Name: Strategie voor biobanking van organoïden van eierstokkanker: aanpak van de heterogeniteit tussen patiënten tussen histologische subtypes en ziektestadia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Leer een systematische methode voor biobanking van eierstokkanker-organoïden uit verschillende ziektestadia. Dit protocol behandelt patiëntspecifieke variabiliteit en verbetert de opbrengst voor langdurige expansie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De studie wordt gefinancierd door het Duitse kankeronderzoekscentrum DKTK, partnersite München, een samenwerkingsverband tussen DKFZ en het Universitair Ziekenhuis LMU München. De studie wordt ook ondersteund door de Duitse subsidie voor kankerhulp (#70113426 en #70113433). Paraffine-inbedding van weefsel en organoïden is uitgevoerd in de Core-faciliteit van het Instituut voor Anatomie, Faculteit der Geneeskunde, LMU München, München. Confocale beeldvorming is uitgevoerd in de kernfaciliteit Bioimaging in het Biomedisch Centrum (BMC). De auteurs willen Simone Hofmann, Maria Fischer, Cornelia Herbst, Sabine Fink en Martina Rahmeh bedanken voor hun technische hulp.

Standaardisatie van eierstokkanker Organoïde Biobanking

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 72 (1), 7-33 (2022).</li>
<li>Berger, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+pan-cancer+molecular+study+of+gynecologic+and+breast+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A comprehensive pan-cancer molecular study of gynecologic and breast cancers.</a> Cancer Cell. 33 (4), 690-705 (2018).</li>
<li>Watson, R. W. G., Kay, E. W., Smith, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+biobanks%3A+addressing+the+practical+and+ethical+issues+to+deliver+a+valuable+tool+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Integrating biobanks: addressing the practical and ethical issues to deliver a valuable tool for cancer research.</a> Nat Rev Cancer. 10 (9), 646-651 (2010).</li>
<li>Coppola, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biobanking+in+health+care%3A+evolution+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Biobanking in health care: evolution and future directions.</a> J Transl Med. 17 (1), 172(2019).</li>
<li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Hill, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+DNA+repair+inhibitor+response+in+short-term+patient-derived+ovarian+cancer+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids.</a> Cancer Discov. 8 (11), 1404-1421 (2018).</li>
<li>Kopper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organoid+platform+for+ovarian+cancer+captures+intra-+and+interpatient+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity.</a> Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).</li>
<li>Larsen, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pan-cancer+organoid+platform+for+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A pan-cancer organoid platform for precision medicine.</a> Cell Rep. 36 (4), 109429(2021).</li>
<li>Bartfeld, S., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-derived+organoids+and+their+application+for+medical+research+and+patient+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment.</a> J Mol Med (Berl). 95 (7), 729-738 (2017).</li>
<li>Larsen, B. M., Cancino, A., Shaxted, J. M., Salahudeen, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+drug+screening+of+patient-derived+tumor+organoids+using+high-content+fluorescent+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for drug screening of patient-derived tumor organoids using high-content fluorescent imaging.</a> STAR Protoc. 3 (2), 101407(2022).</li>
<li>Senkowski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platform+for+efficient+establishment+and+drug-response+profiling+of+high-grade+serous+ovarian+cancer+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A platform for efficient establishment and drug-response profiling of high-grade serous ovarian cancer organoids.</a> Dev Cell. 58 (12), 1106-1121 (2023).</li>
<li>LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+cancer+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Next-generation cancer organoids.</a> Nat Mater. 21 (2), 143-159 (2022).</li>
<li>Hoffmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+expansion+of+high-grade+serous+ovarian+cancer+organoids+requires+a+low-Wnt+environment%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Stable expansion of high-grade serous ovarian cancer organoids requires a low-Wnt environment.</a> EMBO J. 39 (6), e104013(2020).</li>
<li>Kessler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Notch+and+Wnt+pathways+regulate+stemness+and+differentiation+in+human+fallopian+tube+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The Notch and Wnt pathways regulate stemness and differentiation in human fallopian tube organoids.</a> Nat Commun. 6, 8989(2015).</li>
<li>Trillsch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+to+optimize+the+biobanking+of+ovarian+cancer+organoids+by+accommodating+patient-specific+differences+in+stemness+potential%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol to optimize the biobanking of ovarian cancer organoids by accommodating patient-specific differences in stemness potential.</a> STAR Protoc. 4 (3), 102484(2023).</li>
<li>Maenhoudt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+organoids+from+ovarian+cancer+as+experimental+and+preclinical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Developing organoids from ovarian cancer as experimental and preclinical models.</a> Stem Cell Reports. 14 (4), 717-729 (2020).</li>
<li>Fuerer, C., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+to+probe+and+manipulate+the+Wnt+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors to probe and manipulate the Wnt signaling pathway.</a> PLoS One. 5 (2), e9370(2010).</li>
<li>Leica Biosystems. Leica ASP300S - Advanced smart processor vacuum tissue processor, instructions for use, V 2.1. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/media_product-download/2022-01/Leica_ASP300S_IFU_2v1N_en.pdf">https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/media_product-download/2022-01/Leica_ASP300S_IFU_2v1N_en.pdf</a> (2021).</li>
<li>Thermo Scientific. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Microm+EC350+Modular+tissue+embedding+center+Instruction+manual%22">Microm EC350 Modular tissue embedding center Instruction manual</a>. , (2009).</li>
<li>Nanki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+ovarian+cancer+organoids+capture+the+genomic+profiles+of+primary+tumours+applicable+for+drug+sensitivity+and+resistance+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing.</a> Sci Rep. 10 (1), 12581(2020).</li>
</ol>

M.K. staat vermeld als uitvinder op een patent met betrekking tot een medium voor eierstokkankerorganoïden. F.T. ontving onderzoeksfinanciering, adviesraad, honoraria en reiskosten van AstraZeneca, Clovis, Eisai, ImmunoGen, Medac, MSD, PharmaMar, Roche, SAGA diagnostics en Tesaro/GSK. S.M. ontving onderzoeksfinanciering, adviesraad, honorarium of reiskostenvergoeding: AbbVie, AstraZeneca, Clovis, Eisai, GlaxoSmithKline, Hubro, Medac, MSD, Novartis, Nykode, Olympus, PharmaMar, Pfizer, Roche, Sensor Kinesis, Teva, Tesaro.

Het ontworpen protocol pakt eerdere uitdagingen aan van de biobanking van eierstokkankerorganoïden met betrekking tot organoïdevorming en doorgangspotentieel op lange termijn en zorgt voor het genereren van volledig uitbreidbare lijnen uit de meeste solide tumorafzettingen. Het chirurgische verzamelproces van tumormonsters die worden gebruikt voor het genereren van organoïden heeft een aanzienlijke invloed op de opbrengst en het uitbreidingspotentieel. Tumorweefselmonsters kunnen worden verkregen tijdens verschillende procedures, waaronder multiviscerale chirurgie, diagnostische laparoscopie of biopsie. De ervaren gynaeco-oncologische chirurg moet prioriteit geven aan het verkrijgen van schone tumormonsters van peritoneale locaties. Er is met name waargenomen dat macroscopisch necrotische gebieden binnen grote tumorafzettingen minder geschikt zijn voor het succesvol genereren van organoïdeculturen. Aangezien de zuiverheid van het monster cruciaal is om moleculaire en fenotypische kenmerken voor stroomafwaartse toepassingen weer te geven, zijn gesynchroniseerde inspanningen van zowel de klinische als de laboratoriumteams vereist voor een optimale biobanking, zodat de lijnen worden gemaakt vanuit de meest relevante regio's van de tumor.
Hoewel dit protocol betrekking heeft op variaties in groeifactorafhankelijkheden die we hebben waargenomen tijdens 2 jaar biobankieren, is het duidelijk dat aanvullende verfijning gerechtvaardigd is om de werkzaamheid verder te verhogen, aangezien we in 20% van de gevallen nog steeds geen organoïdegroei hebben waargenomen en het aantal lijnen dat een beperkt expansiepotentieel vertoonde, suggereerde suboptimaal behoud van de stamheid. Hoewel onze organoïde-biobank momenteel alleen eierstokkankermonsters van sereuze histologie (HGSOC en LGSOC) bevat, vertoonde onze ervaring met monsters van verschillende epitheliale eierstokkankerhistologieën voorafgaand aan het gestructureerde biobanking-programma vergelijkbare slagingspercentages zonder specifieke verschillen. Met name de meerderheid van de subtypes van epitheliale eierstokkanker delen een vergelijkbare kolomvormige pseudogestratificeerde morfologie met weefsels die zich hebben ontwikkeld uit het Mulleriaan-kanaal (eileider, baarmoeder, baarmoederhals), terwijl daarentegen het eierstokepitheel zelf ontwikkelingsgericht afkomstig is van de genitale kam en mesonefros en bedekt is met een enkele laag kubusvormig epitheel. Aangezien ontwikkelingstrajecten die epitheliale homeostase reguleren een centrale rol spelen bij de controle van het potentieel van volwassen stamcellen, moet rekening worden gehouden met de verschillen in embryonale oorsprong bij het ontwikkelen van protocollen voor biobankieren van organoïden. Daarom zijn we van mening dat voorlopercellen van het oppervlak van de eierstok waarschijnlijk orgaanspecifieke kweekomstandigheden nodig hebben om een stabiele groei op lange termijn te ondersteunen.
Met name in ons laboratorium is het protocol ook succesvol gebleken voor post-neoadjuvante eierstokkankermonsters, hoewel de neoadjuvante chemotherapie de levensvatbaarheid van de cel en het weefselfenotype beïnvloedt. Deze monsters vertonen meer puin en extracellulaire weefselaggregaten in vergelijking met monsters die afkomstig zijn van chemotherapie-naïef weefsel van primaire debulking-operaties die het organoïdevormingspotentieel kunnen beïnvloeden. In deze gevallen hebben we ervaren dat een geschikte hoeveelheid chirurgisch weefsel en strikte naleving van de aanbevolen transportomstandigheden cruciaal zijn voor een succesvolle generatie van organoïden, aangezien de post-neoadjuvante monsters gevoeliger kunnen zijn.
Een zeer interessant fenomeen van het gunstige effect van korte expansie op plastic in 2D van vers geïsoleerde voorlopercellen op de daaropvolgende groei van organoïden, dat we herhaaldelijk hebben waargenomen en daarom hebben opgenomen in de gestandaardiseerde experimentele procedure, is een belangrijke aanvulling op de methodologie van het onderzoeksveld van kankerorganoïden, dat grotendeels afhankelijk is van directe zaaistrategieën. Het is verleidelijk om te speculeren dat de gevoeligheid van voorlopers na enzymatische vertering en het vermogen van groeifactoren om ze adequaat te primen, de onderliggende mechanismen achter dit verschil zouden kunnen zijn, wat in sommige gevallen een doorslaggevende factor is als de lijn kan worden vastgesteld. Er is echter meer onderzoek nodig om duidelijke afhankelijkheden vast te stellen.
Bij het aangaan van de uitdagingen die worden gesteld door hoge celadhesie en functionele verbindingen in 3D-eierstokkankerorganoïden, die moeilijk te verteren zijn, kan een combinatie van mechanische en enzymatische dissociatie met naald en spuit helpen wanneer er grote klonten overblijven na trypsinisatie. Experimenteren met verschillende enzymatische condities zou tot verdere verbeteringen kunnen leiden.
Na langdurige opslag kunnen organoïdelijnen worden ontdooid en volgens het experimentele ontwerp in cultuur worden gebracht en voor latere toepassingen worden gebruikt. Dit maakt het mogelijk om op elk moment toegang te krijgen tot reeds gegenereerde organoïdelijnen voor specifieke onderzoeksdoeleinden en is met name interessant voor het onderzoeken van het langetermijngedrag van bepaalde lijnen in het licht van de ziekteprogressie van de patiënt. Cryopreservatie van organoïden van eierstokkanker blijft echter een uitdaging. Temperatuurschommelingen tijdens vries- en dooicycli kunnen een negatieve invloed hebben op de levensvatbaarheid, functionaliteit en expansiemogelijkheden van organoïden. Langdurige opslag is stabieler in vloeibare stikstof, waar zeer lage temperaturen het risico op afbraak minimaliseren, zodat de integriteit van de organoïden kan worden behouden. Voortdurende optimalisatie is echter gerechtvaardigd om consistente procedures voor invriezen, opslag en ontdooien vast te stellen, om deze processen verder te verbeteren.
Ondanks de genoemde openstaande problemen, toont dit protocol het vermogen aan om consequent stabiele organoïdelijnen te genereren uit solide tumormonsters van patiënten met eierstokkanker. In ons laboratorium hebben we tot op heden 120 primaire weefselmonsters van eierstokkanker verwerkt, waarbij we in ongeveer 50% van de gevallen succes boekten, waaronder een breed scala aan histologische subtypes en stadia van de ziekte met primaire debulking, recidiverende ziekte en postneoadjuvante chirurgische monsters. Door een gestructureerd raamwerk te bieden voor het genereren van organoïden afgeleid van verschillende patiëntmonsters, parallel zaaien in verschillende media en implementatie van verschillende zaaistrategieën, biedt dit protocol de mogelijkheid om individuele verschillen in stampotentieel te beoordelen, waardoor aanvullende informatie wordt verstrekt over tumorbiologie. Voor zover wij weten, volgt de overgrote meerderheid van de onderzoeken meestal de omgekeerde benadering van het testen van de mediumcomponenten op een klein aantal monsters en het kiezen van voor eenvoud meestal één optimaal medium. Onze systematische tests van het effect van HER1ß, het effect van RSPO1- en FGF10-suppletie en 2D/3D-zaaien tonen onomstotelijk aan dat eierstokkankerweefsel een zekere mate van variabiliteit tussen patiënten heeft in stameigenschappen, en dat het optimale medium inderdaad patiëntspecifiek is. Daarom is het systematisch parallel testen van verschillende mediasamenstellingen die verschillende exogene paracriene signaleringsomgevingen bieden, essentieel.
Het opzetten van een levende biobank met een uitgebreid panel van organoïden afkomstig van verschillende eierstokkankerpatiënten, samen met hun prospectief verzamelde klinische informatie, dient als een waardevolle bron voor een breed scala aan onderzoekstoepassingen en weerspiegelt het heterogene klinische landschap dat mogelijk van toepassing is op een grotere patiëntenpopulatie17. Langdurige kweek en cryopreservatie maken experimentele consistentie en de herhaalde toegankelijkheid van dezelfde organoïdelijn in de loop van de tijd mogelijk, en dienen als basis voor longitudinale experimentele ontwerpen met ongewijzigde cellulaire eigenschappen van de tumorlijn.
Door epitheliale architectuur en polarisatie te behouden, zijn de organoïdelijnen een adequaat model om cel-celcommunicatie en contextafhankelijke besluitvorming over het lot van cellen te bestuderen, gemedieerd door paracriene signaalroutes. Het inbedden van de organoïden in de histologische gel is een praktische en efficiënte tussenstap om materiaalverlies na fixatie te voorkomen en zorgt ervoor dat de nabewerking (inbedding in paraffine en doorsnede) parallel met weefselmonsters kan worden uitgevoerd. Het verlies van organoïden tijdens de fixatieprocedure is een kritiek punt wanneer het aantal organoïden zeer beperkt is. Dit verlies kan echter worden tegengegaan door de organoïden grondig uit de extracellulaire matrix te verwijderen door ze te wassen in een koud basaalkweekmedium en door ten minste twee volgroeide putjes van een plaat met 24 putjes te poolen voordat ze worden gefixeerd. Het immunofluorescentiekleuringsprotocol maakt confocale beeldvorming met hoge resolutie mogelijk om moleculaire en fenotypische kenmerken van de eierstokkankerorganoïden te corresponderen met het ouderlijke tumorweefsel, maar is ook een waardevol hulpmiddel om de cellulaire respons op chemische verbindingen of karakterisering van genetisch gemodificeerde lijnen te bestuderen. De methode is ook geschikt voor histologiekleuring zonder specifieke aanpassingen. Afhankelijk van het doel van het onderzoek moeten dunnere secties worden overwogen die met een microtoom (2-3 μm) zijn gesneden.
Belangrijk is dat een stabiele langetermijnkweek een voorwaarde is voor experimenten met genbewerking en functionele tests over geneesmiddelrespons en resistentie tegen nieuwe en standaardtherapieën 17,21. Met name organoïden die zijn gegenereerd uit herbiopten die worden uitgevoerd tijdens ziekteprogressie en recidief, bieden de mogelijkheid voor directe vergelijkende analyses tussen de therapie-naïeve oorspronkelijke tumor en de nieuw verworven kenmerken die tijdens terugval worden waargenomen. Identificatie van patiëntspecifieke behandelingsreacties en de vorming van therapieresistentie in vitro bevorderen het gebied van precisiegeneeskunde in onderzoek naar eierstokkanker21.

De klinische behandeling van patiënten met epitheliale eierstokkanker blijft een uitdaging vanwege de heterogene klinische presentatie in een vergevorderd stadium en de hoge recidiefpercentages1. Om ons begrip van de ontwikkeling en het biologische gedrag van eierstokkanker te verbeteren, zijn onderzoeksbenaderingen nodig die zich richten op de patiëntspecifieke variabiliteit in de loop van de ziekte, de respons op de behandeling en histopathologische en moleculaire kenmerken.
Biobanking, gekenmerkt door het systematisch verzamelen en langdurig bewaren van tumormonsters afkomstig van patiënten met eierstokkanker, samen met hun klinische informatie, biedt het behoud van een groot patiëntencohort in verschillende ziektestadia, inclusief tumormonsters van primaire debulking-operaties, na neoadjuvante chemotherapie en van terugkerende ziekte. Het heeft een waardevol potentieel voor het bevorderen van kankeronderzoek en dient als een bron van veelbelovende prognostische biomarkers en therapeutische doelen3. Conventionele biobankmethoden, zoals formalinefixatie en bevriezing, zijn echter niet geschikt voor het uitvoeren van functionele studies op de oorspronkelijke tumormonsters vanwege het verlies van levensvatbaarheid en de verstoring van de oorspronkelijke driedimensionale weefselarchitectuur 4,5.
Studies van moleculaire mechanismen, in de oncologie en daarbuiten, zijn in belangrijke mate afhankelijk van het gebruik van geschikte experimentele modellen die de biologie van de ziekte getrouw weergeven en de in vitro waargenomen eigenschappen van het in vivo waargenomen weefsel behouden. Patiënt-afgeleide organoïden, gebaseerd op het behoud van het vernieuwingspotentieel, reproduceren in het laboratorium de oorspronkelijke structuur en functie van het epitheel en maken testen in een patiëntspecifieke context mogelijk. Daarom zijn ze naar voren gekomen als veelbelovende hulpmiddelen voor kankeronderzoek en gepersonaliseerde geneeskunde, waarbij de kloof tussen klinische diversiteit en laboratoriumonderzoek wordt overbrugd 6,7,8,9. Op maat gemaakte therapeutische strategieën op basis van individuele geneesmiddelresponsen van organoïdelijnen en het testen van de functionele relevantie van moleculaire profielen, kunnen mogelijk direct worden toegepast op patiëntenzorg10,11. De mogelijkheid van langdurige teelt, met inbegrip van patiëntspecifieke kenmerken en het verzamelen van relevante prospectieve klinische gegevens in de loop van de tijd, is veelbelovend voor het identificeren van nieuwe prognostische en voorspellende factoren die betrokken zijn bij ziekteprogressie en resistentiemechanismen 3,9.
Desalniettemin vereist het bouwen van een biobank met organoïden uit verschillende tumormonsters een combinatie van strikte naleving van complexe methodologie en het opzetten van protocollen voor eenvoudig onderhoud12. Processtandaardisatie zorgt ervoor dat de biobank efficiënt kan worden opgezet en onderhouden door opgeleid personeel, zelfs bij een hoog verloop, terwijl tegelijkertijd wordt voldaan aan de hoogste kwaliteitsnormen13. Verschillende studies rapporteerden de succesvolle generatie van stabiele organoïdelijnen voor eierstokkanker die overeenkomen met het mutatie- en fenotypische profiel van de oorspronkelijke tumor met verschillende efficiëntiepercentages. Toch blijft routinematig biobankieren in de praktijk een uitdaging, met name voor een stabiele groei van lijnen op lange termijn, wat een voorwaarde is voor grootschalige uitbreiding of succesvolle genomische bewerking.
Met name de kwestie van uitbreidbaarheid blijft vaag gedefinieerd in het veld, aangezien organoïden die een langzaam en beperkt groeipotentieel vertonen, af en toe als gevestigde lijnen worden geteld. Zoals aanvankelijk aangetoond door Hoffmann et al., een studie waarvan de belangrijkste bevindingen de basis vormden voor dit verder ontwikkelde protocol, vereist een optimale behandeling van eierstokkankerweefsel een unieke strategie om tegemoet te komen aan heterogeniteit14. Fenotypische karakterisering van de organoïden verkregen met deze methode en nauwe gelijkenis met ouderlijk tumorweefsel werden bevestigd door panel DNA-sequencing en transcriptomics-analyse van rijpe culturen (4-10 maanden cultivatie) die de stabiliteit van het model aantoonden 8,9,12,14.
In tegenstelling tot de paracriene omgeving die de homeostase in de gezonde eileiders reguleert, is de epitheellaag, die waarschijnlijk hooggradige sereuze eierstokkanker (HGSOC), kankerregeneratiepotentieel en organoïdevormingscapaciteit oplevert, minder afhankelijk van exogene Wnt-suppletie. Bovendien bleek actieve botmorfogenetische proteïne (BMP)-signalering, gekenmerkt door de afwezigheid van Noggin in organoïdemedium, gunstig te zijn voor de vestiging van langetermijnculturen van vaste weefselafzettingen van eierstokkanker14,15. Tijdens het systematisch biobankieren van vaste afzettingen van eierstokkanker hebben we deze bevindingen bevestigd en de pijplijn opgezet, met details die in dit protocol worden beschreven en dat in de meeste gevallen een duurzame uitbreiding op lange termijn garandeert. We vinden dat het parallel testen van verschillende mediasamenstellingen en zaaimodaliteiten bij het werken met primaire isolaten essentieel is om de totstandbrenging van stabiele organoïdelijnen op lange termijn te verbeteren en de opbrengst te verhogen, waardoor robuuste vermeerdering en uitbreiding naar multi-well-formaten mogelijk wordt die nodig zijn voor stroomafwaartse experimenten16.
Bovendien zijn de zuiverheid en kwaliteit van de monsters die tijdens de operatie worden verzameld van cruciaal belang voor het translationele potentieel van organoïden voor eierstokkanker in fundamenteel onderzoek en moleculaire diagnostiek. De complexiteit van de klinische presentatie van HGSOC vereist nauwe samenwerking tussen de chirurgen, oncologen en de wetenschappers in het laboratorium om ervoor te zorgen dat relevant materiaal correct wordt geïdentificeerd, de transportomstandigheden constant worden gehouden en organoïdelijnen worden gegenereerd met een hoge efficiëntie die de belangrijkste kenmerken van de ziekte van elke patiënt vertegenwoordigen. Dit protocol biedt een gestandaardiseerd maar aanpasbaar raamwerk om het volledige potentieel van eierstokkankerorganoïden vast te leggen, rekening houdend met de heterogeniteit die eierstokkanker kenmerkt16,17. Dit protocol maakt met name een betrouwbare biobank mogelijk van het brede spectrum van de klinische presentatie van eierstokkanker, inclusief verschillende histologische typen (hooggradige en laaggradige eierstokkanker, LGSOC), verschillende afzettingen van dezelfde patiënten die verschillen vertonen in stamregulatie, weefsels van operaties in post-neoadjuvante setting, biopsiemateriaal en monsters van operaties in de terugkerende fase van ziekteprogressie.

<table><tbody><tr><td>100 Sterican 26 G</td><td>Braun, Melsungen, Duitsland</td><td>4657683</td><td></td></tr><tr><td>100 Sterican 27 G</td><td>Braun, Melsungen, Duitsland</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>293T HA Rspo1-Fc</td><td>R&amp;D systems, Minneapolis, USA</td><td>3710-001-01</td><td>Alternatief: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111</td></tr><tr><td>A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV)</td><td>Merck, Darmstadt, Duitsland</td><td>616454</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12 Medium&nbsp;</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p53 antibody (DO1)</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA</td><td>sc-126</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PAX8 antibody</td><td>Proteintech, Manchester, UK&nbsp;</td><td>10336-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50x)</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Bottle-top vacuum filter 0.2 &micro;m</td><td>Corning, Berlin, Duitsland&nbsp;</td><td>430049</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2</td><td>Greiner Bio-one, Kremsm&uuml;nster, Oostenrijk</td><td>661175</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2</td><td>Greiner Bio-one, Kremsm&uuml;nster, Oostenrijk</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2</td><td>Greiner Bio-one, Kremsm&uuml;nster, Oostenrijk</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>Costar 48-well Clear TC-treated&nbsp;</td><td>Corning, Berlin, Duitsland&nbsp;</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>Cryo SFM</td><td>PromoCell &ndash; Human Centered Science, Heidelberg, Duitsland</td><td>C-29912</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear</td><td>R&amp;D systems, Minneapolis, USA</td><td>3533-005-02</td><td>Alternatief: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix&nbsp; Corning, 356231&nbsp;</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG</td><td>Jackson Immuno</td><td>715-175-151</td><td></td></tr><tr><td>DAKO&nbsp; Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen Retriever</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Duitsland</td><td>C9999-1000ML</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555</td><td>Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>A32794</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>A32814</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&acute;s Phosphate-Buffered Saline&nbsp;</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel</td><td>Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>Epredia HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24-well Polystyrene&nbsp;</td><td>Corning, Berlin, Duitsland&nbsp;</td><td>351447</td><td></td></tr><tr><td>Feather scalpel&nbsp;</td><td>Pfm medical, Keulen, Duitsland</td><td>200130010</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Formalin 37% acid free, stabilized</td><td>Morphisto, Offenbach am Main, Duitsland</td><td>1019205000</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>156630080</td><td></td></tr><tr><td>Human EpCAM/TROP-1 Antibody</td><td>R&amp;D systems, Minneapolis, USA</td><td>AF960</td><td></td></tr><tr><td>Human FGF10</td><td>Peprotech, NJ, USA</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Human recombinant BMP2</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>PHC7146</td><td></td></tr><tr><td>Human recombinant EGF</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>PHG0311L</td><td></td></tr><tr><td>Human recombinant Heregulin beta-1</td><td>Peprotech, NJ, USA</td><td>100-03</td><td></td></tr><tr><td>LAS X core Software</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/</td></tr><tr><td>Leica TCS SP8 X&nbsp;White Light Laser Confocal Microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100x)</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Duitsland</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Omnifix 1 mL</td><td>Braun, Melsungen, Duitsland</td><td>3570519</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Omnilab, München, Duitsland</td><td>5170002</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd&nbsp;</td><td>Morphisto, Offenbach am Main, Duitsland</td><td>1176201000</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Duitsland</td><td>P4333-100</td><td></td></tr><tr><td>PluriStrainer 400 &micro;m</td><td>PluriSelect, Leipzig, Duitsland</td><td>43-50400-01</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen, Toulouse, Frankrijk</td><td>ant-pm-05</td><td></td></tr><tr><td>Red Blood Cell Lysing Buffer</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Duitsland</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>Roticlear</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Duitsland</td><td>A538.5</td><td></td></tr><tr><td>Surgipath Paraplast</td><td>Leica, Wetzlar, Duitsland</td><td>39602012</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nunc Cryovials</td><td>Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>375418PK</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Duitsland</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Duitsland</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme&nbsp;</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>PanReac AppliChem, Darmstadt, Duitsland</td><td>A4974-0100</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632

strategie voor biobanking van organoïden van eierstokkanker: aanpak van de heterogeniteit tussen patiënten tussen histologische subtypes en ziektestadia

Strategy for Biobanking of Ovarian Cancer Organoids: Addressing the Interpatient Heterogeneity across Histological Subtypes and Disease Stages

Hoewel de oprichting van een biobank voor eierstokkanker op basis van van patiënten afgeleide organoïden samen met hun klinische achtergrondinformatie vooruitgang in onderzoek en patiëntenzorg belooft, blijft standaardisatie een uitdaging vanwege de heterogeniteit van deze dodelijke maligniteit, gecombineerd met de inherente complexiteit van organoïdetechnologie. Dit aanpasbare protocol biedt een systematisch kader om het volledige potentieel van organoïden voor eierstokkanker te realiseren, rekening houdend met een patiëntspecifieke variabiliteit van voorlopercellen. Door een gestructureerde experimentele workflow te implementeren om optimale kweekomstandigheden en zaaimethoden te selecteren, met parallelle tests van direct 3D-zaaien versus een 2D/3D-route, verkrijgen we in de meeste gevallen robuuste uitbreidingslijnen voor de lange termijn die geschikt zijn voor een breed scala aan stroomafwaartse toepassingen. 
Het protocol is met name getest en efficiënt gebleken in een groot aantal gevallen (N = 120) van zeer heterogeen uitgangsmateriaal, waaronder hooggradige en laaggradige eierstokkanker en stadia van de ziekte met primaire debulking, recidiverende ziekte en post-neoadjuvante chirurgische monsters. Binnen een exogene signaalomgeving met een laag Wnt en een hoge BMP zagen we dat voorlopercellen verschillend gevoelig waren voor de activering van de Heregulin 1 ß (HERß-1)-route, waarbij HERß-1 bij sommigen de vorming van organoïden bevorderde en bij anderen remde. Voor een subset van de monsters van de patiënt vereisen optimale organoïdevorming en groei op lange termijn de toevoeging van fibroblastgroeifactor 10 en R-Spondin 1 aan het medium. 
Verder belichten we de cruciale stappen van weefselvertering en isolatie van voorlopercellen en wijzen we op voorbeelden waarbij korte kweek in 2D op plastic gunstig is voor de daaropvolgende vorming van organoïden in de Basement Membrane Extract type 2-matrix. Over het algemeen vereist een optimale biobanking het systematisch testen van alle belangrijke voorwaarden parallel om een geschikte groeiomgeving voor individuele lijnen te identificeren. Het protocol beschrijft ook de hanteringsprocedure voor efficiënte inbedding, doorsnede en kleuring om afbeeldingen met hoge resolutie van organoïden te verkrijgen, wat nodig is voor uitgebreide fenotypering.

Na de eerste weefseldissociatie, filtratie en telling worden cellen parallel direct in 3D-formaat gezaaid, zoals hierboven uitgelegd, evenals de suspensie in de kolf voor korte 2D-expansie. In sommige gevallen heeft de voorbijgaande 2D-expansie een positieve invloed op de organoïdevorming en wordt de langetermijnlijn via deze route met succes tot stand gebracht, terwijl vergelijkende parallelle 3D-zaaiing kan leiden tot groeistilstand (Figuur 1). Voor elk donorweefsel dat wordt verwerkt, worden de cellen getest volgens de mediamatrix. In navolging van deze strategie bevat onze biobank nu lijnen die representatief zijn voor elke standaard groeiconditie, zoals weergegeven in figuur 2. Door strikte implementatie van dit mini-screeningplatform voor het testen van verschillende media en manieren van zaaien, hebben we met succes organoïdelijnen gegenereerd van verschillende histologische typen en stadia van ziekteontwikkeling van eierstokkanker (Figuur 3) van primaire hooggradige sereuze, post-neoadjuvante intervaloperaties en van recidiverende ziekte. Fenotypische karakterisering van de organoïdelijnen door immunofluorescentiekleuring van hoofdmarkers in vergelijking met ouderweefsel toont overtuigend aan dat kenmerken van het epitheliale tumorcompartiment behouden blijven in het organoïdemodel: epitheliale architectuur en adhesie gemarkeerd door (EpCAM), afstammingsidentiteit (PAX8) en typische TP53-puntmutatie die kenmerkend is voor HGSOC die leidt tot accumulatie in de kern (Figuur 4).
Er moet ook rekening worden gehouden met enkele belangrijke methodologische punten voor een efficiënte besluitvorming tijdens organoïde-biobanking. Het groeipotentieel van organoïden wordt niet alleen bepaald door de toename van de organoïdediameter. Bovendien bepalen fenotypische kenmerken expansiepotentiaal zoals kleur, duisternis en contourintegriteit. De vorming van cytoplasmatische stressvacuolen duidt op suboptimale omstandigheden. Aanvankelijke problemen met betrekking tot groei en organoïdevormingspotentieel kunnen optreden als gevolg van ongeschikte transportomstandigheden en vertraging van weefselprocessie. Aangezien er een hoge interindividuele variabiliteit in expansiepotentiaal wordt waargenomen binnen de tumorlijnen, raden we aan om ten minste 14 dagen te wachten voordat u een definitieve beslissing neemt over het groeipotentieel. Als in eerste instantie vergelijkbare groeipatronen worden waargenomen in verschillende media, moeten meerdere aandoeningen worden uitgebreid. Uit onze ervaring blijkt dat een duidelijk onderscheid tussen stabiel groeipotentieel op lange termijn vaak pas mogelijk is na een teelt van enkele weken of maanden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66467/66467fig01.jpg"> Figuur 1: Voordelen van kort zaaien in 2D van primaire isolaten voor latere organoïdegeneratie. (A) Schema van de experimentele lay-out met een tweerichtingsstrategie voor parallel zaaien: 2D/3D en direct 3D-zaaien in vier verschillende media. (B) Beeld van aanhangende primaire isolaten vóór trypsinisatie en 3D-overdracht. (C) Een voorbeeld van de primaire afzetting waarbij parallel zaaien het duidelijke voordeel van de 2D/3D-route aan het licht bracht, aangezien expansie van organoïden op lange termijn alleen mogelijk was met voorlopercellen die aanvankelijk op plastic waren geïsoleerd. De afbeelding linksboven toont een 3D-cultuur 7 dagen na isolatie bij passage 0 (aangeduid als P0) met onvoldoende organoïdevorming na de eerste passage (aangeduid als P1) op de afbeelding linksonder. Na 2D-zaaien op plastic (zie figuur 1B) gevolgd door overdracht naar een 3D-cultuur, is een betere organoïdevorming al zichtbaar bij P0, terwijl het expansiepotentieel op lange termijn wordt bevestigd bij passage 4 (P4). Schaalbalk = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66467/66467fig02.jpg"> Figuur 2: Patiëntspecifieke mediumbehoefte. Voorbeelden van vier verschillende stabiele expansielijnen op lange termijn, elk in een ander medium. Schaalbalk = 500 μm. Afkortingen: OCM = ovarian cancer medium; her = heregulin 1β; HGSO = hooggradige sereuze eierstokkanker. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66467/66467fig03.jpg"> Figuur 3: Organoïdevorming uit alle stadia van de ziekte. Beelden van stabiele expansielijnen op lange termijn, van hooggradige sereuze en laaggradige sereuze eierstokkanker in primaire ziektepresentatie, van intervalchirurgie (postneoadjuvante chemotherapie) en van recidiverend kankerweefsel. Schaalbalk = 500 μm. Afkortingen: HGSOC = hooggradige sereuze eierstokkanker; LGSOC = laaggradige sereuze eierstokkanker; NACT = neoadjuvante chemotherapie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66467/66467fig04.jpg"> Figuur 4: Nauwe overeenkomst tussen het fenotype van organoïden en ouderlijk kankerweefsel. Confocale beelden van immunofluorescentiekleuring van (A) kankerweefsel en (B) gepaarde organoïdelijn vertonen een zeer hoge gelijkenis in kleuringspatroon en expressieniveau van alle markers, EpCAM (groen), PAX8 (rood), TP53 (magenta). Schaalbalk = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Tabel 1: Samenstelling van het medium en het digestiemengsel dat in dit protocol wordt gebruikt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467_Table%201.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>

Dit protocol biedt een systematisch kader voor de oprichting van organoïden van eierstokkanker uit verschillende ziektestadia en pakt de uitdagingen van patiëntspecifieke variabiliteit aan om de opbrengst te verhogen en robuuste uitbreiding op lange termijn mogelijk te maken voor volgende toepassingen. Het bevat gedetailleerde stappen voor weefselverwerking, zaaien, het aanpassen van mediavereisten en immunofluorescentiekleuring.

Strategie voor biobanking van organoïden van eierstokkanker: aanpak van de heterogeniteit tussen patiënten tussen histologische subtypes en ziektestadia

While the establishment of an ovarian cancer biobank from patient-derived organoids along with their clinical background information promises advances in ...

De beste klinische behandeling in baanbrekend translationeel onderzoek voor patiënten met gevorderde eierstokkanker heeft de hoogste prioriteit bij onze instelling. Met het biobankieren van organoïden van patiënten hebben we grote vooruitgang geboekt in de richting van individueel op maat gemaakt management. Dit stelt ons in staat om patiëntspecifieke kenmerken te evalueren en voorspellende biomarkers te identificeren.We hebben de afgelopen jaren aanzienlijke vooruitgang geboekt bij het verbeteren van radicale multiviscerale chirurgie, chemotherapie, anti-angiogene therapie en ook PARP-remmertherapie bij patiënten met gevorderde eierstokkanker en verbeterde zelfs daarmee de overlevingskansen. De volgende grote stap zou zijn om beter te voorspellen welke patiënt baat zou hebben bij welke specifieke behandeling. Momenteel zijn klinische behandelingsbeslissingen gebaseerd op algemene histopathologische kenmerken en op informatie over homologe aanbevelingsdeficiëntie of getest in in paraffine ingebed tumorweefsel.Biologische modellen die specifieke reacties op chemotherapie en op gerichte behandelingen evalueren, zijn nog niet geïmplementeerd in de klinische routine. We hebben de belangrijkste kenmerken van eierstokkankerweefsel geïdentificeerd, met name de kweekvereisten die nodig zijn om het vernieuwingspotentieel in vitro te behouden, en gebruiken deze kennis om een robuuste groei van organoïdelijnen op lange termijn te bereiken en een biobank op te zetten uit monsters in verschillende stadia van de ziekte. Onze dagelijkse ervaring met biobanking van organoïden van eierstokkanker toont effectief een opmerkelijke heterogeniteit in de biologie van deze maligniteit, die de weg zou kunnen effenen voor nieuwe classificatie of de basis zou kunnen vormen voor nieuwe therapeutische oplossingen die gericht zijn op het potentieel van STEMI.

strategy-for-biobanking-ovarian-cancer-organoids-addressing

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Heterotypische Driedimensionale<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellering van Stroma-epitheliale interacties tijdens eierstokkanker initiatie en progressie

Patiënt-afgeleide organoïden (BOB's) zijn een krachtig hulpmiddel in translationeel kankeronderzoek, dat zowel de genetische als fenotypische heterogeniteit van de ziekte en de reactie op gepersonaliseerde antikankertherapieën weerspiegelt. Hier wordt een geconsolideerd protocol voor het genereren van pdo's voor primaire blaaskanker bij de mens ter voorbereiding op de evaluatie van fenotypische analyses en medicijnresponsen gedetailleerd beschreven.

Cultuur van blaaskanker organoïden als precisie geneeskunde tools

Biobanken zijn cruciale bronnen voor biomedisch onderzoek en de Biobank for Translational and Digital Medicine Unit van het European Institute of Oncology is een model op dit gebied. Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van de standaard operationele procedures van biobanken voor het beheer van verschillende soorten menselijke biologische monsters.

Biobank voor translationele geneeskunde: standaard operationele procedures voor optimaal monsterbeheer

Patiënt-afgeleide organoïden (BOB) zijn een driedimensionale (3D) cultuur die de tumoromgeving in vitro kan nabootsen. Bij hooggradige sereuze eierstokkanker vertegenwoordigen BOB's een model om nieuwe biomarkers en therapieën te bestuderen.

Generatie en kweek van hoogwaardige sereuze eierstokkankerpatiënt-afgeleide organoïden

Het huidige protocol beschrijft methoden voor het evalueren van DNA-schadehersteleiwitten in van patiënten afgeleide eierstokkankerorganoïden. Hier zijn uitgebreide plating- en kleuringsmethoden opgenomen, evenals gedetailleerde, objectieve kwantificeringsprocedures.

Het visualiseren van DNA-schadehersteleiwitten in patiënt-afgeleide eierstokkanker organoïden via immunofluorescentietests

Een gedetailleerd protocol wordt hier verstrekt voor het vaststellen van menselijke borstorganoïden uit van de patiënt afgeleide borsttumorresecties of normaal borstweefsel. Het protocol biedt uitgebreide stapsgewijze instructies voor het kweken, bevriezen en ontdooien van menselijke patiënten afgeleide borstorganoïden.

Oprichting en kweek van van de patiënt afgeleide borstorganoïden

We presenteren een protocol dat kan worden gebruikt om therapeutische geneesmiddelentests uit te voeren met van patiënten afkomstige eierstokkankerorganoïden.

Eierstokkanker Patiënt-afgeleide organoïdemodellen voor preklinische geneesmiddelentests

Tumororganoïden hebben een revolutie teweeggebracht in kankeronderzoek en de benadering van gepersonaliseerde geneeskunde. Ze vertegenwoordigen een klinisch relevant tumormodel waarmee onderzoekers de tumor in de kliniek een stap voor kunnen blijven. Dit protocol stelt tumororganoïden vast uit verse weefselmonsters van pancreastumoren en van patiënten afgeleide xenotransplantaten van pancreasadenocarcinoomoorsprong.

Oprichting van van alvleesklierkanker afgeleide tumororganoïden en fibroblasten uit vers weefsel

Dit protocol beschrijft een methode om het verzamelen van monsters van radicale prostatectomiemonsters te vergemakkelijken. Het doel is om weefselmonsters van de monsters in kaart te brengen, te karakteriseren en micro-macro te ontleden op basis van anatomopathologische criteria voordat ze in een biobank worden opgeslagen.

Verbetering van de betrouwbaarheid van biobanking van prostaattumoren met verbeterde bemonsteringstechniek en histologische karakterisering

Dit protocol beschrijft het maken van driedimensionale (3D) weefselorganoïden uit primaire menselijke ovariumoppervlakte-epitheel (hOSE) cellen. Het protocol omvat isolatie van hOSE uit vers verzamelde eierstokken, cellulaire expansie van de hOSE, cryopreservatie-ontdooiprocedures en organoïde-afleiding. Immunofluorescentie, kwantitatieve analyse en het demonstreren van het nut als screeningplatform zijn inbegrepen.

Menselijke ovariële oppervlakte-epitheel organoïden als een platform om weefselregeneratie te bestuderen

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van hooggradig sereus ovariumcarcinoom (HGSOC) muismodellen in vitro en in vivo. Van de afleiding van muizen eileiderorganoïden, hun genetische modificatie om menselijke HGSOC-genetica samen te vatten, en hun introductie in de eierstokslijmbeurs van syngene muizen voor in vivo ontwikkeling van tumoren.

Ontwikkeling van van muizen afgeleide organoïdelijnen van eileiderepitheelcellen voor modellering van hooggradig sereus ovariumcarcinoom

Leer een systematische methode voor biobanking van eierstokkanker-organoïden uit verschillende ziektestadia. Dit protocol behandelt patiëntspecifieke variabiliteit en verbetert de opbrengst voor langdurige expansie.

Strategie voor biobanking van organoïden van eierstokkanker: aanpak van de heterogeniteit tussen patiënten tussen histologische subtypes en ziektestadia (Video) | JoVE Journal

Strategie voor biobanking van organoïden van eierstokkanker: aanpak van de heterogeniteit tussen patiënten tussen histologische subtypes en ziektestadia

Meer video's verkennen