Name: Kwantificering van de voedselinname bij Caenorhabditis elegans door de bacteriële klaring te meten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Leer de bacteriële klaringassay om voedselinname bij Caenorhabditis elegans te kwantificeren. Deze methode onderzoekt het verband tussen voedingsgedrag en levensduur via metabole paden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Xiaolan Ye bedanken, aangezien dit protocol is ontwikkeld als gevolg van een observatie die ze oorspronkelijk maakte. Wij danken alle voormalige en huidige leden van het Petrascheck Lab voor hun hulp bij de ontwikkeling en optimalisatie van dit protocol. Dit werk werd gefinancierd door R21 AG080376 (aan M.P.). Sommige stammen werden geleverd door de CGC, die wordt gefinancierd door het NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66422/66422fig01.jpg"> Figuur 1: Schema van de bacterieklaringstest. Grafisch overzicht van de belangrijkste onderdelen van het protocol (van boven naar beneden): Voorbereiden van bacteriën, synchroniseren van de wormpopulatie, zaaien in platen met 96 putjes, steriliseren van wormen, medicijnen toevoegen, OD600 meten op dag 1 en dag 4. Een gedetailleerde beschrijving van deze specifieke stappen is links van elke afbeelding aangegeven. Afkortingen: OD = optische dichtheid; FUdR = fluorodeoxyuridine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66422/66422fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
1. Bereiding van bacteriën
OPMERKING: In dit gedeelte wordt de bereiding van de voedingsbacteriën beschreven die in deze test worden gebruikt. De specifieke E. coli-stam die in de test wordt gebruikt, wordt OP50 genoemd. OP50 is de meest gebruikte stam om C. elegans te voeden. De gebruikte OP50-stam is Carbenicilline/Ampicilline-resistent, wat kruisbesmetting van de wormcultuur met andere bacteriën voorkomt9.
<ol><li>Bereid de OP50 4-5 dagen van tevoren voor en bestraal een dag voor gebruik met röntgenstralen. Zorg ervoor dat alle materialen die in contact komen met OP50 steriel zijn29,30.</li>
	<li>Dag -8: Woensdag (week 1):<ol><li>Bereid het preinoculum voor door 5 ml LB te inoculeren met 100 μg/ml ampicilline en 0,1 μg/ml amfotericine B, en een enkele OP50-kolonie en gedurende ongeveer 6 uur bij 37 °C te incuberen in een bacterieshaker. Inoculeer vroeg om voldoende groei mogelijk te maken om de cultuur troebel te maken.</li>
		<li>Zodra de cultuur troebel is, verdunt u de pre-inoculumcultuur van OP50 met 1:2.000 in 250 ml TB met 100 μg/ml ampicilline. Incubeer de cultuur een nacht in een bacterieshaker gedurende 17-19 uur bij 37 °C. OPMERKING: De cultuur mag niet langer dan 19 uur groeien.</li>
	</ol></li>
	<li>Dag -7: Donderdag (week 1)<ol><li>Breng na de incubatie van 17-19 uur de OP50-vloeistofcultuur over in een steriele centrifugatiebuis en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 3.100 × g in een tafelcentrifuge bij 4 °C.</li>
		<li>Gooi het supernatant weg, resuspendeer de OP50-pellet met steriel water en centrifugeer opnieuw. Herhaal deze wasbeurt 2x.</li>
		<li>Gooi na de tweede wasbeurt het supernatant weg, resuspendeer de OP50-pellet in steriel water tot een volume van 50 ml en breng het over in een vooraf gewogen conische buis van 50 ml. Pelleteer de OP50 door centrifugatie gedurende 20 minuten bij 3.100 × g in een tafelcentrifuge bij 4 °C.</li>
		<li>Verwijder na de derde wasbeurt voorzichtig al het resterende supernatant en zorg ervoor dat er geen water in de buis achterblijft. Bereken het gewicht van de pellet door het gewicht van de lege centrifugatiebuis af te trekken van het gewicht van de centrifugatiebuis met de pellet. OPMERKING: Het gewicht van de pellets varieert doorgaans van 3-3,5 g.</li>
		<li>Resuspendeer de OP50-pellet grondig in de S-complete buffer tot een concentratie van 100 mg/ml, zorg ervoor dat er geen klonten aanwezig zijn.</li>
		<li>Zorg ervoor dat de concentratie van OP50 bij 100 mg/ml overeenkomt met 2 × 1010 bacteriën/ml. Als de relatie tussen de optische dichtheid en het aantal bacteriën per ml bekend is, bepaal dan de bacterieconcentratie per ml spectrofotometrisch. Gebruik indien nodig S-complete buffer om de concentratie van de OP50 voedingsoplossing aan te passen naar 2 × 1010 bacteriën/ml.</li>
		<li>Test de OP50 op een agarplaat om te bepalen of deze besmet is.</li>
		<li>Bewaar de OP50 gesuspendeerd in S-complete buffer bij 4 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>
<ol start="4"><li>Dag -3: Maandag (week 2)<ol><li>Dood de bacteriën via röntgenstraling om bacteriegroei tijdens de test te voorkomen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Synchrone voorbereiding van de wormcultuur
OPMERKING: In dit gedeelte wordt de voorbereiding van een synchrone wormpopulatie besproken. Alle materialen die in contact komen met de wormenpopulaties zijn steriel. Alle platen worden op 20 °C bewaard, tenzij anders vermeld.
<ol><li>Dag -6: Vrijdag (week 1), 16:00 uur<ol><li>Leg de dieren op een vers bord.<ol><li>Neem een NGM-plaat waarop het grootste deel van de wormenpopulatie bestaat uit uitgehongerde L1-larven. OPMERKING: Een gemengde populatie zal ook resultaten opleveren. Het gebruik van L1-wormen die lange tijd zijn uitgehongerd, kan het voedingsgedrag in de huidige of toekomstige generaties beïnvloeden, aangezien uithongering epigenetische sporen kan achterlaten voor ten minste drie generaties.</li>
			<li>Was de wormen af met niet meer dan 1 ml steriel water. Aliquot ~300 μL van de weggespoelde wormpopulatie op NGM-platen bezaaid met geconcentreerd OP50 (~300 mg/ml). Laat de borden drogen onder een platendroger of een bunsenbrander. Incubeer de platen bij 20°C totdat een groot deel van de populatie drachtige volwassenen bevat (maandag). OPMERKING: Dit tijdsbestek is geoptimaliseerd voor een wildtype N2-wormpopulatie en kan variëren van stam tot stam. Er moet rekening worden gehouden met wormen met een ontwikkelingsachterstand en deze moeten eerder worden geblokt en/of eerder worden gezaaid, zodat alle geteste stammen tegelijkertijd de volwassenheid bereiken.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Dag -3: Maandag (week 2) 10:00 uur<ol><li>Het opzetten van een synchrone populatie VOORZICHTIGHEID! Bleekmiddel is bijtend voor huid en ogen. Om het te hanteren, zijn handschoenen en een veiligheidsbril nodig.<ol><li>Verzamel wormen door ze van de plaat af te wassen met maximaal 10 ml steriel water. Breng deze worm/wateroplossing over in een conische buis van 15 ml.</li>
			<li>Was de wormen door de zwaartekracht zinken op de bank gedurende ongeveer 4 minuten (omgekeerd, wassen door centrifugeren gedurende 2 minuten in een tafelmodel centrifuge op 310 × g.</li>
			<li>Gooi het supernatans weg door middel van aspiratie met behulp van een kleine punt en voeg maximaal 15 ml steriel water toe. Herhaal 3x.</li>
			<li>Verwijder het supernatans en voeg 5 ml vers bereid bleekmiddel/NaOH-oplossing toe (1,8 ml huishoudelijk bleekmiddel, 0,5 ml 10 N NaOH, 7,7 ml dH2O).</li>
			<li>Incubeer 5 minuten op kamertemperatuur of tot de wormen openbreken. Draai elke minuut zachtjes gedurende ten minste 10 s. Bewaak de voortgang onder de ontleedmicroscoop. OPMERKING: De tijd die nodig is om de wormen open te breken, kan van stam tot stam verschillen. Als u de wormen te lang in de bleekoplossing laat staan, kunnen er niet-levensvatbare eieren ontstaan.</li>
			<li>Voeg M9-buffer toe om de reactie te neutraliseren zodra alle volwassenen openbreken of oplossen (het uiteindelijke volume moet 15 ml zijn) en centrifugeer gedurende 2 minuten op 1.300 × g.</li>
			<li>Was de eieren 3x met 13 ml M9 buffer.</li>
			<li>Was de eieren eenmaal met 10 ml S-complete buffer door 2 minuten te centrifugeren op 1.300 × g.</li>
			<li>Zuig het supernatant op, voeg 10 ml S-complete toe en breng de suspensie over in een verse conische buis van 15 ml. Draai de buis een nacht voorzichtig op kamertemperatuur op een nutator of iets dergelijks.</li>
			<li>Optioneel: Als er na de laatste centrifugatie in de S-complete buffer volwassen karkassen aanwezig zijn, filtreer de wormoplossing dan door een celzeef van 40 μm.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Dag -2: Dinsdag (week 2), 13:00 uur<ol><li>Zaaien van de dieren in borden<ol><li>Controleer met een ontleedscoop of de wormen zijn uitgekomen. Bepaal de concentratie van wormen in de S-complete buffer door de wormenpopulatie in druppels van 10 μl te tellen met behulp van een ontleedscoop; Tel 5-10 druppels voor elk monster. Als de concentratie wormen in elke druppel van 10 μl hoger is dan 30 wormen per druppel, verdun dan de totale voorraad met S-complete tot een lagere wormdichtheid per druppel om het tellen te vergemakkelijken.</li>
			<li>Zaai het vloeibare wormenmengsel in elk putje van een plaat met 96 putjes met een volume van 120 μl als volgt (eindconcentraties): 60 wormen/ml in S-compleet, 50 μg/ml carbenicilline, 0,1 μg/ml amfotericine en 6 mg/ml OP50 bereid in sectie 1. OPMERKING: Het totale te bereiden volume is afhankelijk van het aantal platen (~12 ml per plaat met 96 putjes). Er moeten 6-12 wormen in elk putje zitten. Als alternatief kan een flowcytometrie met grote deeltjes, zoals de COPAS FP van Union Biometrica, worden gebruikt om 10 wormen nauwkeurig in elk putje te sorteren (zie het gedeelte over verdringingseffect).</li>
			<li>Voeg ook een vloeibaar mengsel zonder wormen toe: 50 μg/ml carbenicilline, 0,1 μg/ml amfotericine en 6 mg/ml OP50 bereid in sectie 1.</li>
			<li>Doe 120 μL van het niet-wormenmengsel in rij H van de plaat met 96 putjes, die wordt gebruikt om de zelflysewaarden te bepalen, zoals eerder vermeld. Doe 120 μL per putje van het mengsel met wormen in rijen A-G. OPMERKING: Zorg ervoor dat de wormen tijdens het pipetteren in suspensie worden gehouden (zie afbeelding 2A, B). We gebruiken doorzichtige platen met 96 putjes en een vlakke bodem. Onze plaatlay-out verdeelt de plaat om 4 of 6 condities te produceren waarin elk paar kolommen een andere medicamenteuze behandeling of wormstam zal zijn, en de onderste rij zal dienen als een "geen worm"-controle (Figuur 2A, B).</li>
			<li>Om vervuiling en verdamping te voorkomen, sluit u de plaat af met een tapesealer. Incubeer de platen gedurende ongeveer 65 uur bij 20 °C tot de dieren L4-wormen worden.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Dag 0: Donderdag (week 2) voor de middag.<ol><li>Sterilisatie van de wormenpopulatie door toevoeging van Fluorodeoxyuridine (FUdR).<ol><li>Voeg 30 μl van een 0,6 mM FUdR-bouillonoplossing toe om de dieren in elk putje te steriliseren. Sluit de plaat opnieuw af met tapesealers en schud de platen gedurende 20 minuten op een microtiterplaatschudder op 800 tpm. Plaats de platen terug in de incubator van 20 °C. OPMERKING: In deze stap wordt de uiteindelijke OP50-concentratie verlaagd van 6 mg/ml naar 5 mg/ml (1 × 109 bacteriën/ml), en elk putje heeft een eindvolume van 150 μl. Het is van cruciaal belang om FUdR toe te voegen aan het L4-stadium voordat de dieren volwassen zijn.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Dag 1: Vrijdag (week 2)<ol><li>Voeg drugs toe aan de cultuur.<ol><li>Controleer tegen 9.00 uur of de meeste dieren drachtig zijn en dat elke put meerdere eieren bevat. Voeg indien nodig eventuele medicijnen toe in de gewenste concentratie (zie de bespreking).</li>
			<li>Na het toevoegen van het medicijn, verzegelt u de platen met tapesealer en schudt u de platen gedurende 20 minuten op 800 tpm op een plaatschudder. OPMERKING: Het schudden zorgt ervoor dat alle bacterieklonten worden opgelost zonder de sealer aan te raken. Zowel bacteriële klonten als vloeistof op de sealer zullen de OD600-waarde verstoren. Als er vloeistofdruppels op de sealer zitten, draai deze dan kort 10-20 s op 310 × g. Schud opnieuw 5 minuten op de shaker en meet.</li>
			<li>Verwijder na 20 minuten schudden op de microtiterplaatschudder het deksel en de afdichting en meet de OD600 in een plaatlezer; dit is de meting op dag 1 OD600 . Sluit de platen af en plaats ze terug in een incubator van 20 °C. NOTITIE: Omdat bacteriën zich snel nestelen, moet de meting binnen 10 minuten na het schudden van de platen plaatsvinden.</li>
			<li>Gebruik een omgekeerde microscoop om de populatie wormen te controleren op tekenen van besmetting of toxiciteit als er een medicijn is toegevoegd. Plaats de platen terug in de incubator van 20 °C.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Dag 4: Maandag (week 3)<ol><li>Neem de OD600-meting op dag 4.<ol><li>Herhaal de leesprocedure vanaf dag 1 (stap 2.5.1.3) om de OD600-waarde van dag 4 te krijgen. Schud de platen vóór de OD600-meting gedurende 20 minuten bij 800 tpm op de microtiterplaatschudder.</li>
			<li>Tel op een omgekeerde microscoop, met idealiter een 2x objectief, de populatie wormen in elk putje en noteer dit in een spreadsheet. Plaats de platen na het tellen terug in de incubator van 20 °C. OPMERKING: Bekijk een voorbeeld van ons scoreblad in aanvullend materiaal.</li>
			<li>Na de meting op dag 4 zijn de metingen van de voedselinname voltooid. Bewaar deze platen indien nodig voor levensduuranalyse. LET OP: Dit protocol is compatibel met Solis en Petrascheck31.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>
3. Analyse van gegevens over voedselinname
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66422/66422fig2_v1.jpg"> Figuur 2: Ontwerp en analyse. (A, B) Mogelijke plaatontwerpen voor 4 en 6 condities met de "geen worm" controleputten in rij H. Deze putjes zijn nodig om de zelflysesnelheid te bepalen. Neem op elke plaat altijd een onbehandelde controlepopulatie van N2 op als referentie. (C) Voorbeeldgegevens verzameld in de meegeleverde spreadsheet met het aantal wormen (groene doos), de twee OD600-metingen op dag 1 en 4 (oranje vakken), de zelflysewaarden (blauwe doos) en de evaluatie met behulp van formule (2) ((OD600 -zelflyse)/X0) in het rode vak. In het specifieke voorbeeld dat hier wordt getoond, wordt het plaatontwerp gebruikt dat wordt weergegeven in (B). Afkortingen: OD = optische dichtheid; X0 = aantal wormen per putje. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66422/66422fig2large_v1.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
OPMERKING: In dit gedeelte wordt beschreven hoe de voedselinnamegegevens uit sectie 2 van dit protocol worden geanalyseerd. De eerste waarden die moeten worden berekend, zijn de waarden van de zelflyseregeling . Bacteriën lyseren na verloop van tijd in vloeistof, zelfs als er geen wormen zijn. Deze zelflysewaarde kan ook worden beïnvloed door veel chemicaliën en moet worden gecontroleerd omdat deze relatief groot is in vergelijking met de voedselinname van een worm. Zoals beschreven in stap 2.3.1.4 en weergegeven in de plaatlay-out in figuur 2A, B, bevat rij H dezelfde oplossing, met uitzondering van de wormen. In onze plaatopstelling zoals weergegeven in figuur 2B, zijn er 14 putjes per conditie met twee respectievelijke zelflysecontroleputjes (rij H, "geen wormen").
<ol><li>Bereken de zelflysecontrolewaarden voor de controleputten zonder wormen in elke toestand met behulp van vergelijking ( 1). Zorg ervoor dat er voor elke duplicaatgroep putten ten minste twee niet-wormbestrijdingsputten zijn, zoals vermeld in stap 2.3.1.4. Gebruik het gemiddelde van alle controleputten zonder wormen voor de zelflysewaarde voor een gerepliceerde groep. Selfysis = gemiddeld(OD600 Dag 1 - OD600 Dag 4) (1) OPMERKING: Voor de plaatopstelling die in figuur 2B wordt getoond, berekenen we zes zelflysewaarden , één voor elk van de zes groepen, door het gemiddelde van de twee zelflysecontroleputjes in rij H te berekenen.</li>
	<li>Bereken de voedselinname per worm met behulp van een vergelijking <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66422/66422equation2v2.jpg">     (2). OPMERKING: Formule die in de spreadsheet wordt gebruikt (rood vak, Figuur 2C) waarbij X0 het aantal wormen per put is.</li>
	<li>Nadat voor elk putje de voedselinname per worm is bepaald, bereken je de gemiddelden en standaarddeviatie voor de gehele aandoening. OPMERKING: Voor de plaatopstelling zoals weergegeven in figuur 2B zijn 14 replicatieputjes per toestand voldoende voor statistische vergelijkingen.</li>
	<li>Normaliseer elke aandoening naar de respectievelijke onbehandelde controlepopulatie van N2. Geef de verandering in voeding aan als een vouwverandering of percentage van de N2-voeding. OPMERKING: Normalisatie wordt gedaan omdat de absolute waarden van OD600/X0 uit vergelijking (2) kunnen variëren tussen experimenten die op verschillende dagen worden uitgevoerd.</li>
</ol>

High-throughput assay om de voedselinname en levensduur van Caenorhabditis elegans te meten

<ol><li>Taormina, G., Mirisola, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorie+restriction+in+mammals+and+simple+model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Calorie restriction in mammals and simple model organisms.</a> Biomed Res Int. 2014, 308690(2014).</li>
<li>Cunningham, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amp-activated+kinase+links+serotonergic+signaling+to+glutamate+release+for+regulation+of+feeding+behavior+in+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.+Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Amp-activated kinase links serotonergic signaling to glutamate release for regulation of feeding behavior in C.</a> elegans. Cell Metab. 16 (1), 113-121 (2012).</li>
<li>You, Y. J., Kim, J., Raizen, D. M., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin%2C+cgmp%2C+and+tgf-beta+signals+regulate+food+intake+and+quiescence+in+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans%3A+A+model+for+satiety.+Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Insulin, cgmp, and tgf-beta signals regulate food intake and quiescence in C.</a> elegans: A model for satiety. Cell Metab. 7 (3), 249-257 (2008).</li>
<li>Dorman, J. B., Albinder, B., Shroyer, T., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+age-1+and+daf-2+genes+function+in+a+common+pathway+to+control+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The age-1 and daf-2 genes function in a common pathway to control the lifespan of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 141 (4), 1399-1406 (1995).</li>
<li>Apfeld, J., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+nonautonomy+of+C.+elegans+daf-2+function+in+the+regulation+of+diapause+and+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell nonautonomy of C. elegans daf-2 function in the regulation of diapause and life span.</a> Cell. 95 (2), 199-210 (1998).</li>
<li>Srinivasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroendocrine+control+of+lipid+metabolism%3A+Lessons+from+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.+J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Neuroendocrine control of lipid metabolism: Lessons from C.</a> elegans. J Neurogenet. 34 (3-4), 482-488 (2020).</li>
<li>Calculli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+regulation+of+mitochondria+by+germline+proteostasis+prevents+protein+aggregation+in+the+soma+of%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.+Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Systemic regulation of mitochondria by germline proteostasis prevents protein aggregation in the soma of.</a> elegans. Sci Adv. 7 (26), eabg3012(2021).</li>
<li>Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+feeding+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of feeding in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 133 (4), 897-917 (1993).</li>
<li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+restriction+extends+lifespan+through+metabolic+regulation+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Dietary restriction extends lifespan through metabolic regulation of innate immunity.</a> Cell Metab. 29 (5), 1192-1205.e8 (2019).</li>
<li>Chen, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+convergence+reveals+a+lipid+pathway+that+regulates+C.+elegans+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological convergence reveals a lipid pathway that regulates C. elegans lifespan.</a> Nat Chem Biol. 15 (5), 453-462 (2019).</li>
<li>Gomez-Amaro, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+food+intake+and+nutrient+absorption+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Measuring food intake and nutrient absorption in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 443-454 (2015).</li>
<li>Mckay, J. P., Raizen, D. M., Gottschalk, A., Schafer, W. R., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eat-2+and+eat-18+are+required+for+nicotinic+neurotransmission+in+the+Caenorhabditis+elegans+pharynx%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Eat-2 and eat-18 are required for nicotinic neurotransmission in the Caenorhabditis elegans pharynx.</a> Genetics. 166 (1), 161-169 (2004).</li>
<li>Hobson, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ser-7%2C+a+Caenorhabditis+elegans+5-ht7-like+receptor%2C+is+essential+for+the+5-ht+stimulation+of+pharyngeal+pumping+and+egg+laying%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Ser-7, a Caenorhabditis elegans 5-ht7-like receptor, is essential for the 5-ht stimulation of pharyngeal pumping and egg laying.</a> Genetics. 172 (1), 159-169 (2006).</li>
<li>Deshpande, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Drosophila+food+intake%3A+Comparative+analysis+of+current+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying Drosophila food intake: Comparative analysis of current methodology.</a> Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).</li>
<li>Webster, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+rnai+screen+for+fat+regulatory+genes+in+C.+elegans+identifies+a+proteostasis-ampk+axis+critical+for+starvation+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Genome-wide rnai screen for fat regulatory genes in C. elegans identifies a proteostasis-ampk axis critical for starvation survival.</a> Cell Rep. 20 (3), 627-640 (2017).</li>
<li>Reis Rodrigues, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+ligands+of+cannabinoid+receptors+affect+dauer+formation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Synthetic ligands of cannabinoid receptors affect dauer formation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> G3 (Bethesda). 6 (6), 1695-1705 (2016).</li>
<li>Levichev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conserved+endocannabinoid+anandamide+modulates+olfactory+sensitivity+to+induce+hedonic+feeding+in+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.+Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The conserved endocannabinoid anandamide modulates olfactory sensitivity to induce hedonic feeding in C.</a> elegans. Curr Biol. 33 (9), 1625-1639.e4 (2023).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+behavioral+screen+identifies+an+orphan+anti-opioid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic behavioral screen identifies an orphan anti-opioid system.</a> Science. 365 (6459), 1267-1273 (2019).</li>
<li>Cheong, M. C., Artyukhin, A. B., You, Y. J., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+opioid-like+system+regulating+feeding+behavior+in+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.+Elife%22%5BJournal%5D)">An opioid-like system regulating feeding behavior in C.</a> elegans. Elife. 4, e06683(2015).</li>
<li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+caloric+restriction+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (22), 13091-13096 (1998).</li>
<li>Huang, C., Xiong, C., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+age-related+changes+of+physiological+processes+that+predict+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Measurements of age-related changes of physiological processes that predict lifespan of Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (21), 8084-8089 (2004).</li>
<li>Witham, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+body+cavity+neurons+are+homeostatic+sensors+that+integrate+fluctuations+in+oxygen+availability+and+internal+nutrient+reserves%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">C. elegans body cavity neurons are homeostatic sensors that integrate fluctuations in oxygen availability and internal nutrient reserves.</a> Cell Rep. 14 (7), 1641-1654 (2016).</li>
<li>Hussey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-sensing+neurons+reciprocally+regulate+peripheral+lipid+metabolism+via+neuropeptide+signaling+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Oxygen-sensing neurons reciprocally regulate peripheral lipid metabolism via neuropeptide signaling in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genet. 14 (3), e1007305(2018).</li>
<li>Zapata, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocytes+control+food+intake+and+weight+regain+via+vacuolar-type+h%28%2B%29+atpase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Adipocytes control food intake and weight regain via vacuolar-type h(+) atpase.</a> Nat Commun. 13 (1), 5092(2022).</li>
<li>Clay, K. J., Yang, Y., Clark, C., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteostasis+is+differentially+modulated+by+inhibition+of+translation+initiation+or+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Proteostasis is differentially modulated by inhibition of translation initiation or elongation.</a> Elife. 12, e76465(2023).</li>
<li>Perez-Gomez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phenotypic+caenorhabditis+elegans+screen+identifies+a+selective+suppressor+of+antipsychotic-induced+hyperphagia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A phenotypic caenorhabditis elegans screen identifies a selective suppressor of antipsychotic-induced hyperphagia.</a> Nat Commun. 9 (1), 5272(2018).</li>
<li>Zapata, R. C., Zhang, D., Chaudry, B., Osborn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-administration+of+drugs+in+mouse+models+of+feeding+and+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Self-administration of drugs in mouse models of feeding and obesity.</a> J Vis Exp. (172), 62775(2021).</li>
<li>Zapata, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+clic1+for+the+treatment+of+obesity%3A+A+novel+therapeutic+strategy+to+reduce+food+intake+and+body+weight%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Metab%22%5BJournal%5D)">Targeting clic1 for the treatment of obesity: A novel therapeutic strategy to reduce food intake and body weight.</a> Mol Metab. 76, 101794(2023).</li>
<li>Stuhr, N. L., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+diets+differentially+alter+lifespan+and+healthspan+trajectories+in+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.+Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial diets differentially alter lifespan and healthspan trajectories in C.</a> elegans. Commun Biol. 3 (1), 653(2020).</li>
<li>Stuhr, N. L., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+methods+of+killing+bacteria+diets+differentially+influence+Caenorhabditis+elegans+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22MicroPubl+Biol%22%5BJournal%5D)">Different methods of killing bacteria diets differentially influence Caenorhabditis elegans physiology.</a> MicroPubl Biol. 2023, (2023).</li>
<li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Wofford, M. R., King, D. S., Harrell, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Hypertens+%28Greenwich%29%22%5BJournal%5D)">Drug-induced metabolic syndrome.</a> J Clin Hypertens (Greenwich). 8 (2), 114-119 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Het gepresenteerde protocol meet de bacteriële klaring als een uitlezing voor de voedselinname van C. elegans in microtiterplaten met 96 putjes. De dosis-responscurves in de sectie representatieve resultaten laten zien dat de test de voedselinname kwantitatief meet, een idee dat onafhankelijk werd bevestigd met behulp van isotoop-gelabelde bacteriën11. Met behulp van deze test hebben we met succes door de FDA goedgekeurde geneesmiddelen getest, zoals antipsychotica, met bekende menselijke metabole bijwerkingen en toonden we aan dat deze geneesmiddelen de voeding in C. elegansverhoogden 10,26. De test is nuttig om de genetica of farmacologie van voeding te bestuderen en voegt een nieuw hulpmiddel toe voor C. elegans-onderzoek om het metabolisme te bestuderen. Deze test biedt een goedkope methode om voeding op een schaalbare en tijdvriendelijke manier te bestuderen, wat in de meeste andere organismen niet mogelijk is. Ons werk aan door de FDA goedgekeurde geneesmiddelen toont aan dat veel bijwerkingen die bij menselijke patiënten worden gezien, ook worden waargenomen bij C. elegans, wat evolutionair behoud onthult 24,26,32.
De test wordt beperkt door de concentratie bacteriën die binnen het lineaire bereik van de OD600-meting kan worden gemeten. Als gevolg hiervan is het aantal wormen en het bereik van bacterieconcentraties dat kan worden getest beperkt. Te veel wormen zullen OD600 beïnvloeden door de bacteriën te snel te consumeren, waardoor de bacterieconcentratie uit de lineaire OD600 wordt "gegeten". In onze ervaring is variabiliteit in bacteriële bereiding de kritische parameter die ervoor zorgt dat de resultaten variëren van het ene experiment tot het andere. We hebben tevergeefs geprobeerd om grote partijen bacteriën in te vriezen of om gevriesdroogde bacteriën te gebruiken. In deze gevallen werd het zelflysepercentage te hoog, of waren de bacteriën van een kwaliteit die de ontwikkeling van C. elegans vertraagde. Onze tests zijn echter niet uitputtend geweest en dit probleem kan mogelijk worden opgelost.
Over het algemeen is de zelflysesnelheid van de bacteriën het meest uitdagend om te beheersen en kan het aanzienlijke variabiliteit veroorzaken. We ontdekten dat sommige medicijnen de zelflysesnelheid kunnen verhogen tot niveaus die de test niet betrouwbaar kon bepalen voedselinname. Omdat de zelflysesnelheid in de loop van de tijd toeneemt in de test, hebben we de voedselinname niet gemeten na dag 5 van de volwassenheid. Tegen die leeftijd zijn de bacteriën ~10 dagen in cultuur. Om de voedselinname na dag 5 van de volwassenheid te meten, moeten de oude bacteriën worden afgewassen en vervangen door nieuwe.
De gepresenteerde test is een uitbreiding van onze op 96-well microtiterplaten gebaseerde levensduurtest31. Deze combinatie maakt het mogelijk om de levensduur en voedselinname in dezelfde populatie te meten. Hoewel de hier gepresenteerde bacteriële klaringstest het niet mogelijk maakt om de voedselinname gedurende het hele leven van C. elegans te bepalen als gevolg van bacteriële zelflyse, levert het solide gegevens op voor de eerste vier dagen van de volwassenheid, de tijd met de hoogste voedselinname. Vooral voor de ontdekking van geneesmiddelen met kleine moleculen is controle op voedselinname essentieel. Samenvattend verwachten we dat de gepresenteerde test nuttig zal zijn voor de C. elegans-gemeenschap en de toolset zal uitbreiden om het metabolisme te bestuderen of te beheersen in de context van verouderings- en levensduurstudies.
Planning: 
Voordat u van plan bent de voedselinname te meten, moeten u een paar overwegingen maken.
Het doden van de bacteriën:
We doden bacteriën door bestraling met röntgenstralen in een conische buis van 50 ml (900 grijs gedurende 4 uur ingesteld op 160,0 kV en 25,0 mA). Voor de bestraling gebruiken we de RS2000 van Rad Source. Afhankelijk van de apparatuur kunnen de specifieke tijd en stralingsdosis variëren van faciliteit tot faciliteit. De volledige doding van de bacteriën moet worden bepaald door de bacteriën na bestraling te plateren om overlevenden door groei te detecteren. Het is essentieel om alle bacteriën te doden om groei tijdens de test te voorkomen, omdat dit een onderschatting van de voeding of zelfs negatieve voedingswaarden zal veroorzaken. Belangrijk is dat de bacteriën worden gedood, zodat C. elegans ze nog steeds zal eten. In onze ervaring zijn er drie manieren om grote hoeveelheden bacteriën betrouwbaar te doden: (i) bestraling door röntgenstralen, (ii) door γ-stralen en (iii) de toevoeging van formaldehyde29,30. De zelflysepercentages tussen deze drie methoden zijn vergelijkbaar, met een variatiecoëfficiënt van 8% tussen de zelflysepercentages voor de experimenten weergegeven in figuur 3B. Methoden die in onze handen niet betrouwbaar werkten, waren UV-bestraling, antibioticacocktails, warmte-inactivatie en natriumazide. Deze methoden slagen er niet in om de bacteriën volledig te doden (UV en antibiotica), produceren bacteriën die C. elegans niet eet (hitte) of veranderen de voedselinname (natriumazide).
Aantal replicaten: 
Onze ervaring is dat de vouwveranderingen in de voeding over het algemeen klein zijn in vergelijking met de waargenomen variatie. Het meten van veranderingen in voedselinname vereist dus meerdere replicatieputjes. Figuur 2A,B toont platen met 96 putjes die zijn ontworpen voor vier of zes verschillende omstandigheden, met 21 of 14 replicatieputjes en twee zelflysecontroleputjes zonder wormen. Gezien de grote variabiliteit en de relatief kleine veranderingen die te verwachten zijn, zijn 0,5-2,5 voudige veranderingen in de voeding meestal de onder- en bovengrenzen. We raden 14 tot 21 replicatieputten aan voor elke aandoening en ten minste twee zelflysecontroleputten, die hierna worden beschreven. Deze replicaten zijn voldoende om kwantitatieve dosis-responscurves te genereren voor geneesmiddelen die de voeding veranderen11,26.
Controle van de zelflyse: 
OD600 meet het aantal deeltjes in een oplossing, meestal onafhankelijk van de deeltjesgrootte. Dode bacteriën zullen echter lyseren en hun deeltjesaard verliezen. We noemen dit zelflyse, die onafhankelijk gebeurt in de aanwezigheid van wormen en de OD600-metingen verlaagt zonder dat de wormen eten. Zelflyse vindt plaats tijdens de test en moet onafhankelijk worden gemeten in ten minste twee putjes per aandoening. Deze putten krijgen dezelfde behandeling als de andere binnen dezelfde toestand, behalve dat ze geen wormen bevatten. We ontdekten dat veel medicijnen ook de zelflysesnelheid kunnen veranderen. Elke aandoening heeft dus onafhankelijke zelflyse-controleputten nodig met hun respectievelijke concentratie. Figuur 2 toont een plaatopstelling voor vier of zes condities met alle zelflyse-controleputjes aan de onderkant van de plaat in rij H.
N2 referentiepopulatie: 
We merkten ook op dat de absolute hoeveelheid geconsumeerde bacteriën kan fluctueren tussen experimenten, hoogstwaarschijnlijk gerelateerd aan de kwaliteit van de bacteriën. Ondanks onze inspanningen om ze elke keer op precies dezelfde manier te bereiden, zijn er fluctuaties. Bacteriën kunnen bijvoorbeeld worden geoogst terwijl ze zich in een delende toestand bevinden tijdens de logaritmische groeifase en daarom veel groter zijn dan bacteriën die in de stationaire fase worden geoogst. Vandaar dat deze eenvoudige verschillen in bacteriegrootte kunnen leiden tot veranderingen in het aantal geconsumeerde bacteriën en verschillende OD600-waarden , aangezien de OD600-metingen geen onderscheid maken tussen groottes. Om deze reden nemen we altijd één populatie onbehandelde N2-controledieren op die als referentiewaarde dienen, ingesteld op 1 of 100%, om te bepalen of de experimentele groepen meer of minder eten dan de N2-controlegroep. Deze praktijk maakt vergelijkingen tussen experimenten mogelijk, zelfs als de OD600-waarden variëren.
Tijdsintervallen: 
Het gebruik van OD600-waarden om de voedselinname te meten, vereist dat de bacterieconcentratie meetbaar afneemt. Omdat het kweekvolume veel groter is dan dat van de wormen, moeten ze een aanzienlijke hoeveelheid bacteriën eten om een detecteerbaar verschil te maken. Om binnen het lineaire bereik voor OD600-waarden te blijven, moet de bacterieconcentratie tussen ~1 mg/ml en 10 mg/ml blijven, zodat een aanzienlijke hoeveelheid bacteriën moet verdwijnen om deze te detecteren. Wormen eten het meest van laat L4 tot dag 4 van de volwassenheid vanwege de eierproductie. Dit interval is dus ideaal. Kortere intervallen zoals 24 uur kunnen11 worden gemeten, maar dat is aanzienlijk moeilijker en vereist ~40 putjes per toestand. Een andere optie om de voedselopname van larven te meten, is door het aantal dieren per put te verdubbelen. Het probleem met deze aanpak is echter dat te veel wormen de OD600-metingen zullen gaan beïnvloeden wanneer ze opgroeien.
Voorraadoplossingen voor te testen medicijnen: 
Als geneesmiddelen zoals serotonine worden getest op hun vermogen om voeding te moduleren, houd dan rekening met het volgende bij het bereiden van voorraadoplossingen. We bereiden over het algemeen een 50x voorraad voor wateroplosbare medicijnen en voegen 3 μL toe aan elk putje (1:50), maar andere voorraadconcentraties (100x, 300x) werken ook. Als de geneesmiddelen echter worden verdund in andere oplosmiddelen dan water (bijv. DMSO), mag de uiteindelijke concentratie niet hoger zijn dan 0,5%. Oplosmiddelen worden snel schadelijk voor C. elegans. Voorraadoplossingen van geneesmiddelen opgelost in organische oplosmiddelen zoals DMSO moeten dus 300x of hoger zijn.
Scoren van levende en dode wormen: 
De bepaling van levende en dode dieren is gebaseerd op de beweging van de worm. Sterk licht, vooral blauw licht, wordt gebruikt omdat het ervoor zorgt dat de dieren in beweging komen. Bovendien zal het scoren van het aantal dieren per put onthullen of er overtollige sterfgevallen zijn. Overmatige sterfgevallen kunnen optreden bij giftige stoffen of hoge concentraties (>0,5%) van verschillende oplosmiddelen, waaronder DMSO. Over het algemeen moeten er minder dan 1:100 (1%) dode dieren zijn. Borden kunnen 30 s bij 800 tpm worden geschud op de microtiterplaatschudder als het voedsel is bezonken en de populatie moeilijk te tellen wordt. Negeer putjes met mannetjes of meer dan 16 wormen (zie problemen).
Mogelijke problemen:
Onvoldoende schudden: 
In een vloeibaar medium kunnen bacteriën gemakkelijk samenklonteren en zich op de bodem van de putjes nestelen. Onze ervaring is dat minder dan 20 minuten schudden er niet in kan slagen om bacterieklonten af te breken en opnieuw te suspenderen, waardoor onnauwkeurige OD600-metingen ontstaan. OD600 metingen in aanwezigheid van bacterieklonten zullen de bacterieconcentratie onderschatten. Te hoge instellingen van de shaker kunnen ertoe leiden dat de vloeistof aan de sealer blijft plakken. Zodra de sealer is verwijderd voor de OD600-meting , zal de vloeistof die aan de sealer kleeft resulteren in een lagere OD600-meting . Als er vloeistof op de sealer zit, draai de plaat dan snel op een lage snelheid (500-1.000 tpm) en schud opnieuw gedurende 5 minuten. Zorg er verder voor, zoals vermeld voor de metingen op dag 1 en dag 4, dat u binnen 10 minuten na het schudden van de platen leest om te voorkomen dat de bacteriën zich nestelen.
Verschillende absolute voedselinnamewaarden tussen experimenten: 
Ondanks onze inspanningen om de bacteriële preparaten te standaardiseren, verschillen ze vaak op manieren die de voedselinname bij wormen beïnvloeden. Vanwege hun delende toestand verschillen bacteriën bijvoorbeeld in grootte op basis van of ze zijn geoogst in de logaritmische groei- of stationaire fase, waarbij de logaritmische bacteriën groter zijn. Omdat OD600-metingen geen onderscheid maken tussen maten, kunnen de verschillen in bacteriegrootte als gevolg van de fase waarin de bacteriën zijn geoogst, leiden tot de schijnbare verschillen die zijn waargenomen in de basale voedselinname tussen bacteriepreparaten. De beste manier om experimenten te vergelijken, is door altijd een onbehandelde N2-controlepopulatie op te nemen en de resultaten te normaliseren naar deze N2-populatie.
Effecten van drukte: 
De bacterieconcentratie in dit protocol is voldoende om de OD600 gedurende ~72 uur in het lineaire bereik te houden voor 2-16 wormen per putje. Afhankelijk van het betreffende medicijn kan een putje met meer dan 16 wormen de bacterieconcentratie vóór de tweede meting uitputten. We ontdekten ook dat putten met één dier vaak onbetrouwbaar zijn. De lysisfactor weegt zwaarder dan wat een enkele worm eet. Vandaar dat kleine fouten bij het bepalen van de lysisfactor een onevenredige invloed hebben op putten met minder wormen.
We raden aan om putten uit te sluiten van statistische analyses als aan een van de onderstaande voorwaarden is voldaan. Er zijn mannetjes in de put (we hebben geen gegevens waarin de voedselinname tussen mannetjes en hermafrodieten wordt vergeleken); er zijn minder dan 2 wormen in de put of meer dan 16 wormen in de put; Wormen zijn dood bij de tweede lezing; of als er nakomelingen in de putten zitten omdat de FUdR is mislukt. FUdR is warmtegevoelig en wordt zelfs bij temperaturen tot 37 °C geïnactiveerd. Ontdooi FUdR altijd in water op kamertemperatuur.
Negatieve voedselinnamewaarden:
De voedselinnamewaarden zijn af en toe negatief, wat suggereert dat er op dag 4 meer voedsel is dan op dag 1. Negatieve voedselinnamewaarden kunnen duiden op een van de volgende factoren: een hoge zelflysesnelheid , mogelijk veroorzaakt door een toegevoegd medicijn dat inwerkt op de bacteriën, of negatieve voedselinnamewaarden, die kunnen suggereren dat de put besmet is en er iets anders dan wormen groeit. De zelflysepercentages nemen ook toe naarmate de bacteriën ouder worden; Daarom raden we aan om bacteriën te gebruiken die niet langer zijn dan een week oud. Er is een medicijn toegevoegd dat in de loop van de tijd neerslaat, waardoor de OD600-waarde wordt beïnvloed. Onvoldoende schudden op dag 1 kan leiden tot een lagere OD600-waarde als gevolg van bacterieklonten. De wormen ondergingen hypoxische stress. Dit gebeurt wanneer de verhouding tussen oppervlak en lucht niet voldoende is om zuurstofuitwisseling mogelijk te maken. Gebruik de specifieke plaat met 96 putjes in materialen en overschrijd niet 150 μL (120 μL + 30 μL FUdR) per putje. De afstand tussen het oppervlak van de put en de bodem waar de wormen leven, bepaalt de zuurstofconcentratie.
Beperkingen:
Deze test is beperkt tot vloeibare cultuur. Voedingsgedrag dat wordt waargenomen in vaste platen, zoals het op- en afrijden van voedselgazons, kan niet worden beoordeeld met de test.

Caenorhabditis elegans is op grote schaal gebruikt in verouderingsonderzoek.  Het is een krachtig model geweest om de genetica te bestuderen die ten grondslag ligt aan een door metabolisme gemedieerde levensduur die wordt veroorzaakt door dieetbeperking, verminderde mitochondriale activiteit of verminderde insulinesignalering. 1,2,3,4,5,6,7. Het meten van voeding in de context van een lang leven is echter moeilijk gebleken voor C. elegans vanwege de kleine omvang van het dier 3,8,9,10,11,12,13,14,15.
Voeding is een fundamenteel biologisch gedrag dat nodig is om te overleven, en de strikte regulering ervan vormt de kern van het behoud van metabole gezondheid, voortplanting en veroudering. Voedingsgedrag wordt gecontroleerd door meerdere signaalroutes in zowel het zenuwstelsel als de periferie en kan dus alleen in vivo worden bestudeerd 16,17,18,19. Voeding vertegenwoordigt de eerste van drie pijlers: (i) energie-inname, (ii) energieopslag en (iii) energieverbruik dat de energiehomeostase van een organisme regelt. De voeding van C. elegans is voornamelijk onderzocht door het meten van de keelholtepomp, zoals gedefinieerd door de snelheid van samentrekkingen van de keelholte. Deze aanpak heeft cruciale inzichten opgeleverd in het voedingsgedrag van C. elegans: 3,4,8,12,13,20,21; Faryngeaal pompen, vooral gemeten over korte intervallen van minuten, is echter niet noodzakelijkerwijs gecorreleerd met voedselinname.
De voedselopname wordt niet alleen bepaald door de pompsnelheid van de keelholte, maar ook door parameters zoals de duur en frequentie van de voedingsperioden en de dichtheid van voedselbacteriën. Een dier kan een zeer hoge faryngeale pomping hebben, maar de lengte van zijn voedingsperioden kan korter zijn, wat de verhoogde snelheid compenseert. Een andere verstorende factor is de efficiëntie waarmee bacteriën al dan niet worden opgenomen en vermalen. Een extreem voorbeeld van het loskoppelen van voedselinname van faryngeaal pompen is de toevoeging van serotonine zonder dat er voedsel(bacteriën) aanwezig zijn. In aanwezigheid van exogene serotonine pompen dieren met een hoge snelheid, maar zonder aanwezigheid van bacteriën leidt de hoge pompsnelheid niet tot voedselinname 2,6,13,22,23.
De hier gepresenteerde bacteriële klaringsmethode meet de voedselopname van wormpopulaties in individuele putten als de afname van bacterieconcentraties in de loop van de tijd (Figuur 1). Deze benadering is vergelijkbaar met die welke wordt gebruikt bij andere soorten waar het verdwijnen van voedsel een maat is voor de voedselinname 10,11,24,25,26,27,28. In de oorspronkelijke publicatie hebben we deze methode voor het meten van voedselinname gevalideerd door C. elegans te voeden met 15N-isotoop-gelabelde bacteriën11. Latere metingen door middel van massaspectrometrie toonden aan dat het meten van het verdwijnen van bacteriën sterk correleerde met het optreden van isotopenlabeling, waardoor de daadwerkelijke opname van de bacteriën in het dier werd onthuld11. We zijn er dus van overtuigd dat de bacteriële klaringstest in de meeste omstandigheden de voedselinname vertegenwoordigt. Het doel van de test is niet om de faryngeale pomptest te vervangen, maar om toe te voegen aan de gereedschapskist van assays om voeding en metabolisme in C. elegans te bestuderen en hoe dit zich verhoudt tot veroudering en een lang leven.

<table><tbody><tr><td>Amphotericin B</td><td>RPI</td><td>A40030-0.1</td><td>solvent: EtOH</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP176025</td><td>solvent: water</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td>gebruik om NGM-platen te maken</td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>46-100-RG</td><td>solvent: water</td></tr><tr><td>Cell strainer</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td>40 &micro;m om volwassenen te verwijderen</td></tr><tr><td>Cholesterol&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>02101380-CF</td><td>5 mg/mL stock</td></tr><tr><td>Difco, Agar, Bacteriologisch</td><td>BD Biosciences</td><td>214510</td><td>gebruik om NGM-platen te maken</td></tr><tr><td>Fluorodeoxyuridine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F0503</td><td>om wormen te steriliseren op L4</td></tr><tr><td>Luria Broth</td><td>RPI</td><td>L24045-1000.0</td><td>capsule openen, mengen met 1 L water, autoclaveren</td></tr><tr><td>M9 Buffer&nbsp;</td><td>Laboratoriumbereid</td><td></td><td>Bewaar onder steriele omstandigheden bij kamertemperatuur Om 1 L te bereiden: &nbsp;15 g Na2HPO4*12H2O (FW: 358) 3 g KH2PO4 (FW: 136) &nbsp;5 g NaCl (FW: 58), 0,25 g MgSO4*7H2O (FW: 246) &nbsp;autoclaveren</td></tr><tr><td>Microplate Sealer</td><td>Fisher Scientific</td><td>236707</td><td></td></tr><tr><td>OP50</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plate 96-well&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>Tecan</td><td>30016056</td><td>gebruik 600 nm filterlens</td></tr><tr><td>Kaliumcitraat, 1 M, pH 6</td><td>Laboratoriumbereid</td><td></td><td>Bewaar onder steriele omstandigheden bij kamertemperatuur Om 1 L te bereiden: 268,8 g Kaliumcitraat tribasisch monohydraat (FW: 324) 26,3 g citroenzuur monohydraat (FW: 210) 900 mL dH2O pH tot 6 met 5 M KOH autoclaveren&nbsp;</td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat, 1 M, pH 6&nbsp;</td><td>Laboratoriumbereid</td><td></td><td>Bewaar onder steriele omstandigheden bij kamertemperatuur Om 1 L te bereiden: 136 g KH2PO4 (FW: 136) 900 mL dH2O &nbsp;pH tot 6 met 5 M KOH autoclaveren</td></tr><tr><td>S-Basal</td><td>Laboratoriumbereid</td><td></td><td>Bewaar onder steriele omstandigheden bij kamertemperatuur Om 1 L te bereiden: 5,9 g NaCl (FW: 58) &nbsp;50 mL 1 M kaliumfosfaat (pH 6) voeg 900 mL dH2O toe autoclaveren, afkoelen tot 55 &deg;C</td></tr><tr><td>S-Complete</td><td>Laboratoriumbereid</td><td></td><td>Bewaar onder steriele omstandigheden bij kamertemperatuur Om 1 L te bereiden: Toevoegen aan 1 L S-basal (afgekoeld tot 55 &deg;C of RT) &nbsp;10 mL van 1 M kaliumcitraat &nbsp;pH 6, 10 mL van sporenmetaaloplossingen &nbsp;3 mL van 1 M CaCl2 3 mL van 1 M MgSO4</td></tr><tr><td>Serotonine hydrochloride</td><td>Thermo Scientific</td><td>AAB2126309</td><td>gebruikt bij 5 mM</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653-5KG</td><td>om buffers en NGM-platen te maken</td></tr><tr><td>Terrific Broth</td><td>Thermo Scientific</td><td>J75856-A1</td><td>12,5 g in 250 mL water, autoclaveren</td></tr><tr><td>Titer plate Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880023</td><td>geschud bij 800 rpm, afhankelijk van de shaker</td></tr><tr><td>Trace Metals Solution&nbsp;</td><td>Laboratoriumbereid</td><td></td><td>Bewaar onder steriele omstandigheden bij kamertemperatuur Om 1 L te bereiden: 1,86 g Na2EDTA (FW: 372,24) 0,69 g FeSO4*7H2O (FW: 278) &nbsp;0,20 g MnCl2*4H2O (FW: 198) 0,29 g ZnSO4*7H2O (FW: 287) &nbsp;0,016 g CuSO4 (FW: 158) autoclaveren verpakken in aluminiumfolie om in het donker te houden</td></tr></tbody></table>

kwantificering van de voedselinname bij caenorhabditis elegans door de bacteriële klaring te meten

Quantifying Food Intake in Caenorhabditis elegans by Measuring Bacterial Clearance

Voeding is een essentieel biologisch proces voor de groei, voortplanting en overleving van een organisme. Deze test heeft tot doel de voedselinname van Caenorhabditis elegans (C. elegans) te meten, een belangrijke parameter bij het bestuderen van de genetica van veroudering of metabolisme. Bij de meeste soorten wordt de voeding bepaald door het verschil te meten tussen de hoeveelheid voedsel die wordt verstrekt en de hoeveelheid die overblijft na een bepaald tijdsinterval. De hier gepresenteerde methode gebruikt dezelfde strategie om de voeding van C. elegans te bepalen. Het meet de hoeveelheid bacteriën, de voedselbron van C. elegans, die binnen 72 uur is opgeruimd. Deze methode maakt gebruik van microtiterplaten met 96 putjes en heeft het mogelijk gemaakt om honderden geneesmiddelen te screenen op hun vermogen om de voedselinname te moduleren met een snelheid en diepte die in andere diermodellen niet mogelijk is. De kracht van deze test is dat het mogelijk is om voeding en levensduur tegelijkertijd te meten en direct het verdwijnen van voedsel te meten en dus gebaseerd is op dezelfde principes die worden gebruikt voor andere organismen, waardoor vergelijking tussen soorten mogelijk wordt.

<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66422/66422fig3_v1.jpg"> Figuur 3: Representatieve gegevens. (A) De grafiek toont dosis-responscurves van vouwverandering in voedselinname als functie van de serotonineconcentratie. Alle gegevens laten zien dat de inname van niet-gestimuleerd basaal voedsel is genormaliseerd naar N2-basale voeding. Merk op dat de daf-16(mu86) dieren meer eten dan de wilde type N2 wanneer er geen serotonine is toegevoegd, maar een afgestompt bereik vertonen in hun vermogen om de voeding te beheersen. (B) Grafiek toont een viooldiagram van vouwverandering in voedselinname van wormen die zijn behandeld met 50 μM van het antipsychoticum Loxapine, maar gevoed met bacteriën die zijn gedood door röntgenstralen, γ stralen of paraformaldehyde (C) Grafiek toont een viooldiagram van vouwverandering in voedselinname van verschillende mutanten met hun genotypen aangegeven in de x-as. Deze gegevens suggereren dat exc-4 en cgr-1 mutanten minder eten, terwijl srp-6 mutanten meer eten. Sterretjes vertegenwoordigen ** p < 0,001, ****p < 0,0001 zoals bepaald door ANOVA en Brown-Forsythe-Welch, post-hoc gecorrigeerd om rekening te houden met het testen van meerdere hypothesen. Foutbalken tonen ±S.E.M. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66422/66422fig3large_v1.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
Figuur 1 toont de algehele workflow van dit protocol. Het illustreert het hele proces, van het maken van de bacteriën tot het verkrijgen van de OD600-meting op dag 1 en dag 4. Bovendien verwijst de infographic naar de specifieke stappen van de methoden die worden gebruikt. Figuur 2A, B toont twee mogelijke experimentele plaatlay-outs, inclusief "geen-wormen" controleputten in rij H, die nodig zijn voor het berekenen van de zelflysepercentages die in de discussiesectie worden beschreven. In de ervaring van ons laboratorium is het noodzakelijk dat een van de omstandigheden onbehandelde N2-controle is om rekening te houden met de variabiliteit van bacteriële inname van wormen die tussen experimenten wordt waargenomen (zie discussie: Planning [N2-referentiepopulatie]).
Figuur 2C is een voorbeeld van de spreadsheet die wordt gebruikt om de gegevens die in dit protocol worden gegenereerd te analyseren. Het markeert het aantal wormen in groen, zelflyse in blauw, dag 1 OD600 en dag 4 OD600 in oranje, en de voedselinname per worm in rood. Bovendien wordt elk putje bijgehouden voor de stam, het medicijn, de concentratie, de datum van het experiment en andere toegevoegde behandelingen. Meer informatie over de specifieke vergelijkingen die worden gebruikt, is te vinden in hoofdstuk 3 van het protocol. Over het algemeen bieden deze spreadsheets (sjabloon geleverd als aanvullend materiaal) een efficiënte gegevensverzameling en analyse van dit protocol.
Figuur 3A toont representatieve resultaten voor een dosis-responscurve van hoe serotonine moduleert bij het voeden van N2 - en daf-16-mutanten met behulp van dit protocol. In dit experiment werd de vouwverandering van basale voedselinname (eerste stip in de curve) berekend over vijf toenemende doses serotonine. Zoals deze resultaten benadrukken, is de N2-stam in staat om op een dosisafhankelijke manier te veel te eten. Voor de daf-16(mu86)- mutant geldt echter dat de basale voeding hoger is dan N2, maar dat de mutant niet op dezelfde dosisafhankelijke manier op serotonine kan reageren als de N2-stam. Dit protocol stelt ons in staat om het voedingsgedrag tussen twee stammen te bepalen, waarbij de concentratie van serotonine de variabele factor was om dosis-responscurves te genereren. Figuur 3B toont de voedselinname van wormen die zijn behandeld met het antipsychoticum Loxapine, maar gevoed met bacteriën die zijn gedood door röntgenstralen, γ stralen of paraformaldehyde. Merk op dat deze experimenten niet parallel werden uitgevoerd en dat de verschillen niet representatief zijn voor de verschillende methoden om de bacteriën te doden, maar te wijten zijn aan interexperimentele variabiliteit. Figuur 3C toont de voedselinname van een reeks genetische stammen, waarbij twee stammen een afname vertonen en één stam een toename van het voedingsgedrag ten opzichte van N2. Deze toepassing van het protocol maakt het mogelijk om één medicijn in één concentratie te testen met verschillende genetische achtergronden. Het is geschikt om genetische achtergronden te identificeren die een andere voedselinnamerespons vertonen dan wildtype N2-controles wanneer ze hetzelfde medicijn krijgen. Het kan worden gecombineerd met ons levensduurprotocol om snel de voedselinname en levensduur te screenen in dezelfde plaatopstelling31.
Aanvullend materiaal: Spreadsheetsjablonen weergegeven in Figuur 2C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66422/66422.zip" target="_blank">Klik hier om deze materialen te downloaden.</a>

Dit protocol beschrijft een test om de voedingssnelheid van Caenorhabditis elegans te kwantificeren op basis van het meten van de klaring van bacteriën in vloeibare cultuur.

Kwantificering van de voedselinname bij Caenorhabditis elegans door de bacteriële klaring te meten

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of ...

Mijn onderzoek richt zich op het begrijpen van de transcriptionele en metabole routes die ten grondslag liggen aan door geneesmiddelen geïnduceerde veranderingen in voedingsgedrag. Ik werk aan het identificeren van medicijnen die de voedselinname verlagen en de levensduur verlengen, wat wijst op het activeren van gezonde vastenroutes. Met behulp van onze bacteriële klaringstest hebben we twee verschillende routes geïdentificeerd die de door serotonine geïnduceerde voedselinname en de door antipsychotica geïnduceerde voedselinname moduleren.Ik bestudeer nu hoe deze routes zich verhouden tot het voeden van langlevende mutanten. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om de relatie tussen voeding en een lang leven te bestuderen. De voedingssnelheid wordt meestal gekenmerkt door faryngeaal pompen.De pompsnelheid in C. elegans is echter niet noodzakelijkerwijs evenredig met de hoeveelheid voedsel die wordt gegeten. Wanneer toegevoegd aan die eerdere tests, geeft dit protocol een kwantificeerbare hoeveelheid voedselinname per wormpopulatie. Onze test stelt ons in staat om voeding kwantitatief te moduleren met behulp van kleine moleculen, en om te bepalen hoe de geïnduceerde verandering tegelijkertijd de levensduur verandert.

quantifying-food-intake-caenorhabditis-elegans-measuring-bacterial

Research

JoVE Journal

Behavior

Gedrag

Deze video introduceert een methode om de integriteit van het C. elegans darmlumen te visualiseren en te meten door wormen fitc-gelabelde dextran te voeren.  Het voorbeeldprotocol toont de test die is uitgevoerd met 3,3'-diindolylmethane (DIM)-behandelde en door ziekteverwekkers gevoede wormen.

FITC-Dextran Feeding: een methode om intestinale permeabiliteit te kwantificeren bij C. elegans

Source: Taylor, M. N., et.al. Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates the exposure of germ-free, age-matched Caenorhabditis elegans worms to a bacterial strain for intestinal colonization. It explains the selective removal of non-adhered and external bacteria, leaving only viable bacteria adhered to the gut epithelium for quantification.

Evaluating Intestinal Bacterial Colonization in Germ-Free C. elegans

Source: Le, T. A. N., et al., Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates a fluorescence-based assay to quantify intestinal permeability in C. elegans exposed to Pseudomonas aeruginosa. Compared to controls fed Escherichia coli, pathogen-treated worms show increased fluorophore leakage into the body cavity, indicating epithelial barrier damage.

Assessment of Intestinal Permeability in C. elegans Following Bacterial Exposure

In this video, we demonstrate a technique for measuring the E. coli bacterial load after injecting E. coli into the thorax of Drosophila melanogaster.

Measuring E. coli Bacterial Load in Drosophila melanogaster following E. coli Infection

Hier presenteren we een kader hebben betrekking op breed scala dieet beperking genexpressie en levensduur. We beschrijven de protocollen voor breed scala dieet beperking en voor kwantitatieve beeldvorming van genexpressie onder dit paradigma. We schetsen verder computationele analyses te onthullen de functies van information processing van de genetische circuits onderliggende betrokken bij voedsel-sensing.

Kwantificering van informatie gecodeerd door Gene Expression niveaus tijdens levensduur modulatie onder breed-scala dieet beperking in C. elegans

Mitochondriale ademhaling is van cruciaal belang voor de overleving van het organisch; Daarom is zuurstof verbruik tarief is een uitstekende indicator voor mitochondriale gezondheid. In dit protocol, beschrijven we het gebruik van een commercieel beschikbare respirometer voor het meten van basale en maximale zuurstof verbruik in leven, intact, en vrij-sporenvormende Caenorhabditis elegans.

Meting van zuurstof verbruik in Intact Caenorhabditis elegans

Dit protocol beschrijft hoe de intestinale permeabiliteit van Caenorhabditis elegansmeten. Deze methode is nuttig voor fundamenteel biologisch onderzoek naar intestinale gezondheid in verband met de interactie tussen darmbacteriën en hun gastheer en voor screening om te identificeren van probiotische en chemische agentia te genezen van lekkende gut syndroom en inflammatoire darmziekten.

Meten van de effecten van bacteriën en chemicaliën op de intestinale permeabiliteit van Caenorhabditis elegans

Dit protocol beschrijft een 96-well verstoring van individuele bacterieel gekoloniseerde Caenorhabditis elegans na koude verlamming en oppervlaktebleking om externe bacteriën te verwijderen. De resulterende suspensie wordt op agarplaten geplaatst om nauwkeurige kwantificering van bacteriële belasting in grote aantallen individuele wormen mogelijk te maken.

Gegevens met één worm gebruiken om heterogeniteit in caenorhabditis elegans-bacteriële interacties te kwantificeren

Caenorhabditis elegans is een krachtig model om de moleculaire determinanten te onderzoeken die de interacties tussen gastheer en microbioom aansturen. We presenteren een pijplijn met hoge doorvoer die de niveaus van darmmicrobioomkolonisatie bij één dier profileert, samen met belangrijke aspecten van de fysiologie van C. elegans.

Toepassing van flowvermimetrie voor kwantificering en analyse van het darmmicrobioom van Caenorhabditis elegans

Een procedure die een demonstratie van robuuste vergroting van op zoek naar drugs in voedsel beperkt ratten laat wordt beschreven. Na heroïne zelftoediening training, ratten gaan door een periode van onthouding, in een drugsvrije omgeving, waarin ze zijn mild eten beperkt. Op zoek naar drugs wordt dan getest in de drugs-geassocieerde omgeving.

Een procedure om het effect van langdurig Eten Beperking Heroïne zoek naar in Abstinent Ratten Studie

Leer de bacteriële klaringassay om voedselinname bij Caenorhabditis elegans te kwantificeren. Deze methode onderzoekt het verband tussen voedingsgedrag en levensduur via metabole paden.

Kwantificering van de voedselinname bij Caenorhabditis elegans door de bacteriële klaring te meten

Meer video's verkennen