Name: Modelleren van gezonde en dysbiotische vaginale micro-omgevingen in een menselijke vagina-op-een-chip (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-16T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Leer hoe je een vagina-op-een-chip ontwikkelt voor het bestuderen van menselijke vaginale microbiële interacties onder microaerofiele omstandigheden. Dit model ondersteunt spontane differentiatie van epitheel en co-cultuur met microbiële gemeenschappen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gesponsord door financiering van de Bill and Melinda Gates Foundation (INV-035977) en het Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering aan de Harvard University. We danken ook Gwenn E. Merry, Wyss Institute, voor het redigeren van dit manuscript. Het diagram in figuur 1 is gemaakt met BioRender.

Microfluïdische vaginachip voor het bestuderen van het vaginale microbioom

<ol><li>Smith, S. B., Ravel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vaginal+microbiota%2C+host+defence+and+reproductive+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The vaginal microbiota, host defence and reproductive physiology.</a> J Physiol. 595 (2), 451-463 (2017).</li>
<li>Van De Wijgert, J., Jespers, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+health+impact+of+vaginal+dysbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The global health impact of vaginal dysbiosis.</a> Res Microbiol. 168 (9-10), 859-864 (2017).</li>
<li>Ralph, S. G., Rutherford, A. J., Wilson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+bacterial+vaginosis+on+conception+and+miscarriage+in+the+first+trimester%3A+Cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Influence of bacterial vaginosis on conception and miscarriage in the first trimester: Cohort study.</a> BMJ. 319 (7204), 220-223 (1999).</li>
<li>Goldenberg, R. L., Hauth, J. C., Andrews, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrauterine+infection+and+preterm+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Intrauterine infection and preterm delivery.</a> N Engl J Med. 342 (20), 1500-1507 (2000).</li>
<li>Han, Y., Liu, Z., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+vaginal+microbiota+dysbiosis+in+gynecological+diseases+and+the+potential+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Role of vaginal microbiota dysbiosis in gynecological diseases and the potential interventions.</a> Front Microbiol. 12, 643422(2021).</li>
<li>Leitich, H., Kiss, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymptomatic+bacterial+vaginosis+and+intermediate+flora+as+risk+factors+for+adverse+pregnancy+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Pract+Res+Clin+Obstet+Gynaecol%22%5BJournal%5D)">Asymptomatic bacterial vaginosis and intermediate flora as risk factors for adverse pregnancy outcome.</a> Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 21 (3), 375-390 (2007).</li>
<li>Torcia, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+among+vaginal+microbiome%2C+immune+response+and+sexually+transmitted+viral+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Interplay among vaginal microbiome, immune response and sexually transmitted viral infections.</a> Int J Mol Sci. 20 (2), 266(2019).</li>
<li>Van Oostrum, N., De Sutter, P., Meys, J., Verstraelen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risks+associated+with+bacterial+vaginosis+in+infertility+patients%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Risks associated with bacterial vaginosis in infertility patients: A systematic review and meta-analysis.</a> Hum Reprod. 28 (7), 1809-1815 (2013).</li>
<li>Lewis, F. M. T., Bernstein, K. T., Aral, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaginal+microbiome+and+its+relationship+to+behavior%2C+sexual+health%2C+and+sexually+transmitted+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Obstet+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Vaginal microbiome and its relationship to behavior, sexual health, and sexually transmitted diseases.</a> Obstet Gynecol. 129 (4), 643-654 (2017).</li>
<li>Hong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+between+vaginal+microbiota+and+female+infertility%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Gynecol+Obstet%22%5BJournal%5D)">The association between vaginal microbiota and female infertility: A systematic review and meta-analysis.</a> Arch Gynecol Obstet. 302 (3), 569-578 (2020).</li>
<li>Peelen, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+the+vaginal+microbiota+on+preterm+birth%3A+A+systematic+review+and+recommendations+for+a+minimum+dataset+for+future+research%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">The influence of the vaginal microbiota on preterm birth: A systematic review and recommendations for a minimum dataset for future research.</a> Placenta. 79, 30-39 (2019).</li>
<li>Smith, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcomes+in+prevention+and+management+of+miscarriage+trials%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22BJOG%22%5BJournal%5D)">Outcomes in prevention and management of miscarriage trials: A systematic review.</a> BJOG. 126 (2), 176-189 (2019).</li>
<li>Harp, D. F., Chowdhury, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trichomoniasis%3A+Evaluation+to+execution%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Obstet+Gynecol+Reprod+Biol%22%5BJournal%5D)">Trichomoniasis: Evaluation to execution.</a> Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 157 (1), 3-9 (2011).</li>
<li>Pastorek, J. G., Cotch, M. F., Martin, D. H., Eschenbach, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+microbiological+correlates+of+vaginal+trichomoniasis+during+pregnancy.+The+vaginal+infections+and+prematurity+study+group%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Clinical and microbiological correlates of vaginal trichomoniasis during pregnancy. The vaginal infections and prematurity study group.</a> Clin Infect Dis. 23 (5), 1075-1080 (1996).</li>
<li>Petrin, D., Delgaty, K., Bhatt, R., Garber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+microbiological+aspects+of+trichomonas+vaginalis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Clinical and microbiological aspects of trichomonas vaginalis.</a> Clin Microbiol Rev. 11 (2), 300-317 (1998).</li>
<li>Edwards, T., Burke, P., Smalley, H., Hobbs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trichomonas+vaginalis%3A+Clinical+relevance%2C+pathogenicity+and+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Trichomonas vaginalis: Clinical relevance, pathogenicity and diagnosis.</a> Crit Rev Microbiol. 42 (3), 406-417 (2016).</li>
<li>Eade, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+bacterial+vaginosis-associated+pathogens+using+a+comprehensive+cervical-vaginal+epithelial+coculture+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of bacterial vaginosis-associated pathogens using a comprehensive cervical-vaginal epithelial coculture assay.</a> PLoS One. 7 (11), e50106(2012).</li>
<li>Fichorova, R. N., Yamamoto, H. S., Delaney, M. L., Onderdonk, A. B., Doncel, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+vaginal+microflora+colonization+model+providing+new+insight+into+microbicide+mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Novel vaginal microflora colonization model providing new insight into microbicide mechanism of action.</a> mBio. 2 (6), e00168(2011).</li>
<li>Herbst-Kralovetz, M. M., Pyles, R. B., Ratner, A. J., Sycuro, L. K., Mitchell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+systems+for+studying+intercellular+interactions+in+bacterial+vaginosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">New systems for studying intercellular interactions in bacterial vaginosis.</a> J Infect Dis. 214, S6-S13 (2016).</li>
<li>Johnson, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+susceptibility+of+three+species+of+primate+to+vaginal+colonization+with+gardnerella+vaginalis%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">A study of the susceptibility of three species of primate to vaginal colonization with gardnerella vaginalis.</a> Br J Exp Pathol. 65 (3), 389-396 (1984).</li>
<li>Yildirim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primate+vaginal+microbiomes+exhibit+species+specificity+without+universal+lactobacillus+dominance%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Primate vaginal microbiomes exhibit species specificity without universal lactobacillus dominance.</a> ISME J. 8 (12), 2431-2444 (2014).</li>
<li>Edwards, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+models+of+the+cervicovaginal+epithelia+to+study+host-microbiome+interactions+and+sexually+transmitted+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Pathog+Dis%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional models of the cervicovaginal epithelia to study host-microbiome interactions and sexually transmitted infections.</a> Pathog Dis. 80 (1), 026(2022).</li>
<li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+2D+and+3D+HSV-2+infection+model+using+human+normal+vaginal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Ex vivo 2D and 3D HSV-2 infection model using human normal vaginal epithelial cells.</a> Oncotarget. 8 (9), 15267-15282 (2017).</li>
<li>Barrila, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+host-pathogen+interactions+in+the+context+of+the+microenvironment%3A+Three-dimensional+cell+culture+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Modeling host-pathogen interactions in the context of the microenvironment: Three-dimensional cell culture comes of age.</a> Infect Immun. 86 (11), e00282(2018).</li>
<li>Bein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organ-on-a-chip+models+of+human+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (4), 659-668 (2018).</li>
<li>Jalili-Firoozinezhad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+human+gut+microbiome+cultured+in+an+anaerobic+intestine-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip.</a> Nat Biomed Eng. 3 (7), 520-531 (2019).</li>
<li>Valiei, A., Aminian-Dehkordi, J., Mofrad, M. R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-on-a-chip+models+for+dissecting+the+gut+microbiology+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Gut-on-a-chip models for dissecting the gut microbiology and physiology.</a> APL Bioeng. 7 (1), 011502(2023).</li>
<li>Izadifar, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucus+production%2C+host-microbiome+interactions%2C+hormone+sensitivity%2C+and+innate+immune+responses+modeled+in+human+endo-+and+ecto-cervix+chips%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Mucus production, host-microbiome interactions, hormone sensitivity, and innate immune responses modeled in human endo- and ecto-cervix chips.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Mahajan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaginal+microbiome-host+interactions+modeled+in+a+human+vagina-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Vaginal microbiome-host interactions modeled in a human vagina-on-a-chip.</a> Microbiome. 10 (1), 201(2022).</li>
<li>Masson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cytokine+biomarkers+to+identify+women+with+asymptomatic+sexually+transmitted+infections+and+bacterial+vaginosis+who+are+at+high+risk+of+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Sex+Transm+Infect%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cytokine biomarkers to identify women with asymptomatic sexually transmitted infections and bacterial vaginosis who are at high risk of HIV infection.</a> Sex Transm Infect. 92 (3), 186-193 (2016).</li>
<li>Amsel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonspecific+vaginitis.+Diagnostic+criteria+and+microbial+and+epidemiologic+associations%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med%22%5BJournal%5D)">Nonspecific vaginitis. Diagnostic criteria and microbial and epidemiologic associations.</a> Am J Med. 74 (1), 14-22 (1983).</li>
</ol>

Donald Ingber is oprichter, bestuurslid, voorzitter van de wetenschappelijke adviesraad en aandeelhouder van Emulate. De andere auteurs verklaren dat zij geen tegenstrijdige belangen hebben.

Eerdere in vitro modellen van de menselijke vagina repliceren niet getrouw vaginale weefselstructuren, vloeistofstroom en interacties tussen gastheer en ziekteverwekker19,22. Diermodellen worden ook beperkt door variatie tussen soorten in het microbioom en verschillen in de oestrische of menstruatiecyclus19,22. Dit manuscript beschrijft een protocol om een orgaanchipmodel van de menselijke vagina te maken dat menselijke reacties op gezonde en dysbiotische microbiële gemeenschappen effectief kan nabootsen.
Dit protocol omvat het zaaien van vaginale epitheel- en fibroblastcellen aan weerszijden van een gedeeld poreus membraan dat parallelle microkanalen scheidt in een tweekanaals orgaanchipapparaat dat in de handel verkrijgbaar is (zie Materiaaltabel). Het poreuze membraan zorgt voor de migratie van groeifactoren en andere vormen van intercellulaire communicatie. De collageencoating en de aanwezigheid van de celmonolagen voorkomen echter het mengen van media tussen kanalen. Bij de vorming van een monolaag van een vaginale epitheelcel in het apicale kanaal, worden differentiatiefactoren geïntroduceerd in het medium dat in het basale kanaal stroomt, dat door de interstitiële ruimte gaat en daardoor de differentiatie van de vaginale epitheelcellen bevordert om een gelaagd epitheel te vormen. De dichtheid van de vaginale epitheelcellen op het moment van zaaien is een cruciale bepalende factor voor de gezondheid van de vaginachip aan het einde van de differentiatiefase. Daarom moet de dichtheid van vaginale epitheelcellen worden beoordeeld voordat differentiatie wordt gestart, die niet mag worden gestart totdat een monolaag is vastgesteld. De blootstelling aan de differentiatiefactoren kan worden voortgezet totdat de gewenste dichtheid van de vaginale epitheelcellen is bereikt en vóór bacteriële inoculatie. Verder moet worden opgemerkt dat de groeisnelheid kan variëren voor primaire vaginale epitheelcellen van verschillende donoren (of commerciële bronnen), wat de kwaliteit van de gegenereerde vaginachip kan beïnvloeden. In alle microfluïdische orgaanchiponderzoeken is het van het grootste belang om eventuele luchtbellen te verwijderen die zich in de kanalen in de chipcultuur kunnen vormen, omdat ze de mediumstroom verstoren en uiteindelijk zullen resulteren in een verminderde beschikbaarheid van voedingsstoffen en een verlies van de levensvatbaarheid van de cellen. 
Dit protocol beschrijft ook hoe de Vagina Chip kan worden gebruikt om bacteriële gemeenschappen op de chip tot stand te brengen die de gezonde vaginale toestand of bacteriële vaginose nabootsen. De Vagina Chip kan ook worden gebruikt om andere vaginale ziekten of aandoeningen te bestuderen; Bij het uitvoeren van deze onderzoeken moet er echter voor worden gezorgd dat de kenmerken van elke ziekte worden begrepen en wat de beste manier is om de resultaten te correleren met klinische bevindingen. Samenvattend opent de menselijke vaginachip nieuwe wegen om een overvloed aan ziekten en aandoeningen die verband houden met de FRT te bestuderen, en het kan een waardevol hulpmiddel zijn voor het onderzoeken van mogelijke therapieën.

Een vaginaal microbioom dat wordt gedomineerd door Lactobacillus spp. dat helpt bij het handhaven van een zure micro-omgeving, speelt een belangrijke rol bij het behoud van de reproductieve gezondheid vanvrouwen1. Soms kan er echter een verandering optreden in de samenstelling van microbiële gemeenschappen waaruit het microbioom bestaat, wat resulteert in een toename van de diversiteit van vaginale bacteriën. Deze dysbiotische veranderingen, die vaak resulteren in een overschakeling van een door Lactobacillus gedomineerde toestand naar een toestand die wordt gedomineerd door meer diverse anaërobe bacteriesoorten (bijv. Gardnerella vaginalis), worden in verband gebracht met verschillende ziekten van het voortplantingssysteem, zoals bacteriële vaginose, atrofische vaginitis, urineweginfectie, vulvovaginale candidiasis, urethritis en chorioamnionitis 2,3,4,5 . Deze ziekten verhogen op hun beurt de kansen van een vrouw om seksueel overdraagbare aandoeningen en bekkenontstekingsaandoeningen te krijgen 6,7,8,9. Ze vormen ook een hoger risico op vroeggeboorte en miskramen bij zwangere vrouwen 10,11,12 en zijn ook betrokken bij onvruchtbaarheid 13,14,15,16.
Hoewel er inspanningen zijn geleverd om vaginale dysbiose te modelleren met behulp van vaginale epitheelcellen die zijn gekweekt in statische, tweedimensionale (2D) kweeksystemen17,18, bootsen ze de fysiologie en complexiteit van de vaginale micro-omgeving niet effectief na19. Diermodellen zijn ook gebruikt om vaginale dysbiose te bestuderen; Hun menstruatiefasen en interacties tussen gastheer en microbioom verschillen echter sterk van die bij mensen, en daarom blijft de fysiologische relevantie van de resultaten van deze onderzoeken onduidelijk 19,20,21. Om deze problemen tegen te gaan, zijn organoïden en Transwell-invoegmodellen van menselijk vaginaal weefsel ook gebruikt om gastheer-pathogene interacties in de FRTte bestuderen 19,22,23,24. Maar omdat dit statische culturen zijn, kunnen ze slechts gedurende een korte periode (<16-24 uur) co-cultuur van menselijke cellen met levende microben ondersteunen, en ze missen veel andere potentieel belangrijke fysieke kenmerken van de menselijke vaginale micro-omgeving, zoals slijmproductie en vloeistofstroom22.
Orgaanchips zijn driedimensionale (3D) microfluïdische kweeksystemen die een of meer parallelle holle microkanalen bevatten die zijn bekleed met levende cellen die zijn gekweekt onder dynamische vloeistofstroom. De tweekanaals chips maken het mogelijk om weefsel-weefselinterfaces op orgaanniveau na te bootsen door verschillende celtypen (bijv. epitheel en stromale fibroblasten of epitheel en vasculair endotheel) te kweken aan weerszijden van een poreus membraan dat de twee parallelle kanalen scheidt (Figuur 1). Beide weefsels kunnen onafhankelijk worden blootgesteld aan vloeistofstroom en ze kunnen ook micro-aërobe omstandigheden ervaren om co-cultuur met een complex microbioom mogelijk te maken 25,26,27,28. Deze aanpak werd onlangs gebruikt om een menselijke vaginachip te ontwikkelen die is bekleed met hormoongevoelig, primair vaginaal epitheel dat is gekoppeld aan onderliggende stromale fibroblasten, die een lage fysiologische zuurstofconcentratie in het epitheellumen ondersteunt en co-cultuur met gezonde en dysbiotische microbiomen gedurende ten minste 3 dagen in vitromogelijk maakt 29. Er werd aangetoond dat de Vagina Chip kan worden gebruikt om kolonisatie door optimale (gezonde) L. crispatus consortia te bestuderen en ontstekingen en verwondingen te detecteren veroorzaakt door niet-optimale (niet-gezonde) G. vaginalis bevattende consortia. Hier beschrijven we in detail de methoden die worden gebruikt om de menselijke vaginachip te maken en om gezonde en dysbiotische bacteriële gemeenschappen op de chip tot stand te brengen.

<table><tbody><tr><td>0.22 &micro;m Steriflip</td><td>Millipore&nbsp;</td><td>SCGP00525</td><td>Om media te degassen</td></tr><tr><td>2 channel chip</td><td>Emulate</td><td>BRK-S1-WER-24</td><td>Onderdeel van het twee-kanaals Chip-kit</td></tr><tr><td>200 &mu;L barrier tips (of filtertips)</td><td>Thomas Scientific, SHARP</td><td>1159M40</td><td>Tips gebruikt voor chip-seeding</td></tr><tr><td>Activation Reagent 1 (of ER-1 poeder)&nbsp;</td><td>Emulate</td><td>Chip S1 Basic Research kit-24PK</td><td>Onderdeel van het twee-kanaals Chip-kit; Opslagtemperatuur -20 &deg;C&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Activation Reagent 2 (of ER-2 oplossing)&nbsp;</td><td>Emulate</td><td>Chip S1 Basic Research kit-24PK</td><td>Onderdeel van het twee-kanaals Chip-kit; Opslagtemperatuur 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>A2786</td><td>Component van het Differentiatie-medium</td></tr><tr><td>Brucella bloedagar platen</td><td>VWR International Inc.&nbsp;</td><td>89405-032</td><td>met Hemin en Vitamine K; Voor het tellen van Gardnerella vaginalis</td></tr><tr><td>Ca2+ en Mg2+ vrij DPBS (DPBS (-/-)</td><td>ScienCell</td><td>303</td><td>Voor het wassen van cellen</td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>C5670</td><td>Component van het Differentiatie-medium</td></tr><tr><td>Calciumchloride (watervrij)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>499609</td><td>Component van HBSS (LB/+G)</td></tr><tr><td>Collageen I&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>Voor de coatingoplossing voor HVEC</td></tr><tr><td>Collageen IV&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>C7521</td><td>Voor de coatingoplossing voor HVEC</td></tr><tr><td>Collageenase IV</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td>Voor het dissociëren van cellen uit de Vagina Chips</td></tr><tr><td>Complete fibroblast medium&nbsp;</td><td>ScienCell</td><td>2301</td><td>Medium voor de cultuur van HUF</td></tr><tr><td>Complete vaginaal epitheel medium</td><td>Lifeline</td><td>LL-0068</td><td>Medium voor de cultuur van HVEC</td></tr><tr><td>D-Glucose (dextrose)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>158968</td><td>Component van HBSS (LB/+G)</td></tr><tr><td>DMEM (Laag Glucose)&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>12320-032</td><td>Component van het Differentiatie-medium</td></tr><tr><td>Dynamic Flow Module (of Zo&euml;)</td><td>Emulate</td><td>Zo&euml;-CM1</td><td>Reguleert de stroomsnelheid van de chips</td></tr><tr><td>Ham's F12</td><td>Thermofisher</td><td>11765-054</td><td>Component van het Differentiatie-medium</td></tr><tr><td>Heat inactivated FBS&nbsp;</td><td>Thermofisher&nbsp;</td><td>10438018</td><td>Component van het Differentiatie-medium</td></tr><tr><td>Human uterine fibroblasts</td><td>ScienCell</td><td>7040</td><td>HUF</td></tr><tr><td>Human vaginal epithelial cells</td><td>Lifeline</td><td>FC-0083</td><td>HVEC</td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>H0396</td><td>Component van het Differentiatie-medium</td></tr><tr><td>ITES</td><td>Lonza</td><td>17-839Z</td><td>Component van het Differentiatie-medium</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Thermofisher</td><td>25030081</td><td>Component van het Differentiatie-medium</td></tr><tr><td>Magnesiumchloride hexahydraat</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>M2393</td><td>Component van HBSS (LB/+G)</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaat heptahydraat</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>M1880</td><td>Component van HBSS (LB/+G)</td></tr><tr><td>MRS agar platen</td><td>VWR International Inc.&nbsp;</td><td>89407-214</td><td>Voor het tellen van Lactobacillus</td></tr><tr><td>O-fosforylethanolamine</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>P0503</td><td>Component van het Differentiatie-medium</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Thermofisher&nbsp;</td><td>15070063</td><td>Component van het Differentiatie-medium</td></tr><tr><td>pH strips</td><td>Fischer-Scientific</td><td>13-640-520</td><td>Voor het meten van pH&nbsp;</td></tr><tr><td>Pods (1/chip)&nbsp;</td><td>Emulate</td><td>BRK-S1-WER-24</td><td>Onderdeel van het twee-kanaals Chip-kit</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>ScienCell</td><td>403</td><td>Voor de coatingoplossing voor HUF's</td></tr><tr><td>Kaliumchloride&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>P3911</td><td>Component van HBSS (LB/+G)</td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat monobasisch</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>P0662</td><td>Component van HBSS (LB/+G)</td></tr><tr><td>Steriel 80% glycerol&nbsp;</td><td>MP Biomedicals&nbsp;</td><td>113055034</td><td>Voor het invriezen van bacteriemonsters</td></tr><tr><td>Trijoodthyronine</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>&nbsp;T6397</td><td>Component van het Differentiatie-medium</td></tr><tr><td>Trypan Blauw Oplossing (0.4%)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>T8154</td><td>Voor het tellen van levende/dode cellen</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermofisher&nbsp;</td><td>12605010</td><td>Voor het dissociëren van cellen uit de Vagina Chips</td></tr><tr><td>Trypsine Neutraliserende Oplossing (TNS)&nbsp;</td><td>ScienCell</td><td>113</td><td>Voor neutralisatie van Trypsine</td></tr><tr><td>Trypsine/EDTA Oplossing (0.25%)</td><td>ScienCell</td><td>103</td><td>Voor celdissociatie&nbsp;</td></tr><tr><td>&beta;-oestradiol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>E2257</td><td>Hormoon voor differentiatie-medium</td></tr></tbody></table>

modelleren van gezonde en dysbiotische vaginale micro-omgevingen in een menselijke vagina-op-een-chip

Modeling Healthy and Dysbiotic Vaginal Microenvironments in a Human Vagina-on-a-Chip

De gezondheid van vrouwen, en in het bijzonder ziekten van het vrouwelijke voortplantingsstelsel (FRT), hebben niet de aandacht gekregen die ze verdienen, ook al kan een ongezond voortplantingssysteem leiden tot levensbedreigende ziekten, onvruchtbaarheid of nadelige gevolgen tijdens de zwangerschap. Een barrière in het veld is dat er een gebrek is aan preklinische, experimentele modellen die de fysiologie en pathofysiologie van de FRT getrouw nabootsen. De huidige in vitro - en diermodellen geven de hormonale veranderingen, micro-aerobe omstandigheden en interacties met het vaginale microbioom niet volledig weer. De komst van Organ-on-a-Chip (Organ Chip) microfluïdische kweektechnologie die weefsel-weefselinterfaces, vasculaire perfusie, interstitiële vloeistofstromen en de fysieke micro-omgeving van een belangrijke subeenheid van menselijke organen kan nabootsen, kan mogelijk dienen als een oplossing voor dit probleem. Onlangs is een menselijke vaginachip ontwikkeld die de co-cultuur van menselijke vaginale microbiële consortia met primair menselijk vaginaal epitheel ondersteunt en die ook is verbonden met vaginaal stroma en een dynamische vloeistofstroom ervaart. Deze chip repliceert de fysiologische reacties van de menselijke vagina op gezonde en dysbiotische microbiomen. In dit artikel is een gedetailleerd protocol beschreven voor het maken van menselijke Vagina Chips.

De menselijke vagina is bekleed met een gelaagd epitheel dat een fibroblastrijk collageen stroma bedekt. Om dit te modelleren, werd een weefselinterface gecreëerd door primair menselijk vaginaal epitheel en fibroblasten aan weerszijden van een gemeenschappelijk poreus membraan te kweken in een tweekanaals microfluïdisch orgaanchipapparaat. De vorming van het vaginale epitheel wordt gecontroleerd met behulp van helderveldmicroscopische beeldvorming, die de vorming van een continu vel cellen onthult dat geleidelijk meerdere cellagen vormt (Figuur 2A). Eerdere rapporten bevestigden dat deze morfologie correleert met de ontwikkeling van een volledig gestratificeerd epitheel wanneer bekeken in dwarsdoorsnede29. Als de epitheellaag echter fragmentarisch en discontinu lijkt (Figuur 2B), is de vaginachip mogelijk niet geschikt voor gebruik in experimenten.
Figuur 3 toont een schematische weergave van het ontstaan van de Vagina Chip. Om de functionaliteit van de vaginachip te valideren, werden de chips geënt met L. crispatus en G. vaginalis om respectievelijk gezonde en dysbiotische vaginale omgevingen te modelleren. G. vaginalis is de bacterie die voornamelijk betrokken is bij bacteriële vaginose. Om te controleren of gezonde en dysbiotische bacteriën op de Vagina Chips zijn geënt, werd de bacteriële belasting gekwantificeerd in de Vagina Chips die waren geënt met de verschillende bacteriepopulaties door kanaaleffluenten en verteerde cellagen te plateren op selectieve bacteriële groeimedia (De Man-Rogosa-Sharpe (MRS) agar voor L. crispatus en Brucella bloedagar (BBA) voor G. vaginalis) (zie Materiaaltabel) en deze te vergelijken met vergelijkbare culturen met behulp van het originele inoculum. Kolonies van L. crispatus en G. vaginalis werden gedetecteerd binnen 48 uur na het plateren (Figuur 2C), wat bevestigt dat zowel gezonde als dysbiotische bacteriën in de vaginachips zijn geënt. Als er echter bacteriekolonies worden waargenomen op de platen met de inoculums, maar niet worden waargenomen op platen met het effluent of de digest na de vereiste incubatie, kan worden geconcludeerd dat de bacteriën niet zijn ingeënt.
Een gezond vaginaal milieu is zuur en dysbiose resulteert in een verhoging van de vaginale pH31. Daarom werd ook de pH van het effluent van het apicale epitheelkanaal van de Vagina Chip geanalyseerd. De pH van vaginachips die waren geïnoculeerd met L. crispatus was vergelijkbaar met die van niet-geïnoculeerde controlechips, en wanneer ze samen met G. vaginalis werden gekweekt, ervoeren ze een aanzienlijk verhoogde pH (Figuur 2D). Als de pH van een niet-geïnfecteerde vaginachip hoog wordt waargenomen, geeft dit aan dat er een probleem is en dat deze chips niet voor experimenten mogen worden gebruikt.
De ontstekingstoestand van vaginaal weefsel is ook gevoelig voor de samenstelling van het vaginale microbioom, waarbij een dysbiotisch microbioom ontstekingen stimuleert. Bij analyse van de pro-inflammatoire cytokines in het apicale kanaal van de vaginachip 3 dagen na inoculatie met L. crispatus of G. vaginalis, bleek de pro-inflammatoire respons op dezelfde manier hoger te zijn met G. vaginalis in vergelijking met niet-geïnfecteerde chips en chips geïnoculeerd met L. crispatus (Figuur 2E). Alles bij elkaar genomen laten deze resultaten zien dat de Vagina Chip de menselijke vaginale micro-omgeving nauw nabootst in zowel gezonde als dysbiotische toestanden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66486/66486fig01.jpg"> Afbeelding 1: Een tweekanaals chip en zijn pod. (A) Afbeelding van een tweekanaals PDMS-chip met de kanalen en poorten. (B) Afbeelding van een pod met de reservoirs en poorten voor apicale en basale kanalen. (C) Schematisch diagram met de dwarsdoorsnede van een met microben geïnfecteerde vaginachip. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66486/66486fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66486/66486fig02.jpg"> Figuur 2: Vagina Chip bootst gezonde en dysbiotische menselijke vaginale micro-omgevingen na. (A) Vaginale epitheelcellen in het apicale kanaal van een robuuste vagina Chip. De schaalbalk vertegenwoordigt 1 mm van de chip in de bovenste afbeelding en 500 μm in de onderste afbeelding. (B) Vaginale epitheelcellen in het apicale kanaal van een ontoereikende vaginachip. De schaalbalk vertegenwoordigt 1 mm van de chip in de bovenste afbeelding en 500 μm in de onderste afbeelding. (C) Implantatie van L. crispatus (LC) en G. vaginalis (GV) in de vaginachip. (D) pH van Vagina Chips na 72 uur incubatie met L. crispatus (LC) en G. vaginalis (GV) in vergelijking met niet-geïnfecteerde (controle) Vagina Chips. (E) Pro-inflammatoire respons van Vagina Chips op L. crispatus (LC) en G. vaginalis (GV) na 72 uur incubatie, in vergelijking met niet-geïnfecteerde (controle) Vagina Chips. (C-E) Grafieken tonen het gemiddelde ± SD voor 4-6 chips; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 in vergelijking met controle Vagina Chips; Elke (●) vertegenwoordigt gegevens van 1 chip. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66486/66486fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66486/66486fig03.jpg"> Figuur 3: Schematische weergave van het protocol voor het genereren van de Vagina Chip. Schematische weergave van de stappen die betrokken zijn bij het zaaien van cellen en het genereren van de Vagina Chip. HVEC's - Menselijke vaginale epitheelcellen; HUF's - Menselijke baarmoederfibroblasten; VEM - Vaginaal epitheelmedium; FM - Fibroblast media; DM - Differentiatie medium; PS - Penicilline Streptomycine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66486/66486fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Dit artikel beschrijft een protocol voor het maken van een microfluïdisch vagina-op-een-chip (Vagina Chip) kweekapparaat dat de studie van menselijke gastheerinteracties met een levend vaginaal microbioom onder micro-aerofiele omstandigheden mogelijk maakt. Deze chip kan worden gebruikt als hulpmiddel om vaginale ziekten te onderzoeken en om mogelijke therapeutische tegenmaatregelen te ontwikkelen en te testen.

Modelleren van gezonde en dysbiotische vaginale micro-omgevingen in een menselijke vagina-op-een-chip

Women's health, and particularly diseases of the female reproductive tract (FRT), have not received the attention they deserve, even though an unhealthy ...

We hebben met succes een menselijke vaginachip ontwikkeld die spontane differentiatie van plaveiselcelgestratificeerd vaginaal epitheel ondersteunt, een sterke barrière vormt, reageert op hormonen en een microbioom genereert dat zuurstofgradiënten ondersteunt. 2D- en organoïdeculturen worden momenteel gebruikt om vaginale dysbiose te bestuderen, maar ze zijn niet in staat om de fysiologische complexiteit van de vaginale micro-omgeving na te bootsen vanwege hun statische aard. Diermodellen kunnen ook niet dezelfde hormonale veranderingen modelleren die aanwezig zijn in de menselijke menstruatiecyclus, en het vaginale microbioom verschilt tussen diersoorten en mensen.We wilden onderzoeken of orgaanchiptechnologie kan worden gebruikt om een preklinisch model van menselijke vagina-microbioominteracties te ontwikkelen, dat mogelijk kan worden gebruikt voor het ontdekken en beoordelen van potentiële op microbioom gebaseerde therapieën. De vaginachip zorgt voor een dynamische vloeistofstroom over het vaginale epitheel en het stroma, waardoor de co-culturatie met vaginale microbiële consortia wordt verlengd en een fysiologisch relevante micro-omgeving in stand wordt gehouden. De menselijke vagina-op-een-chip is een opwindend hulpmiddel dat kan worden gebruikt om verschillende ziekten van het vrouwelijke voortplantingsstelsel te bestuderen en nieuwe biotherapeutica te valideren.

modeling-healthy-dysbiotic-vaginal-microenvironments-human-vagina-on

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Een roterende celcultuur die het mogelijk maakt epitheliale cellen om te groeien onder fysiologische omstandigheden resulteert in 3-D cellulaire totale formatie wordt beschreven. De aggregaten gegenereerde...

Kweken en Toepassingen van Rotating muur Schip Bioreactor Afgeleid 3D epitheelcellen modellen

Source: Morrill, S. R., et al. Models of Murine Vaginal Colonization by Anaerobically Grown Bacteria. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates a protocol for modeling vaginal colonization in mice using antibiotic-resistant anaerobic bacteria. It begins with hormonal treatment to increase epithelial susceptibility, followed by vaginal inoculation and co-inoculation under anaerobic conditions. The procedure concludes with post-inoculation sampling and culture to evaluate bacterial colonization...

Modeling Murine Vaginal Colonization by Anaerobic Bacteria

We beschrijven een in vitro protocol co-cultuur darm microbioom en darmvlokken voor een langere periode met een menselijke darm-on-a-chip microphysiological systeem.

Co-cultuur van de levens- Microbiome met Microengineered Human darmvlokken in een Gut-on-a-Chip microfluïdische apparaat

Het protocol presenteert een muismodel van vaginale kolonisatie met anaeroob gekweekte menselijke vaginale bacteriën. We richten ons op Gardnerella vaginalis, terwijl we suggesties opnemen voor Prevotella bivia en Fusobacterium nucleatum. Dit protocol kan ook worden gebruikt als een gids voor vaginale inentingen en levensvatbaar herstel van andere anaeroob gekweekte bacteriën.

Modellen van Murine Vaginale Kolonisatie door Anaeroob Gekweekte Bacteriën

neuroHuMiX is een geavanceerd darm-op-een-chip-model om de interacties van bacteriële, epitheel- en neuronale cellen te bestuderen onder proximale en representatieve co-cultuuromstandigheden. Dit model maakt het mogelijk om de moleculaire mechanismen te ontrafelen die ten grondslag liggen aan de communicatie tussen het darmmicrobioom en het zenuwstelsel.

Een darm-op-een-chip-model om de darmmicrobioom-zenuwstelsel-as te bestuderen

Dit protocol beschrijft een in vitro model van necrotiserende enterocolitis (NEC), dat kan worden gebruikt voor mechanistisch onderzoek naar de pathogenese van ziekten. Het beschikt over een microfluïdische chip bezaaid met darmenteroïden die zijn afgeleid van de menselijke neonatale darm, endotheelcellen en het darmmicrobioom van een pasgeborene met ernstige NEC.

Microfluïdisch model van necrotiserende enterocolitis met menselijke neonatale darmenteroïden en een dysbiotisch microbioom

Integratie van darmorganoïden bij honden en een Gut-on-a-Chip microfluïdisch systeem biedt relevante translationele modellen voor menselijke darmziekten. De gepresenteerde protocollen maken 3D-morfogenese en dynamische in vitro modellering van de darm mogelijk, wat helpt bij de ontwikkeling van effectieve behandelingen voor darmziekten bij honden en mensen met One Health.

Driedimensionale morfogenese bij darm-op-een-chip bij honden met behulp van darmorganoïden afkomstig van patiënten met inflammatoire darmaandoeningen

Ons gedetailleerde protocol schetst de creatie en het gebruik van het geavanceerde darm-op-chip-model, dat menselijk darmslijmvlies simuleert met 3D-structuren en verschillende celtypen, waardoor een diepgaande analyse van immuunresponsen en cellulaire functies als reactie op microbiële kolonisatie mogelijk is.

Immunocompetent darm-op-chip-model voor het analyseren van immuunresponsen van het darmslijmvlies

Zelf-geassembleerde monolagen (SAM) gevormd uit lange keten alkaan thiolen op goud bieden goed gedefinieerde substraten voor de vorming van eiwit patronen en cel opsluiting. Microcontact printen van hexadecanethiol met behulp van een polydimethylsiloxaan (PDMS), stempel, gevolgd door opvulling met een glycol-beëindigde alkaan thiol monomeer produceert een patroon waarbij eiwitten en cellen adsorberen alleen aan de gestempelde hexadecanethiol regio.

Het creëren van twee-dimensionale Patterned Substraten voor eiwit en Cell opsluiting

Een methodiek om ventriculaire vezeloriëntaties schatten van in-vivo beelden van patiënt hart geometrieën voor gepersonaliseerde modellering wordt beschreven. Validering van de methodologie uitgevoerd met behulp van de normale en falende harten hond laten zien dat dat er geen significante verschillen tussen geschatte en verworven vezeloriëntaties werden bij een klinisch waarneembare niveau.

Patiënt-specifieke modellering van het Hart: Schatting van ventriculaire vezeloriëntaties

Leer hoe je een vagina-op-een-chip ontwikkelt voor het bestuderen van menselijke vaginale microbiële interacties onder microaerofiele omstandigheden. Dit model ondersteunt spontane differentiatie van epitheel en co-cultuur met microbiële gemeenschappen.

Modelleren van gezonde en dysbiotische vaginale micro-omgevingen in een menselijke vagina-op-een-chip

Meer video's verkennen