicht mogelijk bij de borosilicaatglaskraal plaatst zonder de pipetpunt te buigen.</li>
	<li>Maak de borosilicaatglasparel zacht met behulp van warmte door op het verwarmingspedaal te gaan staan. Steek de onbewerkte gesloten micropipetpunt voorzichtig in de zachte kraal totdat het gewenste eindpunt, de openingsdiameter, is bereikt.</li>
	<li>Laat het voetpedaal los en laat de glasparel afkoelen. Zorg ervoor dat de punt van de micropipet altijd in de kraal blijft. NOTITIE: Het verder inbrengen van de punt leidt tot grotere openingsdiameters.</li>
	<li>Haal de micropipet er voorzichtig uit, zodat u een duidelijke rechte snede in de gesloten micropipet krijgt. Controleer of de uiteindelijke diameter van het capillair 1 μm is. OPMERKING: CONTROLEPUNT (zie aanvullende tabel S1)</li>
</ol>4. Voorbereiding van de celkamer
<ol><li>Gebruik een diamantpotlood om een standaard glazen dekglaasje van 40 mm x 22 mm x 0,17 mm in drie gelijke stroken te verdelen.</li>
	<li>Plak een stuk van het dekglaasje van geslepen glas op de bodem van een zelfgemaakte kamerhouder met vacuümvet. NOTITIE: De kamerhouder bestaat uit twee metalen (koper/aluminium) vierkanten die met elkaar verbonden zijn door een gebogen handvat. De afstand tussen de metalen blokken moet minder dan 40 mm zijn om het gesneden dekglaasje aan de houder te laten hechten en een parallelle kamer te vormen.</li>
	<li>Plak het tweede stuk van het dekglaasje van geslepen glas met vacuümvet aan de bovenkant van de zelfgemaakte kamerhouder. OPMERKING: CONTROLEPUNT (zie aanvullende tabel S1)</li>
	<li>Injecteer 200 μl van de gelabelde RBC-suspensie tussen twee dekglaasjes met behulp van een pipetpistool van 200 μl (figuur 1).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66265/66265fig01.jpg"> Figuur 1: Illustratie van de celkamer. Twee gesneden stukken van een glasafdekglaasje van 40 mm x 22 mm x 0,17 mm worden met vet op de kamerhouder geplakt. Tussen de twee geslepen glazen dekglaasjes wordt ongeveer 200 μL van de celoplossing in Tyrode's Buffer gezaaid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66265/66265fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
5. Aspiratie-assemblage voor micropipetten
<ol><li>Monteer de celkamer op de houdertafel die aanwezig is op het microscoopplatform. Pas de positie zo aan dat de celkamer zich direct boven het objectief bevindt (Figuur 2B).</li>
	<li>Laat de micropipethouder zakken tot onder het vloeistofniveau van het aangesloten waterreservoir.</li>
	<li>Injecteer gedemineraliseerd water of de buffer van Tyrode in de gefabriceerde micropipet en verwijder voorzichtig alle luchtbellen met behulp van een spuit in combinatie met een naald van 34 G (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Schroef het uiteinde van de micropipethouder halverwege los en laat het water enkele seconden uit de micropipethouder druppelen. OPMERKING: CONTROLEPUNT (zie aanvullende tabel S1)</li>
	<li>Steek de micropipet in de punt van de houder. Draai de schroef van de houder vast om ervoor te zorgen dat de micropipet vastzit.</li>
	<li>Steek de micropipet in de celkamer en lokaliseer de micropipet en rode bloedcellen onder de microscoop. Gebruik de micromanipulator om de positie aan te passen.</li>
	<li>Laat de punt van de micropipet verder zakken om ervoor te zorgen dat de punt waterpas staat met de geplaatste rode bloedst. OPMERKING: CONTROLEPUNT (zie aanvullende tabel S1)</li>
	<li>Stel de hydraulische druk op de punt van de micropipet op nul door de hoogte van het waterreservoir aan te passen. Til vervolgens het waterreservoir iets op om een subtiele positieve druk aan de punt te genereren.</li>
</ol>6. Voer de fluorescentiegekoppelde micropipetaspiratietest uit
<ol><li>Schakel de 488 nm fluorescerende excitatielichtbron in. Schakel de fluorescentiesluiter in dit stadium niet in om fotobleken te voorkomen (Figuur 2C). Schakel de fluorescentiecamera en de uitgezonden camera in. NOTITIE: Beide camera's worden bediend met de juiste software (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Stel de gewenste belichtingstijd (100 ms voor beide camera's in dit onderzoek), interessegebied (ROI), binninggrootte (geen voor dit onderzoek) in voor beide camera's in de software. Open het multidimensionale acquisitiepaneel om het acquisitieframenummer, 2,000 voor dit onderzoek en de opslagmap in te stellen. OPMERKING: Het acquisitieframenummer is afhankelijk van het gewenste aantal aspiratiegebeurtenissen dat moet worden geregistreerd. Voor 1 aspiratiegebeurtenis moet het bereik van het acquisitiegetal worden ingesteld op 100-500, wat ongeveer 10-50 s is.</li>
	<li>Zoek de micropipet onder het gezichtsveld met behulp van de micromanipulator.</li>
	<li>Schakel de pneumatische drukklem in, inclusief de schakelkast en het klemsysteem (Figuur 2A). Zorg ervoor dat de schakelkast in de EXTRNL-modus staat. Compenseer eventuele offsetdruk in het systeem door langzaam aan de knop te draaien.</li>
	<li>Schakel de aparte software in die de pneumatische klem aanstuurt. De software heeft een elektrisch bedieningspaneel om de discrete analoge ingang naar het klemsysteem aan te sturen. De druk wordt geregeld met een omrekeningsfactor van 20 mV/mmHg.</li>
	<li>Zet de druk in het systeem op nul. Plaats de micropipet voorzichtig dicht bij de rode bloedcellen. Pas de positie van het waterreservoir aan totdat een subtiele positieve druk wordt opgemerkt aan de punt van de micropipet.</li>
	<li>Start de acquisitie in de camera-bedieningssoftware. Schakel de fluorescentiesluiter in.</li>
	<li>Zuig een RBC op door de berekende spanningsgrootte in het bedieningspaneel in te typen om de gewenste druk te bereiken. OPMERKING: De druk voor het aanzuigen van een RBC ligt meestal in het bereik van Δp = -5 tot -40 mmHg. Er moet een merkbare verlenging van de tong in de punt van de micropipet zijn (Figuur 2D).</li>
	<li>Houd de druk vast gedurende een vooraf ingestelde periode; Laat vervolgens de druk los.</li>
	<li>Beweeg de micropipet om de volgende cel op te pakken en herhaal het experiment.</li>
</ol>7. Analyse van de fluorescentie-intensiteit
<ol><li>Laad de opgeslagen fluorescentiebeelden in de analysesoftware.</li>
	<li>Pas de intensiteitsdrempel aan met behulp van het tabblad Beeldschermaanpassing . Doe dit door de waarden handmatig in te voeren of door de schuifregelaar te gebruiken om ervoor te zorgen dat de fluorescentiebeelden een duidelijk contrast van de cel in de analysesoftware laten zien (zie Aanvullend bestand 1-Aanvullende afbeelding S1).</li>
	<li>Scroll naar de tijdlijn onderaan de software. Zoek de aangewezen aspiratiegebeurtenis.</li>
	<li>Klik op Nieuwe oppervlakken toevoegen. Definieer de ROI van de analyse. OPMERKING: De software biedt een begeleid proces in vijf stappen om de segmentatie aan te passen en te voltooien (zie Aanvullend bestand 1-Aanvullende afbeelding S2 en aanvullende afbeelding S3). OPMERKING: Houd de ROI zo klein mogelijk om rekenkracht te besparen.</li>
	<li>Gebruik de schuifregelaar voor aftrekken op de achtergrond en pas de segmentatiedrempel aan met de schuifregelaar om het beste segmentatieresultaat te verkrijgen. OPMERKING: Dit betekent dat, afgezien van de aspiratiegebeurtenis, de achtergrond zo nauwkeurig mogelijk moet worden gesegmenteerd (zie Aanvullend bestand 1-Aanvullende afbeelding S4 en aanvullende afbeelding S5).</li>
	<li>Voeg een vlakfilter toe om achtergrondgeluiden uit te sluiten (zie Aanvullend bestand 1-Aanvullende afbeelding S6). OPMERKING: Dit wordt voltooid in de fase na het proces.</li>
	<li>Selecteer het tabblad Statistieken | Tabblad Gedetailleerd | Tabblad Gemiddelde waarden . Scroll om het intensiteitsgemiddelde te vinden en te selecteren (zie Aanvullend bestand 1-Aanvullende afbeelding S7).</li>
	<li>Exporteer het fluorescentiesignaalspoor in de loop van de tijd naar een .csv bestand.</li>
	<li>Open het geëxporteerde csv-bestand. Trek de achtergrondsignalen, Fb, af van alle metingen.</li>
	<li>Bereken de verandering van de calciumintensiteit, ΔFmax, met behulp van vergelijking (1): <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66265/66265eq01.jpg" style="margin: auto;">(1) Waarbij ΔFmax de maximale verandering van calciumintensiteit is, Fb de achtergrondintensiteit en F0 de rustintensiteit.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66265/66265fig02.jpg"> Figuur 2: Fluorescentie-gekoppelde micropipetaspiratie-assemblage. (A) Een overzicht van het fMPA-hardwaresysteem waarin de omgekeerde microscoop is geïntegreerd in combinatie met de helderveld- en fluorescentiecamera's. De linkerkant van de afbeelding toont de zelfgemaakte watermanometer en de schakelkast waarmee de druk van de pneumatische drukpomp nauwkeurig kan worden afgesteld. (B) De microscooptafel met de experimentcelkamer en het micromanipulatorsysteem met een enkele micropipet. (C) Schema van de opstelling van het fMPA-systeem. Gelijktijdige beeldvorming van helderveld- (geel) en fluorescentiesignalen (blauwe emissie, groene excitatie) met behulp van twee dichroïsche spiegels om de lichtpaden van de fluorescentielichtbron (blauw) naar het doel te leiden en vervolgens naar de camera's voor beeldvorming (groen). (D) De bovenste rij toont de helderveldbeelden, terwijl de onderste rij de fluorescentiebeelden toont. De linker vertegenwoordigt de positie van de micropipet vóór aspiratie wanneer de rode bloedcellen in rust zijn. De middelste kolom geeft een momentopname van het aspiratieproces waarbij de RBC een negatieve druk van -40 mmHg ervaart. Rechts wordt de celmorfologie weergegeven na het ervaren van de negatieve aspiratiedruk. Schaalbalk = 5 μm. Afkortingen: fMPA = Fluorescence-coupled Micropipette Aspiration; DM = dichroïsche spiegel; RBC = rode bloedcel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66265/66265fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Eencellige mechanobiologie met behulp van fluorescentie-micropipetaspiratie

<ol><li>González-Bermúdez, B., Guinea, G. V., Plaza, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+micropipette+aspiration%3A+applications+in+cell+biomechanics%2C+models%2C+and+extended+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Advances in micropipette aspiration: applications in cell biomechanics, models, and extended studies.</a> Biophysical Journal. 116 (4), 587-594 (2019).</li>
<li>Mierke, C. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMierke%2C+CT+%22Physics+of+Cancer%2C+Volume+3+%28Second+Edition%29%3A+Experimental+biophysical+techniques+in+cancer+research%22">Physics of Cancer, Volume 3 (Second Edition): Experimental biophysical techniques in cancer research</a>. , IOP Publishing. (2021).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+F-BAR+protein+CIP4+reduces+platelet+production+by+impairing+membrane-cytoskeleton+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Loss of the F-BAR protein CIP4 reduces platelet production by impairing membrane-cytoskeleton remodeling.</a> Blood. 122 (10), 1695-1706 (2013).</li>
<li>Shin, J. -W., Swift, J., Spinler, K. R., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin-II+inhibition+and+soft+2D+matrix+maximize+multinucleation+and+cellular+projections+typical+of+platelet-producing+megakaryocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Myosin-II inhibition and soft 2D matrix maximize multinucleation and cellular projections typical of platelet-producing megakaryocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 11458-11463 (2011).</li>
<li>Liapis, H., Foster, K., Miner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+cell+traverse+through+thin+glomerular+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Red cell traverse through thin glomerular basement membrane.</a> Kidney International. 61 (2), 762-763 (2002).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-coupled+micropipette+aspiration+assay+to+examine+calcium+mobilization+caused+by+red+blood+cell+mechanosensing%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-coupled micropipette aspiration assay to examine calcium mobilization caused by red blood cell mechanosensing.</a> European Biophysics Journal. 51 (2), 135-146 (2022).</li>
<li>Danielczok, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cell+passage+of+small+capillaries+is+associated+with+transient+Ca2%2B-mediated+adaptations%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Red blood cell passage of small capillaries is associated with transient Ca2+-mediated adaptations.</a> Frontiers in Physiology. 8, 979(2017).</li>
<li>Diez-Silva, M., Dao, M., Han, J., Lim, C. -T., Suresh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+and+biomechanical+characteristics+of+human+red+blood+cells+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Shape and biomechanical characteristics of human red blood cells in health and disease.</a> MRS Bulletin. 35 (5), 382-388 (2010).</li>
<li>Maître, J. -L., Niwayama, R., Turlier, H., Nédélec, F., Hiiragi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsatile+cell-autonomous+contractility+drives+compaction+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pulsatile cell-autonomous contractility drives compaction in the mouse embryo.</a> Nature Cell Biology. 17 (7), 849-855 (2015).</li>
<li>Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+unfolding+of+distinctive+mechanoreceptor+domains+transduces+force+into+signals%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals.</a> eLife. 5, e15447(2016).</li>
<li>Bogdanova, A., Makhro, A., Wang, J., Lipp, P., Kaestner, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+in+red+blood+cells-a+perilous+balance%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Calcium in red blood cells-a perilous balance.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (5), 9848-9872 (2013).</li>
<li>Oesterle, A. Pipette Cookbook 2018. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf">https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf</a> (2018).</li>
<li>Cahalan, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezo1+links+mechanical+forces+to+red+blood+cell+volume%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume.</a> eLife. 4, e07370(2015).</li>
<li>Sforna, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezo1+controls+cell+volume+and+migration+by+modulating+swelling-activated+chloride+current+through+Ca2%2B+influx%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Piezo1 controls cell volume and migration by modulating swelling-activated chloride current through Ca2+ influx.</a> Journal of Cellular Physiology. 237 (3), 1857-1870 (2022).</li>
<li>High speed pressure clamp. ALA Scientific Instruments. , ALA Scientific. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://alascience.com/products/hspc-2sb/">https://alascience.com/products/hspc-2sb/</a> (2023).</li>
<li>Teledyne Imaging Prime 95BTM Scientific CMOS Camera Datasheet. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.photometrics.com/wp-content/uploads/2019/10/Prime-95B-Datasheet-07172020.pdf">https://www.photometrics.com/wp-content/uploads/2019/10/Prime-95B-Datasheet-07172020.pdf</a> (2020).</li>
<li>Lee, L. M., Lee, J. W., Chase, D., Gebrezgiabhier, D., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+advanced+microfluidic+micropipette+aspiration+device+for+single+cell+mechanics+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Development of an advanced microfluidic micropipette aspiration device for single cell mechanics studies.</a> Biomicrofluidics. 10 (5), 054105(2016).</li>
<li>Weaver, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+high-throughput+single-cell+microtechnologies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in high-throughput single-cell microtechnologies.</a> Current Opinion in Biotechnology. 25, 114-123 (2014).</li>
<li>Zhou, E. H., Lim, C. T., Quek, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finite+element+simulation+of+the+micropipette+aspiration+of+a+living+cell+undergoing+large+viscoelastic+deformation%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanics+of+Advanced+Materials+and+Structures%22%5BJournal%5D)">Finite element simulation of the micropipette aspiration of a living cell undergoing large viscoelastic deformation.</a> Mechanics of Advanced Materials and Structures. 12 (6), 501-512 (2005).</li>
<li>Oh, M. -J., Kuhr, F., Byfield, F., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropipette+aspiration+of+substrate-attached+cells+to+estimate+cell+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Micropipette aspiration of substrate-attached cells to estimate cell stiffness.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e3886(2012).</li>
<li>Rand, R. P., Burton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+the+red+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of the red cell membrane.</a> Biophysical journal. 4 (4), 303-316 (1964).</li>
<li>Hogan, B., Babataheri, A., Hwang, Y., Barakat, A. I., Husson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+cell+adhesion+by+using+micropipette+aspiration%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterizing cell adhesion by using micropipette aspiration.</a> Biophysical Journal. 109 (2), 209-219 (2015).</li>
<li>Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+membrane+elasticity+by+micro-pipette+aspiration%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Physical+Journal+E%22%5BJournal%5D)">Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration.</a> The European Physical Journal E. 14 (2), 149-167 (2004).</li>
<li>Hochmuth, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropipette+aspiration+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Micropipette aspiration of living cells.</a> Journal of Biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).</li>
<li>Pu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropipette+aspiration+of+single+cells+for+both+mechanical+and+electrical+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Micropipette aspiration of single cells for both mechanical and electrical characterization.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 66 (11), 3185-3191 (2019).</li>
<li>Guevorkian, K., Maître, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+10+-+Micropipette+aspiration%3A+A+unique+tool+for+exploring+cell+and+tissue+mechanics+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 10 - Micropipette aspiration: A unique tool for exploring cell and tissue mechanics in vivo.</a> Methods in Cell Biology. , 187-201 (2017).</li>
<li>Biro, M., Maître, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+14+-+Dual+pipette+aspiration%3A+A+unique+tool+for+studying+intercellular+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 14 - Dual pipette aspiration: A unique tool for studying intercellular adhesion.</a> Methods in Cell Biology. 125, 255-267 (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen te melden hebben met betrekking tot de huidige studie.

Aspiratietests voor micropipetten belichamen een verfijnde methodologie, waarbij substantiële drukmodulatie, exacte ruimtelijke orkestratie en betrouwbaar temporeel onderscheidingsvermogen worden gebruikt om de diepgaande fijne kneepjes van cellulaire biomechanica te onderzoeken. Deze studie legt bijzondere nadruk op de toepassing van fMPA als een cruciaal hulpmiddel voor het onthullen van de genuanceerde mechanosensitieve reacties die RBC's onder verschillende stimuli vertonen. Het gelijktijdige gebruik van helderveld- en fluorescentiesignalen maakte een veelzijdige verkenning van cellulaire verschijnselen mogelijk, waardoor de monitoring en detectie van intracellulaire calciuminstroom in realtime werd bevorderd. Deze benadering geeft een integratief inzicht in de complexe mechanosensieve reacties van RBC's.
Belangrijk is dat de toepasbaarheid van de fMPA-techniek verder reikt dan RBC's, omdat deze kan worden gebruikt met andere celtypen die een hoge mechanische gevoeligheid niet toepassen, zoals bloedplaatjes enneuronen. Bovendien garandeert fMPA, vanwege de minimale impact op de celintegriteit tijdens experimentele behandeling, het behoud van de natuurlijke staat van de cel, waardoor het zeer geschikt is voor gebruik met primaire cellen1. Bovendien biedt de fMPA-methode veelzijdigheid door de afstembare geometrie van de micropipetten, waardoor een breder scala aan experimentele ontwerpen mogelijk is die zijn afgestemd op specifieke onderzoeksvragen en de effectieve verkenning van verschillende mechanische omstandigheden.
Bovendien, met de verbetering van de optische route die het gelijktijdige gebruik van multifluorescentiebeeldvorming verbetert, maakt het fMPA-systeem real-time detectie van de intracellulaire calciumconcentratie bij aspiratie mogelijk. Dit vermogen opent de mogelijkheid om calciumgerelateerde moleculen te onderzoeken, zoals het mechanosensitieve ionenkanaal, PIEZO1, waarvan is aangetoond dat het mechanische signalen van de externe omgeving bemiddelt en waarneemt 7,14. Recente literatuur wijst op een toename van de membraanspanning als een belangrijke factor die de activiteit van het PIEZO1-kanaal stimuleert, waardoor de Ca2+-instroom6 wordt vergemakkelijkt. Dit onderstreept een cruciale toepassing van fMPA, namelijk het onderzoeken van de wisselwerking tussen membraanspanning, PIEZO1 en calciuminstroom, en licht werpen op de ingewikkelde mechanosensingprocessen in cellen.
Vanuit technisch oogpunt is het vermeldenswaard dat de twee primaire componenten van het fMPA-systeem, die verantwoordelijk zijn voor het genereren van de aspiratiekracht (mechanische stimuli) en het uitvoeren van real-time fluorescentiebeeldvorming, respectievelijk de pneumatische drukpomp en de fluorescentiecamera zijn. De keuze van de juiste pomp en camera voor het systeem moet gebaseerd zijn op het specifieke celtype en het biologische proces dat wordt bestudeerd. De pomp die in ons systeem wordt gebruikt, werkt binnen een stationair drukbereik van ± 200 mmHg en kan reageren op commando's voor drukveranderingen die zo groot zijn als ± 200 mmHg. De drukstijgings- en dalingstijd mag niet langer zijn dan 6-8 ms voor een stap van 20 mmHg en 15-20 ms voor een stap van 200 mmHg. Om krachtresolutie te garanderen, moet het ruisniveau van het HSPC-systeem minder zijn dan ± 0.5 mmHg, piek-tot-piek. Deze eisen worden in deze opzet toegepast; een bereik van ± 40 mmHg is echter voldoende om een respons te bereiken voor het experimentele protocol15. Wat de fluorescentiecamera betreft, hebben we een 95% Quantum Efficiency en een chip van 11 μm x 11 μm pixelgrootte geselecteerd. Deze gevoelige sensorconfiguratie vangt het fluorescentiesignaal efficiënt op met hoge snelheid. Bovendien is het van cruciaal belang om een mediane leesruis van 1,6e- aan te houden voor een adequate signaal-ruisverhouding tijdens beeldvorming16.
Vanuit een procedureel perspectief vereist het uitvoeren van fMPA een reeks geavanceerde vaardigheden. Het maken van micropipetten met behulp van de micropipetsnijder vereist bijvoorbeeld precisie en behendigheid, samen met een nauwgezette controle van temperatuur en positionering. Het plaatsen van de micropipet binnen het gezichtsveld van de microscoop vereist een nauwgezette inspanning om schade aan zowel de punt van de micropipet als de celkamer te voorkomen. Bovendien is fotobleken een veel voorkomende uitdaging in verband met fluorescentiebeeldvorming. Om dit probleem te verhelpen, is het belangrijk om de blootstellingstijd van het monster aan het verlichtingssysteem te minimaliseren. Onder verwijzing naar het protocol 'fluorescentie-gekoppelde micropipetaspiratietest' blijft de fluorescentiesluiter van de excitatielichtbron uitgeschakeld totdat alle parameters via de camerabedieningssoftware zijn ingevoerd en het aspiratiesysteem klaar is voor experimenten. Pas dan wordt de fluorescentiesluiter ingeschakeld om de beeldvorming te starten. Om het fotobleken verder te verminderen, wordt aanbevolen om de minimale intensiteit van de lichtbron te gebruiken die nog steeds voldoende fluorescentie-expressie in het monster oplevert.
Bovendien maakt de huidige handmatige handeling die nodig is voor fMPA-assays deze techniek arbeidsintensief. Bijgevolg zijn de inconsistenties die in deze test kunnen optreden, voornamelijk het gevolg van operatorafhankelijke variabelen, evenals de factoren die verband houden met variaties in het voorverwarmen van gloeidraden en de kenmerken van capillair glas. Om de prestaties van deze techniek in de toekomst te optimaliseren, moet rekening worden gehouden met mogelijke tandemimplementaties. In combinatie met microfluïdische apparaten kan de micropipetaspiratie bijvoorbeeld worden omgezet in een platform met hoge doorvoer, waardoor de experimentele snelheid aanzienlijk wordt verhoogd van het bestuderen van ongeveer 20 cellen per uur tot ongeveer 1.000 cellen/uur 17,18. Deze integratie verbetert ook de reproduceerbaarheid van de gegevens. Bovendien zijn bepaalde wegen met succes verkend door automatiserings- en beeldanalysesystemenop te nemen 19. Met name eindige-elementenanalyse (FEA) is een computationeel hulpmiddel dat vaak wordt gebruikt om micropipetaspiratietests te modelleren. FEA kan de cellulaire respons op mechanische stimuli voorspellen en hun mechanische eigenschappen karakteriseren. Het heeft het potentieel om het ontwerp van de micropipet te optimaliseren en de experimentele resultaten verder te valideren19.
Concluderend biedt de fMPA-benadering waardevolle inzichten in het mechanosensitieve gedrag van RBC's bij het reageren op mechanische stimuli. Deze studie stelt een fundamenteel kader vast voor toekomstig onderzoek naar de ingewikkelde mechanismen van mechanotransductie binnen RBC's en in bredere biologische systemen. Dergelijke onderzoeken zijn veelbelovend voor het bevorderen van ons begrip van deze mechanismen en het ontrafelen van hun uitgebreide implicaties in verschillende fysiologische contexten.

De ontdekkingen in de wereld van cellulair gedrag hebben de rol van mechanische stimuli, zoals spanning, vloeistofschuifspanning, compressie en substraatstijfheid, geaccentueerd bij het dicteren van dynamische cellulaire activiteiten zoals adhesie, migratie en differentiatie. Deze mechanobiologische aspecten zijn van het grootste belang bij het ophelderen van hoe cellen interageren met en reageren op hun fysiologische omgeving, wat van invloed is op verschillende biologische processen 1,2.
In het afgelopen decennium hebben aspiratietests op basis van micropipetten zich onderscheiden als een veelzijdig hulpmiddel bij het bestuderen van diverse cellulaire reacties op mechanische stimuli. Deze techniek biedt waardevolle inzichten in de intrinsieke mechanische eigenschappen van levende cellen op het niveau van één cel, waaronder cellulaire elastische modulus, stijfheid en corticale spanning. Deze tests maken het mogelijk om verschillende mechanische parameters te meten, zoals celmembraanspanning, druk uitgeoefend op het celmembraan en corticale spanning (samengevat in tabel 1). Het bestuderen van de aspirationele krachten heeft ons begrip verrijkt van hoe ze cellulaire functies en processen beïnvloeden, met name op het gebied van membraandynamica, inclusief fragmentatie, verlenging en ontluikende 3,4.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Mechanische parameter</td>
			<td>Beschrijving</td>
			<td>Baanbrekende benaderingen</td>
		</tr><tr><td>Celstijfheid</td>
			<td>Meting van de mechanische stijfheid en elasticiteit van een cel.</td>
			<td>Aspiratie van het celmembraan en analyse van de vervormingsreactie op de negatieve druk20,21.</td>
		</tr><tr><td>Hechtende sterkte</td>
			<td>Evaluatie van hoe sterk cellen zich hechten aan oppervlakken.</td>
			<td>Toepassing van gecontroleerde zuigkracht om verkleefde cellen los te maken van een substraat2,22.</td>
		</tr><tr><td>Membraan spanning</td>
			<td>Beoordeling van de spanning of spanning in celmembranen.</td>
			<td>Meting van de vervorming van het membraan als reactie op uitgeoefende druk23,24.</td>
		</tr><tr><td>Visco-elastische eigenschappen</td>
			<td>Karakterisering van het gecombineerde viskeuze en elastische gedrag van een cel.</td>
			<td>Analyse van de tijdsafhankelijke vervormingsrespons op aspiratie23,25.</td>
		</tr><tr><td>Vervormbaarheid</td>
			<td>Bepaling van hoe gemakkelijk een cel van vorm kan veranderen.</td>
			<td>Evaluatie van de mate van vervorming bij gecontroleerde afzuiging20,24.</td>
		</tr><tr><td>Oppervlaktespanning</td>
			<td>Meting van de spanning aan het celoppervlak.</td>
			<td>Bepaling van de druk die nodig is om een uitsteeksel van het micropipetmembraan te vormen26.</td>
		</tr><tr><td>Interactie tussen cel en materiaal</td>
			<td>Studie van interacties tussen cellen en materialen of substraten.</td>
			<td>Aspiratie van cellen die in contact komen met verschillende materialen en observatie van interacties2,24.</td>
		</tr><tr><td>Cel-cel interactie</td>
			<td>Onderzoek naar interacties tussen naburige cellen.</td>
			<td>Aspiratie van een groep cellen en analyse van hun intercellulaire krachten27.</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Mechanische parameters die worden gekarakteriseerd door de micropipetaspiratietest.
De op micropipetten gebaseerde aspiratietechniek is op grote schaal gebruikt om rode bloedcellen (RBC's) te bestuderen, waarbij de vervormbaarheid en verschillende mechanische kenmerken van RBC's worden beoordeeld, wat essentieel is om hun functie in de bloedsomloop te begrijpen. RBC's vertonen een opmerkelijk aanpassingsvermogen en behouden hun mechanische veelzijdigheid tegen vervorming bij het navigeren door het ingewikkelde capillaire netwerk en inter-endotheliale spleten 5,6. Tijdens deze reis moeten RBC's doorgangen doorkruisen die zo smal zijn als 0,5-1,0 μm, waarbij ze zichzelf blootstellen aan een groot aantal mechanische krachten, waaronder spanning en compressie 7,8,9. Ze zijn ook zeer gevoelig voor de schuifspanning die wordt gegenereerd door de bloedstroom tijdens de bloedsomloop10. Deze processen bevorderen de activering van regulerende mechanismen met betrekking tot calciuminstroom, een cruciale signaleringsgebeurtenis met een gevestigde rol in cellulaire reacties op mechanische stimuli11,12. De complexe mechanismen die de calcium-gemedieerde mechanosensing beheersen, blijven boeiende onderwerpen van lopend onderzoek.
In deze context is de fMPA een effectieve benadering om de mate van calciummobilisatie onder nauwkeurig gecontroleerde mechanische krachten te onthullen, waardoor de gelijktijdige toepassing van mechanische modulatie (met behulp van het micropipetaspiratiesysteem) en visualisatie van calciumintensiteit (met behulp van fluorescerende indicatoren) mogelijk wordt. Het bootst met name het fysiologische scenario na wanneer de rode bloedcellen door vernauwende bloedvaten reizen. Het is vermeldenswaard dat het door ons ontwikkelde fMPA-systeem druk kan genereren met een resolutie van 1 mmHg. De geïmplementeerde hogesnelheidscamera kan een temporele resolutie van 100 ms en een ruimtelijke resolutie op submicronmeterniveau bereiken. Deze configuraties zorgen voor de nauwkeurige toepassing van mechanische krachten op levende cellen en vangen tegelijkertijd de resulterende cellulaire signalering op. Bovendien kan de micropipetaspiratietest, vanwege het integratieve technische karakter van deze opstelling, gemakkelijk worden aangepast om andere apparatuur of technieken aan te vullen, waardoor de fijne kneepjes van de celmechanica verder kunnen worden onderzocht. Deze veelzijdigheid is een bijkomend voordeel van deze aanpak.

<table><tbody><tr><td>&micro;Manager</td><td>Micro-Manager</td><td></td><td>Version 2.0.0</td></tr><tr><td>1 mL Syringe&nbsp;</td><td>Terumo</td><td>210320D</td><td>Samenwerken met de Microfil&nbsp;</td></tr><tr><td>200 &micro;L Pipette&nbsp;</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>3123000055</td><td>Rode bloedcelvoorbereiding</td></tr><tr><td>22 x 40 mm Deksels</td><td>Knittel Glass&nbsp;</td><td>MS0014</td><td>Celkamersamenstelling</td></tr><tr><td>50 mL Syringe&nbsp;</td><td>Terumo</td><td>220617E</td><td>Aansluiten op de watertoren</td></tr><tr><td>Calcium Chloride (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>Tryode's&nbsp; buffervoorbereiding - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl en 5.5 mM D-glucose aangevuld met 1 mM CaCl2. Eind pH = 7.2</td></tr><tr><td>Centrifuge 5425</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5405000280</td><td>Rode bloedcelvoorbereiding</td></tr><tr><td>Clexane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1235820</td><td>Om stolling van het verzamelde bloed te voorkomen. 10.000 U/mL</td></tr><tr><td>DAQami</td><td>Diligent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentie lichtbron</td><td>CoolLED</td><td>pE-300</td><td>Micropipet aspiratie hardware systeem</td></tr><tr><td>Glas capillair</td><td>Narishige</td><td>G-1</td><td>Micropipet fabricage</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Tryode's&nbsp; buffervoorbereiding - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl en 5.5 mM D-glucose aangevuld met 1 mM CaCl2. Eind pH = 7.2</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td>Tryode's&nbsp; buffervoorbereiding - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl en 5.5 mM D-glucose aangevuld met 1 mM CaCl2. Eind pH = 7.2</td></tr><tr><td>High speed GigE camera</td><td>Manta</td><td>G-040B</td><td>Micropipet aspiratie hardware systeem</td></tr><tr><td>High speed pressure clamp</td><td>Scientific Instrument</td><td>HSPC-2-SB</td><td>Samenwerken met de drukpomp</td></tr><tr><td>High speed pressure clamp head stage&nbsp;</td><td>Scientific Instrument</td><td>HSPC-2-SB</td><td>Samenwerken met de drukpomp</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscopy&nbsp;</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>Olympus IX83</td><td>Micropipet aspiratie hardware systeem</td></tr><tr><td>Microfil&nbsp;</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>MF34G-5</td><td>34 G (67 mm lang) Verwijder luchtbel in de gesneden micropipet en test de opening van de pipettip&nbsp;</td></tr><tr><td>Micropipet Puller&nbsp;</td><td>Sutter instrument</td><td>P1000</td><td>Micropipet fabricage&nbsp;</td></tr><tr><td>Milli Q EQ 7000 Ultrazuiver Waterzuiveringssysteem</td><td>Merck Millipore</td><td>ZEQ7000T0C</td><td>Carbonaat/bicarbonaat buffer &amp; Tryode's buffervoorbereiding</td></tr><tr><td>Pipet microforge&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>Micropipet fabricage</td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>Tryode's&nbsp; buffervoorbereiding - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl en 5.5 mM D-glucose aangevuld met 1 mM CaCl2. Eind pH = 7.2</td></tr><tr><td>Pressue Pump&nbsp;</td><td>Scientific Instrument</td><td>PV-PUMP</td><td>Gecontroleerde druk induceren tijdens experiment</td></tr><tr><td>Prime 95B Camera&nbsp;</td><td>Photometrics</td><td>Prime 95B sCMOS</td><td>Fluorescente beeldvorming</td></tr><tr><td>Rotary wheel remote unit&nbsp;</td><td>Sensapex&nbsp;</td><td>uM-RM3</td><td>Controlepaneel voor micropipet positie aanpassing&nbsp;</td></tr><tr><td>Scepter 3.0 Handheld Cell Counter</td><td>Merck Millipore</td><td>PHCC340KIT</td><td>Automatische celteller</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>Carbonaat/bicarbonaat buffervoorbereiding - 2,65 g van NaHCO3 met 2,1 g van Na2CO3 in 250 mL van Mili Q water - Eind pH = 8-9.</td></tr><tr><td>Sodium Carbonate (Na2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td>Carbonaat/bicarbonaat buffervoorbereiding - 2,65 g van NaHCO3 met 2,1 g van Na2CO3 in 250 mL van Mili Q water - Eind pH = 8-9.</td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Tryode's&nbsp; buffervoorbereiding - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl en 5.5 mM D-glucose aangevuld met 1 mM CaCl2. Eind pH = 7.2</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydraat (NaH2PO4 &bull; H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>Tryode's&nbsp; buffervoorbereiding - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl en 5.5 mM D-glucose aangevuld met 1 mM CaCl2. Eind pH = 7.2</td></tr><tr><td>Touch screen control unit&nbsp;</td><td>Sensapex&nbsp;</td><td>uM-TSC</td><td>Controlepaneel voor micropipet positie aanpassing&nbsp;</td></tr><tr><td>X dry Objectief&nbsp;</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>Olympus 60x/0.70 LUCPlanFL</td><td>Micropipet aspiratie hardware systeem</td></tr></tbody></table>

fluorescentie-micropipetaspiratietest om mechanosensing van rode bloedcellen te onderzoeken

Fluorescence Micropipette Aspiration Assay to Investigate Red Blood Cell Mechanosensing

Aspiratietests met micropipetten zijn al lang een hoeksteen voor het onderzoek naar de mechanica van levende cellen en bieden inzicht in cellulaire reacties op mechanische stress. Dit artikel beschrijft een innovatieve aanpassing van de fluorescentie-gekoppelde micropipetaspiratie (fMPA)-test. De fMPA-test introduceert de mogelijkheid om nauwkeurige mechanische krachten toe te dienen en tegelijkertijd de mechanotransductieprocessen van levende cellen te bewaken die worden gemedieerd door ionkanalen. De geavanceerde opstelling omvat een nauwkeurig ontworpen micropipet van borosilicaatglas die is aangesloten op een fijn geregeld waterreservoir en een pneumatisch afzuigsysteem, waardoor gecontroleerde druktoepassing mogelijk is met stappen van ± 1 mmHg. Een belangrijke verbetering is de integratie van epifluorescentiebeeldvorming, waardoor de gelijktijdige observatie en kwantificering van celmorfologische veranderingen en intracellulaire calciumfluxen tijdens aspiratie mogelijk wordt. De fMPA-test zet door zijn synergetische combinatie van epifluorescentiebeeldvorming met micropipetaspiratie een nieuwe standaard voor de studie van celmechanosensing in mechanisch uitdagende omgevingen. Deze veelzijdige aanpak is aanpasbaar aan verschillende experimentele opstellingen en biedt kritische inzichten in de mechanosenserende mechanismen van één cel.

Om micropipetaspiratietesten op te zetten, hebben we eerst een op maat gemaakte celkamer gebouwd die bestaat uit twee metalen vierkanten (koper/aluminium) die met elkaar verbonden zijn door een handvat. Twee derde geslepen glazen dekglaasjes (40 mm × 7 mm × 0,17 mm) werden aangebracht om een kamer te creëren die gevuld was met 200 μL RBC's gesuspendeerd in Tyrode's Buffer. Na het inbrengen van RBC's in de kamer, werd een op maat gemaakte borosilicaatmicropipet op een houder bevestigd en zorgvuldig in de kamer geplaatst met behulp van een micromanipulator. Vervolgens werd de micropipet dichterbij gebracht om de doel-RBC te vangen.
Voor celaspiratie gebruikte de methode een pneumatische hogedrukklem met hoge snelheid om de negatieve aspiratiedruk nauwkeurig af te stellen. Vervolgens werd fluorescentiebeeldvorming uitgevoerd om de calciummobilisatie te onderzoeken bij de verschillende toegepaste negatieve aspiratiedrukken.
Door de fMPA te gebruiken om te onderzoeken hoe RBC's reageren op variërende negatieve aspiratiedrukken, laten onze bevindingen zien dat er een duidelijke evenredige relatie is tussen de uitgeoefende negatieve druk en de calciuminstroom die aanwezig is in de aangezogen RBC. Om de verandering van de calciumintensiteit te bepalen, werd de maximale intensiteit van de enkelvoudige aangezogen cel (Fmax) minus de achtergrondintensiteit (Fb) gedeeld door de rustintensiteit (F0) minus Fb. Er was een overeenkomstige toename van de instroom van calciumionen in de rode bloedcellen wanneer de druk stapsgewijs werd verhoogd tussen -10 mmHg (figuur 3A) en -40 mmHg (figuur 3D). Dit suggereert dat RBC's het vermogen bezitten om veranderingen in hun mechanische werking waar te nemen en te reageren door snelle calciumspecifieke kanaalactiviteiten14,15.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66265/66265fig03.jpg"> Figuur 3: Fluorescentiebeeldvorming met een grafische weergave van genormaliseerde intensiteitsveranderingen in de loop van de tijd. Horizontaal over toont fluorescentiebeelden van de rode bloedcellen in rust (links) en de menselijke rode bloedcellen die worden opgezogen door de micropipet (midden). Aan de rechterkant zijn representatieve sporen te zien van de RBC's die worden opgezogen bij meervoudige negatieve aspiratiedrukken (Δp). De negatieve aspiratiedruk wordt stapsgewijs verhoogd, beginnend bij (A) Δp = -10 mmHg, (B) Δp = -20 mmHg, (C) Δp = -30 mmHg en (D) Δp = -40 mmHg. Wanneer de tong van de rode bloedsteen tijdens de aspiratie langwerpig is, kan een significante calciummobilisatie worden waargenomen, zoals blijkt uit de verhoogde Cal-520 AM-vouwverandering. F/F0 werd gebruikt om de calciummobilisatie in de aangezogen RBC te onderzoeken. Uit de bovenstaande curven bleek uit de waargenomen trend dat het Cal-520 AM-signaal evenredig toenam met de toename van de toegepaste negatieve aspiratiedruk. Schaalbalk = 5 μm. Afkorting: RBC's = rode bloedcel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66265/66265fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullende tabel S1: Controlepunten voor kritieke stappen in de fMPA-voorbereidingsprotocollen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66265/66265_Supplementary%20File%20-%20Table%20S1%20-%20JoVE.xlsx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 1: Een begeleid proces om segmentatie aan te passen en uit te voeren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66265/66265_Supp%20File%201.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

De verkenning van cellulair gedrag onder mechanische stress is cruciaal voor vooruitgang in cellulaire mechanica en mechanobiologie. We introduceren de Fluorescence Micropipette Aspiration (fMPA)-techniek, een nieuwe methode die gecontroleerde mechanische stimulatie combineert met uitgebreide analyse van intracellulaire signalering in afzonderlijke cellen. Deze techniek onderzoekt nieuwe diepgaande studies van mechanobiologie van levende cellen.

Fluorescentie-micropipetaspiratietest om mechanosensing van rode bloedcellen te onderzoeken

Micropipette aspiration assays have long been a cornerstone for the investigation of live-cell mechanics, offering insights into cellular responses to ...

De reikwijdte van ons onderzoek is gericht op leefstijlmechanobiologie, in het bijzonder het gedrag van cellen waar mechanische belasting wordt toegepast. We onderzoeken de intracellulaire signalering in individuele cellen. Het voorgestelde FMPA-systeem maakt gebruik van fluorescentiebeeldvorming in combinatie met mechanische stimuli.Dat wil zeggen, de aspiratiedruk. Er zijn momenteel verdere ontwikkelingen die hebben geprobeerd om meer dan twee technieken te combineren met de microaspiratie-opstelling, zoals microfluïdica of beeldanalysesoftware. De huidige experimentele uitdagingen liggen in het feit dat de opstelling vrij arbeidsintensief is en afhankelijk is van de operator.Omdat het systeem handmatig wordt bediend, zijn er inconsistenties die in specifieke stappen ontstaan. Bijvoorbeeld het voorverwarmen van filamenten. De bevindingen van het onderzoek toonden aan dat er een overeenkomstige toename was in de instroom van calciumionen in de rode bloedcellen wanneer de druk stapsgewijs werd verhoogd tussen min 10 millimeter kwik tot min 40 millimeter kwik.Dit suggereert dat rode bloedcellen het vermogen hebben om veranderingen in hun mechanische omgeving waar te nemen en te reageren door snelle calciumgerelateerde kanaalactiviteiten. Deze studie legt bijzondere nadruk op de toepassing van FMPA als een cruciaal hulpmiddel voor het onthullen van de genuanceerde mechanosensitieve reacties die RBC's vertonen onder verschillende stimuli.

fluorescence-micropipette-aspiration-assay-to-investigate-red-blood

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een hechting frequentie test voor het meten van receptor-ligand interactie kinetiek wanneer beide moleculen zijn verankerd op het oppervlak van de interagerende cellen is beschreven. Deze mechanisch-gebaseerde test wordt geïllustreerd met behulp van een micropipet-druk menselijke rode bloedcel als adhesie sensor en integrine αLβ2 en intercellulaire adhesie molecuul-1 als interactie-receptoren en liganden.

Hechting Frequency Assay voor In Situ Kinetiek Analyse van de Cross-junctionele moleculaire interacties in de cel-cel-interface

Hier beschrijven we een snelle en eenvoudige methode om cellen stijfheid te meten. Het algemene principe van deze benadering is membraan vervorming te meten in reactie op welbepaalde negatieve druk aangebracht door een micropipet op het celoppervlak. Deze methode biedt een krachtig hulpmiddel om biomechanische eigenschappen van substraat-aangehechte cellen te bestuderen.

Micropipet Aspiratie van substraat-attached Cellen to Cell Stijfheid Schatting

In this video, biomembrane force probes (BFPs) are used to measure the forces between receptors and ligands. This technique can detect interactions by monitoring the pressure needed to break the bonds between the pMHC conjugated on the probe beads and the TCRs on the target cells.

Biomembrane Force Probe to Quantitate Receptor-Ligand Interactions

Het protocol beschreven gegevens een experimentele procedure om rode bloedcel (RBC) aggregaten kwantificeren onder gecontroleerde en constante afschuifsnelheid, gebaseerd op beeldverwerkingstechnieken. Het doel van dit protocol is het RBC totale afmetingen naar de desbetreffende afschuifsnelheid in een gecontroleerde omgeving microfluidic.

Gecontroleerde Microfluïdische Milieu voor Dynamic Onderzoek van Red Blood Cell Aggregation

We beschrijven een techniek voor het gelijktijdig meten van kracht-gereguleerde enkele receptor-ligand bindingskinetica en real-time beeldvorming van calciumsignalering in een enkele T-lymfocyt.

Fluorescentie biomembraan Force Probe: Concurrent kwantificering van Receptor-ligand Kinetics en-Binding geïnduceerde intracellulaire signalering op een enkele cel

Hier presenteren we een protocol voor het gelijktijdig gebruik van Förster resonance energie overdracht gebaseerde spanning sensoren voor het meten van eiwit belasting en fluorescentie herstel na photobleaching voor het meten van de dynamiek van de eiwitten waardoor de meting van kracht-gevoelige eiwit dynamiek binnen levende cellen.

Meting van de kracht-gevoelige eiwitten Dynamics in levende cellen met behulp van een combinatie van Fluorescent technieken

Mechanische krachten zijn belangrijk voor het beheersen van de Celmigratie. Dit protocol demonstreert het gebruik van elastische hydrogels die kunnen worden vervormd met behulp van een glazen micro pipet en een micro manipulator om cellen te stimuleren met een lokale stijfheids gradiënt om veranderingen in celstructuur en migratie teweeg te brengen.

Enkelvoudige cel Duro Taxis assay voor de beoordeling van de mechanische controle van cellulaire beweging en gerelateerde signalering van gebeurtenissen

Hier wordt een geïntegreerd protocol op basis van een optisch pincet en defocusmicroscopie beschreven om de reologische eigenschappen van cellen te meten. Dit protocol is breed toepasbaar bij het bestuderen van de visco-elastische eigenschappen van erytrocyten onder variabele fysio-pathologische omstandigheden.

Kwantitatieve analyse van visco-elastische eigenschappen van rode bloedcellen met behulp van een optisch pincet en onscherpe microscopie

Hier wordt een methode gepresenteerd om afzonderlijke cellen mechanisch te fenotyperen met behulp van een op elektronica gebaseerd microfluïdisch platform dat mechano-node-pore sensing (mechano-NPS) wordt genoemd. Dit platform handhaaft een gematigde doorvoer van 1-10 cellen / s terwijl het zowel de elastische als viskeuze biofysische eigenschappen van cellen meet.

Mechano-Node-Pore Sensing: een snel, labelvrij platform voor multi-parameter single-cell visco-elastische metingen

We ontwikkelden de Visual-Motor Reactie op het motorvermogen van larvale zebravis kwantificeren in reactie op licht stappen en verlaagt. We hebben ook onderzocht zebravis visie mutanten, waaronder de no optokinetische reactie (NRC) mutanten, waarvan gedacht werd dat volledig blind wanneer het wordt getest door een andere visie assay, de optokinetische reflex.

Een Behavioral Assay aan responsiviteit van zebravis Maatregel om veranderingen in lichtintensiteit

Leer de fluorescentie-micropipetaspiratietechniek om mechanosensing van rode bloedcellen te onderzoeken. Deze methode meet calciumionenflux bij toenemende aspiratiedruk en onthult mechanobiologische responsen.

Fluorescentie-micropipetaspiratietest om mechanosensing van rode bloedcellen te onderzoeken

Meer video's verkennen