Name: Isoleren van interactie-null/aangetaste mutanten met behulp van de gist-twee-hybride test (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 2 min 44 s
Description: Leer de gist-twee-hybride test om interactie-null mutanten te isoleren voor celcyclusregulatie in eukaryoten. Deze methode helpt onderzoekers proteïne-interacties en CDK-functies te begrijpen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Y. Tanaka voerde de technische verbetering van Y2H uit. Dit werk wordt ondersteund door JSPS KAKENHI Grant Number JP22K06336 en het Institute for Fermentation, Osaka.

1. Bouw van de mutantenbibliotheek
<ol><li>Stel de polymerasekettingreactie (PCR) in (een voorbeeld wordt hieronder weergegeven). Bereid over het algemeen 50 μL van de reactie voor, die wordt verdeeld in tien aliquots van 5 μL, en amplificeer het doelgenfragment in een PCR-machine4. OPMERKING: Gebruikers moeten een geschikte polymerase kiezen om mutaties efficiënt te introduceren. Als het te amplificeren DNA-fragment kort is, is een polymerase met een hoger foutenpercentage nodig, zoals Taq-polymerase, dat geen proefleesactiviteit heeft. Als het te amplificeren DNA-fragment lang is, is een polymerase met een hogere getrouwheid nodig om het aantal mutaties te verminderen. Mutaties treden om de paar honderd basenparen op na 30 cycli van amplificatie met regulier Taq-polymerase4. In de representatieve resultaten werd een ander Taq-polymerase gebruikt (zie Materiaaltabel), dat een hogere betrouwbaarheid heeft dan regulier Taq-polymerase, en de mutatiesnelheid was één op 600 basenparen. Een voorbeeld van de PCR-mengsels, de details van de primer en de reactieomstandigheden vindt u in aanvullend dossier 1.</li>
	<li>Wanneer de PCR is voltooid, combineert u alle aliquots van de reactie, bevestigt u dat de DNA-fragmenten van belang zijn geamplificeerd met behulp van agarosegelelektroforese, enz., en zuivert u het DNA5.</li>
	<li>Stel het in stap 1.2 gegenereerde DNA-fragment samen met de juiste Y2H-vector met behulp van een 'naadloze' kloonstrategie (Figuur 1). OPMERKING: Het naadloze kloonsysteem, zoals Gibson assembly6, minimaliseert vervuiling van de geconstrueerde mutantenbibliotheek door lege vectoren die via zelfligatie worden gegenereerd. Een lijst van Y2H-vectoren is opgenomen in tabel 1. Ze kunnen worden bereid door BamHI-vertering voordat ze worden geassembleerd. Alle plasmiden zijn verkrijgbaar bij het National BioResource Project - gist (zie Tabel met materialen).</li>
	<li>Breng het in stap 1.3 gegenereerde reactiemengsel in Escherichia coli-competente cellen die zijn bereid volgens een zeer efficiënt E. coli-transformatieprotocol (bijv. Inoue et al.7). Verspreid alle competente cellen over verschillende LB-platen (1% trypton, 0,5% gistextract, 1% NaCl en 2% agar) die geschikte antibiotica bevatten (zie Materiaaltabel). Verdeel nu een kleine hoeveelheid (~1/100 van de totale reactie) op hetzelfde selectieplaatje om de bibliotheektiter te berekenen. Incubeer de platen een nacht bij 37 °C.</li>
	<li>Zodra een groot aantal E. coli-kolonies is verschenen, schraapt u alle cellen van het oppervlak van de plaat met behulp van een plastic wegwerplus. Herstel plasmide-DNA van deze cellen met behulp van populaire methoden, zoals alkalische lysis8. Tel tegelijkertijd het aantal kolonies dat verschijnt na het verspreiden van kleine hoeveelheden van het transformatiemengsel op de plaat. Maak aan de hand van dit getal een schatting van het totale aantal onafhankelijke klonen in de bibliotheek. OPMERKING: Pak nu een paar onafhankelijke kolonies (4-6) op die op de plaat verschijnen waarop de kleine aliquots van de transformatiereactie zijn verspreid, kweek ze afzonderlijk en isoleer plasmiden ervan om te bevestigen dat vrijwel alle klonen de gewenste DNA-fragmenten dragen5. Er zijn veel commerciële kits beschikbaar om plasmiden uit E. coli te isoleren. Het aantal kolonies dat op de plaat verschijnt na het verspreiden van kleine aliquots kan handmatig worden geteld.</li>
	<li>Meet de concentratie van de DNA-pool van de bibliotheek. Gewoonlijk is een paar honderd nanogram bibliotheek-DNA voldoende om in de volgende stap enkele duizenden transformaties te verkrijgen. OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de DNA-concentratie te meten met behulp van een fluorescerende kleurstof die zich aan DNA bindt, omdat de meting van A260 vaak onnauwkeurig is.</li>
</ol>2. Transformatie van gist met de mutantenbibliotheek en replica plating
<ol><li>Introduceer de mutantenbibliotheek in de gastheergiststam (TAT-7 (L40-ura3)9,10 MATa, leu2-3,112, trp1-901, his3-Δ200, ade2-101, gal80Δ, LYS2:(lexAop)4-HIS3, ura3:(lexAop)8-lacZ) voor de Y2H-test met behulp van ongeveer 100 ng DNA. Transformeer de gastheercellen vooraf met het 'aas'-plasmide.<ol><li>Na de transformatieprocedure suspendeert u de gistcellen in steriel water en verspreidt u aliquots van verschillende hoeveelheden op geschikte platen (meestal SC-medium zonder leucine en tryptofaan: SC-LW [0,67% giststikstofbasis, 2% glucose, 1,546 g/L SC dubbele drop-out mix -Leu -Trp en 2% agar, zie Materiaaltabel]). Incubeer deze platen een nacht bij 30 °C. OPMERKING: Het standaardprotocol, zoals de lithiumacetaat-PEG-methode11 met ~5 × 106 logaritmisch groeiende cellen, is voldoende voor de transformatie van gist. Een andere methode met een hoge transformatie-efficiëntie, zoals elektroporatie, kan ook worden gebruikt.</li>
	</ol></li>
	<li>De volgende dag, wanneer kleine kolonies verschijnen, selecteert u de platen met een geschikt aantal cellen (500-2000) en maakt u er als volgt replicaten van.</li>
	<li>Leg twee vellen filtreerpapier op een replicablok om meerdere replica's te maken (medium is SC-LW en SC-LW bevattend kanamycine) (zie Materiaaltabel). Incubeer bij 30 °C gedurende 1-2 dagen. OPMERKING: De concentratie kanamycine (G418) is 600 μg/ml. Gebruik geen fluweel voor replica-plating, omdat de resolutie van kolonies verloren gaat.</li>
	<li>Zodra de kolonies zijn gegroeid, vergelijk je borden en kies je kandidaten. Voer een Y2H-kleurentest uit (zie stap 3) als lacZ als verslaggever wordt gebruikt. OPMERKING: Voor de Y2H-verslaggever is lacZ meestal beter in het detecteren van een zwakke interactie dan HIS3.</li>
</ol>3. Y2H-kleurentest
<ol><li>Leg een vel filtreerpapier dat van tevoren op de juiste maat is gesneden op de replicaplaat die met stap 2 is voorbereid. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan tussen het filterpapier en de plaat. OPMERKING: Gebruik filterpapier nr. 4A of filterpapier van klasse 50 (zie materiaaltabel). Elke SC-LW of SC-LW bevattende kanamycine-platen, die zijn gemaakt door middel van replicaplating, kunnen worden gebruikt voor de kleurentest.</li>
	<li>Wanneer het filterpapier op de plaat volledig bevochtigd is (wanneer de kleur van het filtreerpapier volledig verandert), leg je er meerdere vellen keukenpapier op en zorg je ervoor dat het in contact komt met het filterpapier om overtollig vocht te verwijderen. Verwijder het keukenpapier wanneer het water is opgenomen en van kleur verandert. Herhaal dit proces twee of drie keer.</li>
	<li>Pak de randen van het filterpapier op met een pincet, trek het snel van de plaat, dompel het onder in vloeibare stikstof en vries het in. Als er geen vloeibare stikstof beschikbaar is, leg het filterpapier dan op een plastic bakje met de koloniekant naar boven en plaats het onmiddellijk in een vriezer (-20 °C tot -80 °C) om volledig te bevriezen.</li>
	<li>Verwijder het bevroren filtreerpapier en leg het, met de koloniekant naar boven, op een droge papieren handdoek om te ontdooien. Plaats het filtreerpapier onmiddellijk na het ontdooien met de koloniezijde naar boven op een ander filtreerpapier dat op een plastic bakje of afsluitbare container is geplaatst en gedrenkt is met Z-buffer (60 mM Na2HPO4, 40 mM NaH2PO4, 10 mM KCl en 1 mM MgSO4, pH 7,0) bevattend X-gal (5-broom-5-chloor-3-indolyl-β-D-galactoside) en 2-mercaptoethanol9 (zie Materiaaltabel). Zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan tussen het bovenste en onderste filterpapier.</li>
	<li>Dek het plastic bakje met het filterpapier af en doe het in een luchtdichte verpakking of plastic zak. Sluit de luchtdichte verpakking of plastic zak en broed deze uit bij 37 °C tot er een blauwe kleur verschijnt.</li>
	<li>Wanneer er een blauwe kleur verschijnt, plaatst u het filtreerpapier met de koloniezijde naar boven op ongeveer 500 μL stopoplossing (1 M Na2CO3) op een schone plastic bak. Stopoplossing trekt snel in; Verwijder het filter daarom onmiddellijk, leg het op een schone papieren handdoek met de koloniekant naar boven en laat het drogen.</li>
	<li>Nadat de papieren handdoek is vervangen en het filter droog genoeg is, gebruikt u een scanner of ander apparaat om de gegevens vast te leggen.</li>
</ol>4. Herstel en bevestiging van kandidaat-klonen
<ol><li>Selecteer witte en KanR kandidaat-klonen van de originele plaat van de replica (of de gerepliceerde plaat die niet is gebruikt voor de kleurentest). Voorbeelden zijn weergegeven in figuur 1C. Controleer of kandidaat-klonen wit en KanR zijn door ze opnieuw te strepen als een klein vlekje op SC-LW-medium dat kanamycine bevat en ze gedurende 1-2 dagen bij 30 °C te incuberen. Maak minstens twee sets of maak de volgende dag replica's. OPMERKING: Witte kolonies moeten worden geselecteerd omdat lichtblauwe kolonies de interactie kunnen behouden.</li>
	<li>Zodra kandidaat-klonen goed zijn hergroeid, herhaalt u de kleurentest met ten minste één plaat die in stap 4.1 is gegenereerd, zoals beschreven in stap 3, en controleert u of ze wit blijven en niet blauw worden (Figuur 2A). OPMERKING: Wanneer u de kandidaten opnieuw uitstrooit, draag dan geen grote hoeveelheden cellen over. Te veel cellen maken het onmogelijk om KanR - en KanS-klonen te onderscheiden.</li>
	<li>Neem klonen die nog wit zijn en KanR gegenereerd in stap 4.2 van de plaatresten en kweek ze zelfstandig in 1 ml selectiemedium (SC-L of SC-W, afhankelijk van welke vector wordt gebruikt voor de bibliotheekconstructie) 's nachts bij 30 °C.</li>
	<li>Breng de cultuur over naar een microbuis en verzamel cellen door centrifugeren (~15.000 × g, gedurende 10-30 seconden bij kamertemperatuur). Isoleer het hele DNA van de celpellet als volgt.</li>
	<li>Suspendeer de celpellet in 400 μl lysisbuffer (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (8.0) en 1 mM EDTA) met elk 1 μl 2-mercaptoethanol en 20 mg/ml Zymolyase 100T (zie materiaaltabel) en incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten om de celwanden te verteren. Meng op dit moment voorzichtig door de tube elke 5-10 minuten om te keren.</li>
	<li>Wanneer de celsuspensie ondoorzichtig of doorschijnend is geworden, voeg dan een gelijk volume van een mengsel van fenol-chloroform-isoamylalcohol (25:24:1) toe en meng goed door 10-20 s op matige snelheid te vortexen.</li>
	<li>Centrifugeer de microbuisjes in een microcentrifuge gedurende 5 minuten op volle snelheid (~15.000 × g, bij kamertemperatuur) en herstel de waterige fase met DNA in een nieuwe microbuis. Voeg 0,8 volume isopropanol toe en meng goed door de tube om te keren.</li>
	<li>Laat de buis 2-3 minuten op kamertemperatuur staan en centrifugeer vervolgens 4-5 minuten in een microcentrifuge op volle snelheid (~15.000 × g, bij kamertemperatuur) om het DNA neer te slaan.</li>
	<li>Verwijder het supernatans en was het neerslag met ongeveer 500 μL 70% ethanol. Verwijder de ethanol volledig en droog het neerslag kort.</li>
	<li>Voeg 20 μL TE-buffer (10 mM Tris-Cl (8.0) en 1 mM EDTA) toe aan het neerslag, meng kort en laat de buis een nacht op kamertemperatuur staan om het neerslag op te lossen. OPMERKING: Als gebruikers haast hebben, houd de buizen dan op 37-50 °C. Het DNA-neerslag lost binnen een paar uur op.</li>
	<li>Zodra de pellet volledig is opgelost, transformeert u E. coli met een kleine hoeveelheid van deze DNA-oplossing. OPMERKING: Ongeveer 0,5 μL DNA-oplossing is voldoende als E. coli met een hoge transformatie-efficiëntie wordt gebruikt.</li>
	<li>Wanneer E. coli-kolonies verschijnen, kies dan verschillende onafhankelijke kolonies, kweek ze en herstel plasmiden met behulp van standaardmethoden, zoals alkalische lysis.</li>
	<li>Introduceer het plasmide-DNA dat in stap 4.12 is verkregen in Y2H-gastheercellen die het aasplasmide herbergen. Wanneer transformanten verschijnen, controleer ze dan aan de hand van de kleurtest (ze moeten wit lijken) en western blotting4 (ze moeten een eiwit van de gewenste grootte tot expressie brengen). OPMERKING: De post-alkalische methode12 is een gemakkelijke en snelle manier om een extract van hele cellen uit gist te bereiden.</li>
	<li>Als aan de bovenstaande twee criteria is voldaan, bepaal dan de mutatieplaats van de klonen door nucleotidesequencing4.</li>
</ol>

Biomoleculaire interactiestudies met behulp van gist-twee-hybride techniek 

<ol><li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li>
<li>Leanna, C. A., Hannink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reverse+two-hybrid+system%3A+A+genetic+scheme+for+selection+against+specific+protein%2Fprotein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The reverse two-hybrid system: A genetic scheme for selection against specific protein/protein interactions.</a> Nucleic Acids Res. 24 (17), 3341-3347 (1996).</li>
<li>Vidal, M., Brachmann, R. K., Fattaey, A., Harlow, E., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+two-hybrid+and+one-hybrid+systems+to+detect+dissociation+of+protein-protein+and+DNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (19), 10315-10320 (1996).</li>
<li>Tanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+the+isolation+of+interaction-null%2Fimpaired+mutants+using+the+yeast+two-hybrid+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">An efficient method for the isolation of interaction-null/impaired mutants using the yeast two-hybrid technique.</a> Genes Cells. 24 (12), 781-788 (2019).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+cloning%3A+A+laboratory+manual.+4th+edn%22">Molecular cloning: A laboratory manual. 4th edn</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96 (1), 23-28 (1990).</li>
<li>Birnboim, H. C., Doly, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+alkaline+extraction+procedure+for+screening+recombinant+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA.</a> Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).</li>
<li>Bartel, P. L., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+protein-protein+interactions+using+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analyzing protein-protein interactions using two-hybrid system.</a> Meth Enzymol. 254, 241-263 (1995).</li>
<li>Hollenberg, S. M., Sternglanz, R., Cheng, P. F., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+new+family+of+tissue-specific+basic+helix-loop-helix+proteins+with+a+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system.</a> Mol Cell Biol. 15 (7), 3813-3822 (1995).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate%2Fsingle-stranded+carrier+DNA%2Fpolyethylene+glycol+method%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Meth Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li>
<li>Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reliable+protein+extraction+from+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Rapid and reliable protein extraction from yeast.</a> Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).</li>
<li>Van Deursen, F., Sengupta, S., De Piccoli, G., Sanchez-Diaz, A., Labib, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mcm10+associates+with+the+loaded+DNA+helicase+at+replication+origins+and+defines+a+novel+step+in+its+activation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Mcm10 associates with the loaded DNA helicase at replication origins and defines a novel step in its activation.</a> EMBO J. 31 (9), 2195-2206 (2012).</li>
<li>Watase, G., Takisawa, H., Kanemaki, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mcm10+plays+a+role+in+functioning+of+the+eukaryotic+replicative+DNA+helicase%2C+cdc45-mcm-gins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Mcm10 plays a role in functioning of the eukaryotic replicative DNA helicase, cdc45-mcm-gins.</a> Current Biology: CB. 22 (4), 343-349 (2012).</li>
<li>Miyazawa-Onami, M., Araki, H., Tanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-initiation+complex+assembly+functions+as+a+molecular+switch+that+splits+the+mcm2-7+double+hexamer%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Pre-initiation complex assembly functions as a molecular switch that splits the mcm2-7 double hexamer.</a> EMBO Rep. 18 (10), 1752-1761 (2017).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflict hebben.

In dit artikel wordt beschreven hoe je interactie-null/gestoorde mutanten kunt isoleren met behulp van de Y2H-test. Dergelijke mutanten zijn krachtige hulpmiddelen om de functie van een interessant eiwit te analyseren. Om dergelijke mutanten te isoleren, werden eerder rY2H-assays ontwikkeld door de Y2H-gastheerstam 2,3 te modificeren. Ze hebben de hoeveelheid arbeid echter niet sterk verminderd. Daarentegen kunnen mutanten met deze methode worden geïsoleerd zonde...

Interacties tussen biomoleculen zijn het meest basale onderdeel van biologische fenomenen. Eiwit-eiwitinteracties vormen een aanzienlijk deel van dergelijke interacties. Daarom is identificatie van de interactiepartner(s) van een interessant eiwit van cruciaal belang om de functie van het eiwit/gen van belang verder op te helderen. De gist-twee-hybride (Y2H) methode is een populaire techniek om eiwit-eiwitinteracties in vivo1 te identificeren. In dit systeem worden twee eiwitten (X en Y) waarvan de interactie moet worden getest, gefuseerd met respectievelijk het DNA-bindende (DB) domein en het transcriptionele activeringsdomein (AD). Het DB-X-fusie-eiwit bindt aan een herkenningssequentie van het DB-domein; daarom, wanneer eiwitten X en Y interageren, komt het AD-Y-fusie-eiwit in de buurt van de herkenningssequentie. Bijgevolg wordt transcriptie van het reporter-gen stroomafwaarts van de herkenningssequentie geactiveerd. Daarom kan de aan- of afwezigheid van activiteit van reportergen worden gebruikt om de aan- of afwezigheid van de eiwit-eiwitinteractiete bepalen 1.
Zodra een specifieke interactiepartner van het betreffende eiwit is geïdentificeerd, moeten verdere analyses worden uitgevoerd om de biologische functie van de interactie op te helderen. Voor dit doel, als mutanten van de eiwitten die de specifieke eiwit-eiwitinteractie aantasten of verwijderen, kunnen worden geïsoleerd, zullen ze dienen als krachtige hulpmiddelen. Het Y2H-systeem kan direct worden gebruikt om dergelijke mutanten te isoleren door 'interactie-negatieve' klonen te screenen, te beginnen met de wild-type 'interactie-positieve' kloon. Om dit proces te versnellen werden 'omgekeerde' Y2H (rY2H) systemen ontwikkeld 2,3. In rY2H-systemen herbergen de gastheergiststammen contra-selecteerbare markergenen als reportergenen, wat betekent dat gistcellen alleen groeien als de AD-Y- en DB-X-eiwitten niet op elkaar inwerken.
Hoewel zowel de Y2H- als de rY2H-systemen de isolatie van interactie-negatieve mutanten mogelijk maken, is het proces van het isoleren van de mutanten moeizaam omdat niet alle kandidaten die door screening worden verkregen, het gewenste type mutaties dragen (meestal missense-mutaties). Het ernstigste probleem is dat een aanzienlijk deel van de kandidaten frameshift- of onzinmutaties herbergt, en het is noodzakelijk om western blotting uit te voeren om ongewenste klonen uit te sluiten. Om dit probleem op te lossen, zijn nieuwe plasmidevectoren ontwikkeld4. In deze vectoren wordt KanMX, een marker voor geneesmiddelresistentie, out-of-frame downstream van het DB-domein of AD gepositioneerd. Het markergen wordt pas in-frame met het DB-domein of AD wanneer het gen van interesse wordt ingebracht. Wanneer een willekeurige mutatie of mutaties wordt geïntroduceerd in het gen van belang, kunnen ongewenste mutanten, zoals mutanten met frameshift of nonsense-mutaties, gemakkelijk worden geëlimineerd door selectie van geneesmiddelresistentie uit te voeren, en kandidaten met gewenste missense-mutaties kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd met de Y2H-screening4. Dit artikel presenteert een protocol om interactie-null/verminderde mutanten van een eiwit van belang te isoleren met behulp van deze strategie.

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA (8.0)</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>14347-21</td><td></td></tr><tr><td>10% SDS Solution</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>313-90275</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>135-07522</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Kishida Chemical Co. Ltd.</td><td>110-64785</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-&beta;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>021-07852</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Formedium</td><td>AGR60</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin Sodium</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>68-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HA-tag mAb-HRP-DirecT&nbsp;&nbsp;</td><td>Medical &amp; Biological Laboratories Co. Ltd.</td><td>M180-7</td><td></td></tr><tr><td>DNA from salmon testes</td><td>Merck KGaA.</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck KGaA.</td><td>9-0770-4-4L-J</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper for colony lift (Grade 50)</td><td>Whatman, Cytiva</td><td>1450-090</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper for colony lift (No.4A)</td><td>Advantec Toyo Kaisha, Ltd.</td><td>01411090</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper for replicaplating (No.1)</td><td>Advantec Toyo Kaisha, Ltd.</td><td>00011150</td><td></td></tr><tr><td>G-418 Sulfate</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>075-05962</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Kishida Chemical Co. Ltd.</td><td>230-37585</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>Lithium Acetate Dihydrate</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>20604-22</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&bull;7H2O</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>131-00405</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&bull;12H2O</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>10039-32-4</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>31319-45</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&bull;2H2O</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>31717-25</td><td></td></tr><tr><td>Paper towel</td><td>AS ONE Corp.</td><td>7-6200-02</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>25970-56</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid DNAs</td><td>the National BioResource Project - yeast (https://yeast.nig.ac.jp/yeast/top.xhtml)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmid isolation Kit</td><td>Nippon Genetics Co. Ltd.</td><td>FG-90502</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol #4,000</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>11574-15</td><td></td></tr><tr><td>SC double drop-out mix -Leu -Trp</td><td>Formedium</td><td>DSCK172</td><td></td></tr><tr><td>Seamless cloning kit (In-Fusion assembly )</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>#639648</td><td></td></tr><tr><td>Skim milk powder</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>190-12865</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin Sulfate</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>3810-74-0</td><td></td></tr><tr><td>Taq polymerase (GoTaq Green Master Mixes)</td><td>Promega Corp.</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>TRIS (hydroxymethyl) aminomethane</td><td>Formedium</td><td>TRIS01</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>12967-45</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>ThermoFisher scientific Inc.</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>35624-15</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>ThermoFisher scientific Inc.</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base (YNB)</td><td>Formedium</td><td>CYN0210</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>07665-55</td><td></td></tr></tbody></table>

isoleren van interactie-null/aangetaste mutanten met behulp van de gist-twee-hybride test

Isolating Interaction-Null&#47;Impaired Mutants Using the Yeast Two-Hybrid Assay

Eiwit-eiwitinteracties zijn een van de meest basale processen die ten grondslag liggen aan biologische verschijnselen. Een van de eenvoudigste en beste manieren om de rol(len) en functie(s) van een specifieke eiwit-eiwitinteractie te begrijpen, is door het fenotype van het wildtype (met de relevante eiwit-eiwitinteractie) te vergelijken met die van mutanten die de relevante interactie missen. Daarom, als dergelijke mutanten kunnen worden geïsoleerd, zullen ze helpen om de gerelateerde biologische processen op te helderen. De gist-twee-hybride (Y2H) procedure is een krachtige aanpak, niet alleen om eiwit-eiwitinteracties te detecteren, maar ook om interactie-null/verminderde mutanten te isoleren. In dit artikel wordt een protocol gepresenteerd om interactie-null/gestoorde mutanten te isoleren met behulp van Y2H-technologie. Eerst wordt een mutatiebibliotheek geconstrueerd door de polymerasekettingreactie te combineren met efficiënte naadloze kloontechnologie, die de lege vector efficiënt uit de bibliotheek uitsluit. Ten tweede worden interactie-null/gestoorde mutanten gescreend door de Y2H-test. Door een truc in de Y2H-vector worden ongewenste mutanten, zoals mutanten met frameshift en nonsense-mutaties, efficiënt uit het screeningproces geëlimineerd. Deze strategie is eenvoudig en kan daarom worden toegepast op elke combinatie van eiwitten waarvan de interactie kan worden gedetecteerd door het twee-hybride systeem.

Onlangs werd ontdekt dat de C-terminale helft van het Pol2-eiwit (Pol2-C) interageert met Mcm10. Beide eiwitten zijn essentieel voor het op gang brengen van DNA-replicatie en dus voor de celgroei in de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae 13,14,15. Om de biologische betekenis van deze interactie te helpen begrijpen, werden Pol2-C-mutanten die geen/verminderde interactie met Mcm10 hebben, geïsoleerd met behulp van d...

De interacties van biomoleculen, zoals eiwit-eiwitinteracties, vormen de moleculaire basis van biologische functies. Als interactie-nulle/gestoorde mutanten die specifiek de relevante interactie missen, kunnen worden geïsoleerd, zullen ze enorm helpen om de functie(s) van deze interactie te begrijpen. Dit artikel presenteert een efficiënte manier om interactie-null/verminderde mutanten te isoleren.

Isoleren van interactie-null/aangetaste mutanten met behulp van de gist-twee-hybride test

Protein-protein interactions are one of the most basic processes that underlie biological phenomena. One of the simplest and best ways to understand the ...

We zijn geïnteresseerd in het begrijpen van de regulerende mechanismen van de celcyclus in eukaryoten, met name de relatie tussen DNA-replicatie, stabiel kiemonderhoud en celproliferatie. De progressie van de celcyclus wordt gereguleerd door cycline-afhankelijke kinasen, of CDK's, in eukaryoten. Dit is het geval voor het initiëren van DNA-replicatie.We hebben een manier gevonden, op substraten van CDK's, om DNA-replicatie te initiëren. Om de functie van het eiwit van uw interesse te begrijpen, is een vergelijking van het wildtype en de mutant een directe en effectieve manier. Gist twee-hybride test, die eenvoudig te detecteren is en het proces van het isoleren van interactie-null-mutanten zal verbeteren.Dit zal bijdragen aan de vooruitgang van het onderzoek in het veld.

isolating-interaction-nullimpaired-mutants-using-yeast-two-hybrid

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

MYTHE kan de gevoelige detectie van voorbijgaande aard en stabiele interacties tussen eiwitten die worden uitgedrukt in het model organisme Saccharomyces cerevisiae. Het is met succes toegepast op exogene en gist integrale membraaneiwitten bestuderen om hun interagerende partners in een high throughput manier te identificeren.

Split-Ubiquitine membraanfilters op Yeast Two-Hybrid (mythe) Systeem: een krachtig hulpmiddel voor het identificeren van eiwit-eiwit interacties

We hebben gewijzigd de conventionele gist twee-hybride screening, een effectief middel bij het identificeren van genetische eiwit interactie. Deze wijziging verkort aanzienlijk het proces, vermindert de werkdruk, en het belangrijkst, vermindert het aantal false positives. Daarnaast is deze aanpak is reproduceerbaar en betrouwbaar.

Gemodificeerde gist-twee-hybride systeem aan eiwitten Interactie met de groeifactor progranuline identificeren

This video demonstrates the yeast two-hybrid assay to detect specific protein self-interactions. In this assay, the protein of interest is tagged to two domains of a transcription factor that encodes the β-galactosidase enzyme. When the two proteins interact, this causes transcription and translation to form the enzyme, which is then detected using a biochemical assay.

Yeast Two-Hybrid Assay to Determine Protein Self-Association in Yeast Cells

In this video, we demonstrate the modified yeast one-hybrid assay, which detects multiple proteins interacting with target DNA. The transformed yeast cells contain the target DNA sequence upstream of the reporter gene. Additionally, they express transcription factor proteins. When the proteins form complexes and bind to the target DNA, the reporter gene is expressed and can be detected enzymatically.

Modified Yeast-One Hybrid Assay to Detect Heteromeric Protein Complex-DNA Interactions

Dit artikel richt zich op de identificatie van hoog-vertrouwen interactie datasets tussen gastheer en pathogeen-eiwitten met behulp van een combinatie van twee orthogonale methoden: gist twee-hybride, gevolgd door een high-throughput interactie test bij zoogdiercellen genaamd HT-GPCA.

Een vergelijkende benadering van het Landschap van gastheer-pathogeen eiwit-eiwit interacties karakteriseren

Ketoconazol bindt aan en antagoniseert pregnaan X Receptor (PXR) activering. Gist high throughput screens van PXR mutanten definiëren een unieke regio voor ketoconazol bindend. Dit op basis van gist genetische methode ontdekt nieuwe nucleaire receptor interacties met liganden die associëren met oppervlakte bindingsplaatsen.

Reverse Gist Twee-hybride systeem voor het identificeren van zoogdieren Nuclear Receptor Residuen die interageren met liganden en / of antagonisten

Oligomerisatie van de ryanodine receptor, een homo-tetramer ionkanaal dat Ca2+ vrijmaakt uit intracellulaire opslag, is cruciaal voor skeletspier- en hartspiercontractie. Hier presenteren we complementaire in vivo en in vitro methoden om eiwit-zelfassociatie te detecteren en homo-oligomeer stoichiometrie te bepalen.

Genetische en biochemische benaderingen voor<em&gt; In Vivo</em&gt; en<em&gt; In Vitro</em&gt; Evaluatie van Protein Oligomerisatie: De ryanodinereceptor Case Study

Bacteriële effector eiwitten zijn belangrijk voor het vaststellen succesvolle infecties. Dit protocol beschrijft de experimentele identificatie van proteïne bindingspartners van een bacteriële effector eiwit in zijn natuurlijke plantaardige gastheer. Het identificeren van deze effector interacties via gist-twee-hybride-schermen is uitgegroeid tot een belangrijk instrument in het ontrafelen van de moleculaire pathogeniteit strategieën.

Het ontrafelen van de functie van een bacteriële Effector uit een niet-landbouw Plant Pathogeen Met behulp van een gist two-hybrid screen

Batch-verwerking van gist 2-hybrid schermen zorgt voor directe vergelijking van de profielen van de interactie van meerdere aas eiwitten met een zeer complexe verzameling prooi fusion eiwitten. We beschrijven hier, verfijnde methoden, nieuwe reagentia en het implementeren van het gebruik ervan voor dergelijke schermen.

Een gist 2-Hybrid scherm in Batch om te vergelijken eiwitinteractie

Wij presenteren een eenvoudige suppressor scherm protocol in kernsplijting gist. Deze methode is efficiënt, mutageen-vrije en selectieve voor mutaties die vaak bij een enkele genomic locus voorkomen.  Het protocol is geschikt voor het isoleren van suppressors die verlichten van gebreken van de groei in vloeibare cultuur die worden veroorzaakt door een mutatie of een drug.

Een Deep-sequencing-bijgewoonde, spontane Suppressor scherm in de kernsplijting gist Schizosaccharomyces pombe

Hier presenteren we een verbeterde gist één-hybrid screening protocol ter identificatie van de transcriptiefactoren (TFs) die zich aan een menselijke DNA-regio van belang binden kunnen. Deze methode maakt gebruik van een high-throughput screening-pijpleiding die de binding van ondervragen kan &gt; 1000 TFs in een enkele experiment.

Verbeterde gist One-hybride schermen te identificeren van de transcriptiefactor binden aan menselijke DNA-sequenties

Leer de gist-twee-hybride test om interactie-null mutanten te isoleren voor celcyclusregulatie in eukaryoten. Deze methode helpt onderzoekers proteïne-interacties en CDK-functies te begrijpen.

Isoleren van interactie-null/aangetaste mutanten met behulp van de gist-twee-hybride test

Meer video's verkennen