Een workflow voor de kwantitatieve beoordeling van de endofytische en epifytische bacteriële microbiomen van de schors van Populus trichocarpa

[Presentator] Een workflow voor de kwantitatieve beoordeling van de endofytische en epithetische bacteriële microbiomen van de schors van Populus trichocarpa. Hier hebben we een gedetailleerde workflow ontworpen en getest om het microbioom te bestuderen dat de interne weefsels of de oppervlakken van de schors van Populus trichocarpa koloniseert. Deze workflow beschrijft in detail de bemonstering van de endofytische en epithetische microbiomen van de schors van Populus trichocarpa, de verwerking van verzamelde materialen, de extractie van genomisch DNA, de PCR-amplificatie van doelgebieden, de voorbereiding van DNA-bibliotheken en de sequentiebepaling van de endofytische en epithetische bacteriële microbiomen via sequencingtechnologie van de volgende generatie. We bieden ook een korte analytische procedure voor de verkregen sequentiegegevens. Deze bewezen workflow zal een effectieve aanpak bieden voor het empirisch onderzoeken van de endofytische en epithetische microbioomgemeenschappen van de schors van Populus trichocarpa en andere bosbouwsoorten. Kweek drie maanden oude Populus trichocarpa jonge boompjes in een groeikamer, snijd de 10 centimeter lange stengelsegmenten van Populus trichocarpa van twee tot 12 centimeter boven het gesteriliseerde grondoppervlak met behulp van een gesteriliseerde snoeischaar. Leg de stengelsegmenten in een gesteriliseerd vierkant petrischaaltje. Veeg de opperhuid van de stengel op de gesteriliseerde vierkante petrischaal herhaaldelijk af met steriel katoen met 0,1%. Tussen 20. Bewaar elk stuk katoen dat micro-organismen bevat, epithetische monsters in een steriele centrifugebuis van 1,5 milliliter bij min 80 graden Celsius. Snijd na het afvegen van het stengeloppervlak de schors open met een steriel scalpel, pel de schors eraf en plaats deze in een vierkante petrischaal. Snijd de schors die van de stengel is gestript in segmenten van ongeveer een centimeter met een steriel scalpel. Steriliseer de segmentoppervlakken door ze twee minuten in 70% alcohol te weken en week de segmenten vervolgens vijf minuten in natriumhypochloriet met 0,1%, Tween 80%. Steriliseer ten slotte de partjes gedurende 70 seconden in 30% alcohol. Was vervolgens alle monsters drie keer met steriel gedestilleerd water en plaats ze op een schone bank om aan de lucht te drogen. Bewaar elke gesteriliseerde stengelschors endofytische monsters in een steriele centrifugebuis van twee milliliter bij min 80 graden Celsius. Plaats de stengelschorssecties in steriele harde buizen van vijf milliliter en voeg drie gesteriliseerde stalen kralen toe aan elke buis. Vries de harde buizen met de monsters 10 minuten in vloeibare stikstof in. Plet de schorsmonsters gedurende vijf minuten met een kralenklopper. Vries de harde buis vervolgens opnieuw een minuut in vloeibare stikstof in en herhaal de druppelklopstap gedurende vijf minuten. Voeg de geplette stengelschors van Populus trichocarpa en de aan katoen gehechte epithetische bacteriegemeenschappen, elk 0,25 gram, toe aan elk van de kralenbuisjes en voeg vervolgens 60 microliter oplossing C1 toe, geleverd door een in de handel verkrijgbare kit en voorzichtig gemengd door inversie. Homogeniseer vervolgens de endofytische en epithetische monsters met behulp van een kralenklopper in vier runs van één minuut. Leg de monsters na elke run 30 seconden op ijs. Centrifugeer de buisjes gedurende één minuut bij 10.000 keer de zwaartekracht, extraheer de endofytische en epithetische monsters met behulp van een kit volgens de instructies van de fabrikant, voeg 30 microliter oplossing C6 toe aan het midden van het witte filtermembraan en incubeer gedurende vijf minuten bij 25 graden Celsius. Centrifugeer gedurende één minuut bij 10.000 keer de zwaartekracht bij kamertemperatuur. Meet de concentraties van het genomische DNA dat is geëxtraheerd uit epithetische en endofytische monsters met behulp van een microvolumespectrofotometer. Verdun elk DNA-monster met steriel ddH2O tot twee nanogram per microliter om de DNA-sjabloon voor PCR-amplificatie te verkrijgen. Amplificeer het V5- tot V7-gebied van het bacteriële 16S rRNA-gen met behulp van de voorwaartse primer 799F en de omgekeerde primer 1193R. Amplificeer ondertussen het V4-gebied van het bacteriële 16S rRNA-gen met behulp van de voorwaartse primer 5115F en de omgekeerde primer 806R. Meng elk monster grondig en centrifugeer om luchtbellen te verwijderen. Voer amplificatie uit van het V5 naar V7- of V4-gebied van de bacteriële 16S-rRNA-genen op een thermische cycler. Laad vijf microliter liter van elk monster Amplicon op een 1% Agarose-gel en voer elektroforese uit op 120 volt gedurende 30 minuten. Bekijk de gel onder UV-licht om succesvolle PCR-amplificatie te valideren. Meng voor elk monster drie replicaten van de PCR-amplificatieproducten in een PCR-buisje. Bepaal de concentratie van de versterkte producten met behulp van een in de handel verkrijgbare kit volgens de instructies van de fabrikant. Meet fluorescentie met behulp van een microplaatlezer. Zet een standaard DNA-curve uit en gebruik deze om de DNA-concentraties van de geamplificeerde producten te berekenen. Meng volgens hun gemeten concentratie de verkregen PCR-producten van de endofytische of epifytische monsters uit de schors van Populus trichocarpa in gelijke concentratie om de Amplicon-bibliotheek op te bouwen. Voer agarosegelelektroforese uit met behulp van elektroforese-apparatuur. Bereid kort een 1,3% Agarose gel, 1,3 gram Agarose poeder in 100 milliliter van één keer TAE buffer. Verwijder de kammen na het stollen van de gel en plaats de gel in een elektroforesetank met één keer TAE-buffer. Voeg vervolgens een volume-eenheid van zes keer oranje laadbuffer toe aan vijf volume-eenheden van elk PCR-product met 100 microliter van de ladder in elke put. Voeg 30 microliter van de DNA-ladder toe aan één putje. Voer na het aansluiten van de positieve en negatieve draden elektroforese uit op 80 volt gedurende 50 minuten. Snijd DNA-fragmenten uit de Agarose-gel met behulp van een schoon, scherp scalpel. Weeg de plakje gel af en doe deze in een kleurloze tube. Voeg buffer toe om de plak gel onder te dompelen. Voer gelextractie uit met behulp van de gelextractiekit volgens de instructies van de fabrikant. Bepaal de concentratie van de gezuiverde Amplicon-bibliotheek op een fluorimeter met behulp van een in de handel verkrijgbare kit volgens het protocol van de fabrikant voor sequentieprofilering. Lees standaard- en voorbeeldbuisjes met behulp van een fluorimeter en bevestig de kwaliteit van de bibliotheek door een enkele band te visualiseren. Analyseer en annoteer de 16S rRNA-gensequenties met behulp van de CHAM II. Maak taxonomische annotaties met behulp van de Silver Database op basis van referentiesequenties. Visualiseer deze resultaten met behulp van het ggplot2-pakket in R. Er werd hoogwaardig genomisch DNA van de endofytische en epithetische bacteriële microbiomen van de schors van Populus trichocarpa verkregen. De PCR-amplificatie van alle 12 monsters leverde enkele sterke banden op met de juiste grootte. De Amplicon-bibliotheek werd verder gebouwd met een enkele piek die voldeed aan de pre-sequencing-vereisten. Voor de endofytische microbiomen werden lezingen van hoge kwaliteit verkregen met behulp van respectievelijk de primerparen 799F/1193R en 515F/806R. Het primerpaar 799F/1193R leverde aanzienlijk minder versterkte plantlezingen op. Het aantal ASV's uit het epitthetische microbioom van de schors van Populus trichocarpa was significant hoger bij gebruik van de 799F/1193R in vergelijking met 515F/806R primers. De Shannon-index werd geschat op lager in de epifytische bacteriële gemeenschap van de schors dan in de endofytische bacteriële gemeenschap met behulp van het primerpaar 799F/1193R. Taxonomische kenmerken van bacteriële gemeenschappen in de endofytische en epifytische schorsdelen van Populus trichocarpa werden verder onderzocht met behulp van het primerpaar 799F/1193R. Er werd een betrouwbare en efficiënte workflow gebouwd van monsterafname tot gegevensanalyse om de samenstelling en diversiteit van de endofytische en epithetische bacteriële microbiomen van de schors van Populus trichocarpa te kwantificeren. Ons protocol kan dienen als een pad voor het bestuderen van het schorsmicrobioom van houtachtige plantensoorten, waardoor een beter begrip ontstaat van de kenmerken van bacteriële gemeenschappen die in andere houtachtige planten leven.