Computationele voorspelling van aminozuurvoorkeuren van potentieel multispecifieke peptide-bindende domeinen die betrokken zijn bij eiwit-eiwitinteracties

We stellen een protocol voor voor de computationele voorspelling van aminozuurvoorkeuren in meer specifieke eiwit-eiwit interacties. Dit protocol kan worden beschouwd als een eerste stap in het ontwerpen van bemiddelaars van deze interacties. We zijn geïnteresseerd in het gebruik van deze mediatoren als potentiële remmers van specifieke interacties, in immunologisch technoloog.

Onze implementator die wordt gebruikt voor het karakteriseren van aminozuurvoorkeuren tussen de specifieke bindingsplaatsen is duur en omslachtig. Ons protocol is een bio-ondersteunde technologie gebaseerd op efficiëntie en seriebewerkingen. Deze strategie heeft het potentieel om een groot aantal lijnsequenties te verwerken, wat een volledig en consistent verschil in aminozuurvoorkeuren oplevert.

Ons protocol biedt een professionele kosteneffectieve door het verwerken van een groot aantal DNA-sequenties die de voorkeur hebben boven een completer van het doorgaans beperkte aantal sequenties, processen in weblab-benaderingen. Naast de ontwikkeling van remmers van immunologische producten, willen we de prestaties van deze methodologie vergelijken met andere productfamilies. Dit zal ons in staat stellen om de structurele basis voor multispecificiteit beter te begrijpen, niet alleen in immunologische context, maar ook in andere cellulaire functies, zoals signalering en communicatie.

Begin met het downloaden van de structuur van het eiwit-eiwitcomplex. Navigeer hiervoor naar de startpagina van de eiwitdatabank en voer de PDB-ID in het hoofdzoekvak in. Klik op de hoofdpagina voor de structuur op Bestanden downloaden en vervolgens op Biologische Assemblage 1 om de bestanden in PDB gz-formaat te downloaden.

Open de gedownloade structuur in UCSF Chimera. Navigeer naar Extra, vervolgens naar Structuur bewerken en klik op Keten-ID's wijzigen. Hernoem de tweede keten die aanvankelijk als A was gelabeld, naar B. Klik vervolgens op Favorieten, gevolgd door Model Panel.

Selecteer het model met de twee ketens en klik op de knop groeperen/degroeperen om elke keten in een ander model te scheiden. Selecteer vervolgens de twee modellen en klik op de knop kopiëren/combineren. Voer een nieuwe naam in voor het gecombineerde model.

Schakel Bronmodellen sluiten in en klik op OK. Klik op Selecteren, vervolgens op Keten en controleer of de ketens in het dimeer nu worden geïdentificeerd als A en B. Klik op Bestand en sla PDB op om de bewerkte structuur op te slaan als een nieuw PDB-bestand. Om het doelsegment in het ligandeiwit te identificeren, navigeert u naar de BUDE Alanine Scan-server. Klik op de knop Bestand kiezen onder Structuur Uploaden en upload het opgeslagen PDB-bestand.

Controleer op de volgende pagina of de structuur correct is geladen en voer een naam in voor de taak in de server. Stel ketens A in als een receptor en B als de ligand en klik op de knop Scan starten om de taak te verzenden. Zodra de taak is voltooid, klikt u op Resultaten weergeven om de pagina Resultaten te openen.

Selecteer in de lijst met residuen de reeks residuen waarvan is voorspeld dat deze een betere interactie heeft met het doelbindingsoppervlak. Met behulp van dit protocol en aminozuursegment werd interactie met het IRF5-bindingsoppervlak voorspeld. Met behulp van computationele alaninescanning mutagenese werd een segment van 13 aminozuren voorspeld van posities 424 tot 436, met het p L x IS-motief beginnend bij arginine 432.

Bereid om te beginnen de eiwitpeptide-interface voor op sequentiediversificatie. Open het PDB-bestand in Chimera en zorg ervoor dat de structuur van de doelsubeenheden intact is zonder ontbrekende atomen of bindingen. Om alle niet-essentiële moleculen uit de structuur te verwijderen, klikt u op Selecteren en vervolgens op Residuen en selecteert u vervolgens alle andere moleculen dan standaard aminozuren.

Klik vervolgens op Acties gevolgd door Adams/Bonds en verwijder. Klik vervolgens op Favorieten, in Volgorde, en klik vervolgens op de keten die als de ligand wordt beschouwd. Snijd de ligandketen bij tot het geïdentificeerde interagerende segment door alle residuen te verwijderen, behalve die tussen de geselecteerde posities.

Klik op Bestand en sla PDB op om de bewerkte structuur op te slaan in een ander PDB-bestand. Kopieer dit bestand naar een Linux-locatie die toegankelijk is voor de Rosetta-toepassingen. Gebruik de fixedbb-applicatie van Rosetta om alle aminozuurzijketens van de basisstructuur opnieuw in te pakken vóór de diversificatie van de sequentie, door deze opdracht uit te voeren.

Hernoem vervolgens het PDB-bestand opnieuw met een _ repack-achtervoegsel met behulp van de volgende opdracht. Voer vervolgens pepspec uit in de ontwerpmodus om sequentiediversificatie uit te voeren met behulp van deze opdracht. Genereer vervolgens een pwm met behulp van de gen pepspec pwm.

py-script opgenomen in de Rosetta-suite. Gebruik de volgende opdracht om dit script uit te voeren. Om een sequentielogo te maken, opent u het bestand met de peptidesequenties die in de vorige stap zijn gegenereerd met een voorkeursteksteditor en kopieert u alle sequenties.

Navigeer naar de WebLogo-server en plak de sequenties in het tekstvak Multiple Sequence Alignment. Kies het gewenste formaat en de grootte van het logo op basis van de invoerlengte en klik op Logo maken. Met behulp van dit protocol werden de aminozuurvoorkeuren voorspeld voor het geconserveerde p L x IS-motief in het IRF5-bindingsoppervlak.

Positie, gewichtsmatrix en sequentielogo gegenereerd bij sequentiediversificatie toonden een voorkeur voor glutamaat op positie 432 en voor leucine en isoleucine op posities 433 en 435. Posities 427, 429 en 436, meestal bezet door Serine, vertoonden een hogere voorkeur voor aspartaat en glutamaat, wat de rol van fosforylering en IRF5-dimerisatie benadrukte. Positie 425 toonde een hoge voorkeur voor serine, wat wijst op de betrokkenheid van serine bij de interactie tussen eiwitten en eiwitten in zijn niet-gefosforyleerde vorm.