High-speed atomaire krachtmicroscopie beeldvorming van DNA driepunts-stermotief zelfassemblage met behulp van fotothermisch off-resonantie tappen

In ons laboratorium ontwikkelen we nieuwe meettechnologieën voor biologie op nanoschaal. In het bijzonder richten we ons op de ontwikkeling van hogesnelheidsatoomkrachtmicroscopie om dynamische biologische processen op nanometerschaal te bestuderen. En hiervoor hebben we onlangs een nieuwe beeldvormingsmodus ontwikkeld, die we Photothermal Off Resonance Tap of PORT noemen.

In deze modus gebruiken we een speciale aandrijflaser om de uitkragingen zeer gecontroleerd met hoge snelheid te bedienen, waardoor we de gegevens en tot twee ordes van grootte sneller kunnen krijgen dan bij conventioneel off-resonantie tappen. De gouden standaard in hoge snelheid AFM is resonante modus beeldvorming. In deze modus wordt de cantilever bediend met deze resonantiefrequentie, wat betekent dat de cantileverpositie niet kan worden gecontroleerd, alleen de oscillatieamplitude.

Voor AFM met normale snelheid komen off-resonantiemodi steeds vaker voor. De bedieningsfrequentie is hier echter beperkt, waardoor deze beeldvormingsmodus vrij traag is. Door een secundaire laser te gebruiken om de cantilever te bedienen, kunnen we hogere bedieningsfrequenties bereiken, wat hogere beeldsnelheden betekent.

Deze aanpak stelt ons in staat om de voordelen van andere off-resonance personeelsmodi te behouden, wat betekent dat we de balans tussen beeldgevoeligheid en snelheid kunnen optimaliseren. We worden in de beeldsnelheid beperkt door het hoogste portret. Als we het portret willen vergroten, moeten we het laservermogen vergroten om dezelfde actuatieamplitude te behouden.

Dit kan leiden tot een slechte krachtbeheersing en schade aan het monster. Door de bandbreedte van de uitkragingen te vergroten door ze te verkleinen en door de efficiëntie van de laserabsorptie te verbeteren, kunnen we hogere poortsnelheden bereiken en tegelijkertijd zorgen voor voldoende monsterklaring. Deze vooruitgang zal snellere beeldvormingssnelheden mogelijk maken, wat cruciaal is voor het onderzoeken van de fijne kneepjes van de assemblagedynamiek.

Maak om te beginnen de uitkragingen schoon en bereid ze voor. Monteer uitkragingen op een houder die compatibel is met het scanning-elektronenmicroscopie- of SEM-systeem. Verwarm vervolgens het precursorgas dat op het gasinjectiesysteem moet worden gebruikt om de nieuwe tip te laten groeien.

Zodra het vacuüm onder de 10 komt tot de macht van min vijf millibar, ontlucht u de gasinjectieleiding 10 keer gedurende twee seconden om eventuele resterende lucht uit de mondstukleiding te verwijderen. Gebruik de SEM om het uiteinde van de uitkraging te lokaliseren. Kantel de houder in een hoek om de cantilever correct uit te lijnen voor beeldvorming met atoomkrachtmicroscopie.

Pas de positie en focus van de SEM aan voor een duidelijk zicht op de punt van de cantilever waar de carbon nano-tip zal worden gekweekt. Stel vervolgens de afzettingsparameters in de software in om de nieuwe punt te laten groeien. Start het afzettingsproces om de punt te laten groeien met een straling van de elektronenbundel op de uitkragende punt tijdens het injecteren van het precursorgas en stop de gasinjectie zodra de afzetting is voltooid.

Voer SEM-beeldvorming na de groei uit om de kwaliteit en kenmerken van de nieuw gegroeide punt te beoordelen, inclusief de straal en lengte. Verwijder de houder uit de SEM-kamer. Bereid om te beginnen een atoomkrachtmicroscoop met hoge snelheid voor.

Gebruik een pincet om een ultrakorte cantilever onder de veerclip op de cantileverhouder te plaatsen. Voeg met een spuit 50 microliter vloeistof toe via de linker vloeistoftoegangspoort. Gebruik vervolgens drie knoppen op de AFM-kop om de uitleeslaser op de cantilever uit te lijnen.

Observeer de schaduw van de uitkraging op een wit papier terwijl u de som maximaliseert. Centreer vervolgens de laserspot op de fotodiode met behulp van de twee speciale knoppen. Vink vervolgens het vakje aan voor excitatie ingeschakeld in excitatie VI om de aandrijflaser in te schakelen en uit te lijnen, waarbij u de cantilever bedient en oscilleert.

Geef de cantilever-excitatie- en afbuigingssignalen weer op een oscilloscoop. Gebruik de schaduwmethode en maximaliseer de oscillatieamplitude met de instelknoppen van de aandrijflaser. Om de amplitude van de cantileveroscillatie in de poort aan te passen, voegt u een gelijkstroom toe aan het laserdiodebesturingscircuit in het configuratievak in excitatie VI en voert u de piek-tot-piek AC-ingang in voor het laserdiodebesturingscircuit.

Als u interactiecurven wilt verkrijgen, stelt u de Z-controller VI in op de contactmodus en klikt u op Start om het monsteroppervlak te benaderen. Zodra het oppervlak is bereikt, voert u een kracht-tot-afstandscurve uit in helling VI voor kalibratie van de doorbuigingsgevoeligheid van de cantilever. Klik op terugtrekken om de Z-piëzo terug te trekken van het oppervlak waar de punt niet bij kan.

Schakel na volledige intrekking over naar de poortmodus in de Z-controller VI en schakel de excitatielaser in excitation VI in.Stel de poortmodus in op de gewenste frequentie. Duidelijke interactiecurven werden verkregen door vrije oscillatie af te trekken van contactoscillatie die cruciaal is voor niet-destructieve beeldvorming van biomonsters. Bij een poortsnelheid van 100 kilohertz werd een goede beeldkwaliteit bereikt.

Toen de excitatiefrequentie echter de cantileverresonantie naderde, verslechterde de feedbackcontrole, wat leidde tot verduisterde interactiecurven en een verslechterde beeldkwaliteit. Bereid om te beginnen een 10 millimolaire oplossing van magnesiumacetaat. Injecteer met een Hamilton-spuit 50 microliter van de oplossing in het vloeistofkanaal van de cantileverhouder, waardoor een druppel vloeistof ontstaat die de cantilever omhult.

Stel de scangrootte in de scan VI in op 800 bij 800 nanometer en de lijnsnelheid op 100 hertz. Als u het oppervlak wilt scannen, klikt u op de kaderpijl om de kwaliteit te controleren. Klik na het scannen op terugtrekken in de Z-controller VI om de cantilever van het oppervlak in te trekken.

Verwijder met een Hamilton-spuit de bufferoplossing uit de vrijdragende houder. Bereid vervolgens een verdunde DNA-driepuntssteroplossing voor en injecteer 50 microliter van deze oplossing in de vrijdragende houder. Voer beeldvorming uit met een gebied van 800 bij 800 nanometer met een standaardlijnsnelheid van 100 hertz.

Pas na de eerste scan de beeldgrootte en -snelheid aan en scan VI naar de gespecificeerde waarden voor verdere gegevensverzameling Houd de invoer voor het instelpunt in de Z-controller VI-instelvak op het laagste niveau dat nodig is voor nauwkeurige tracking tijdens het beeldvormingsproces. Herhaal dit voor alle vereiste monstergebieden. Met behulp van dit protocol werd de realtime assemblage van DNA driepunts stermotieven in stabiele eilanden waargenomen door hogesnelheidspoort AFM.

Er werden duidelijke beelden verkregen bij lijnsnelheden van 100 en 200 hertz voor een haventarief van 100 kilohertz. Hogere beeldsnelheden zonder hogere poortsnelheden verminderden echter de beeldkwaliteit als gevolg van snelle veranderingen in de topografie. Beeldvormingsresultaten van DNA-driepuntsster voor de laagste piek-tot-piek AC-input toonden intacte structuren, terwijl de hoogste piek-tot-piek AC-invoer resulteerde in waarneembare monsterschade als gevolg van hogere krachten.

Evenzo onthulde de laagste DC-offset-ingang intacte structuren, terwijl de hoogste DC-offset-ingang structurele schade veroorzaakte.