Microfluïdische Aanvragen voor eenmalig gebruik Diagnostics

Mijn naam is Catherine CloudBridge en ik ben professor in productie, engineering en biomedische technologie aan de Boston University. Daarnaast ben ik de directeur van het Biomedical Micro Devices and Microenvironments Laboratory. Wij werken hoofdzakelijk aan het ontwikkelen van wegwerpgestuurde diagnostiek voor toepassingen in omgevingen met beperkte middelen.

Daarom maken we gebruik van microfluidica om deze apparaten te vervaardigen. We richten ons op twee onderzoeksgebieden. In eerste instantie zijn we geïnteresseerd in de manier waarop biomoleculen en cellen interageren met polymeroppervlakken van kunststof.

Dat is onze overkoepelende focus. Dat werk is belichaamd in microfluidische toepassingen voor wegwerpsdiagnostiek. In het laboratorium maken we dus microfluidische apparaten.

Bij thermoplastische materialen gebruiken we doorgaans geen PDMS, het rubberachtige materiaal dat de meeste mensen gebruiken om microfluidica in het laboratorium te maken. Wij vervaardigen onze apparaten uit thermoplasten. We zijn geïnteresseerd in het gebruik van deze thermoplastische apparaten om moleculaire biologie op microschaal uit te voeren, op een manier waarop die moleculaire biologie in het veld kan worden gedaan, ver verwijderd van een centraal laboratorium.

Hoe dat in de praktijk in het laboratorium werkt, is dat we kleine plastic kaarten maken waarin vaste-fase-extractiekolommen, cellysekolommen of mengkolommen zijn ingebouwd. We voeren daarnaast polymerasekettingreactie op de chip uit als detectietechniek. Al deze componenten zijn geïntegreerd in een klein apparaat dat, gezien de langetermijnvisie van het onderzoek, uiteindelijk een geïntegreerd handapparaat zou worden dat kan worden meegenomen naar het veld of naar omgevingen waar een grootschalig laboratorium met alle bijbehorende centrifuges, warmte-incubatoren en dergelijke niet beschikbaar zou zijn.

We zouden idealiter willen kunnen starten met een menselijk monster, zoals bloed, urine, ontlasting of bijvoorbeeld een nasofaryngeale swab, wat slijm zou zijn. En vervolgens willen we aan de output van de chip een antwoord hebben: ja of nee, of iemand is geïnfecteerd met een specifiek micro-organisme. De manier waarop we dat doen, is door te zoeken naar het DNA of RNA van dat specifieke micro-organisme in het monster van de patiënt, afhankelijk van het betreffende micro-organisme.

De technische uitdagingen liggen dus grotendeels aan de kant van de monstervoorbereiding. Wanneer u begint met bloed, ontlasting of urine, moet u vanuit een situatie waarbij u een onzuiver menselijk monster heeft met veel potentiële vaste deeltjes of inhibitoren voor PCR of andere amplificatietechnieken, naar een eindresultaat gaan in de vorm van een zeer zuiver geëlueerd monster van nucleïnezuren. Dit monster kunt u vervolgens gebruiken om een specifiek DNA of RNA te amplificeren of op te sporen, wat u vertelt of het micro-organisme waarnaar u op zoek bent aanwezig was.

Om deze monsters te zuiveren, moeten er enkele stappen worden ondernomen. Ten eerste moet het monster worden gefilterd, wat afhankelijk van het monster kan bestaan uit grove filtratie of een korte centrifugatiestap voordat het monster op de chip wordt aangebracht. We proberen daarom altijd te beginnen met monsters zoals deze door de clinicus worden aangeleverd.

Bij urine, ontlasting en nasofaryngeale swabs is ons doel dat de clinicus zijn werk doet zoals gebruikelijk en de monsters neemt zoals hij dat normaal gesproken zou doen. Vervolgens nemen we dat monster en brengen we het aan op de chips. Als er in die stap nog verdere filtratie nodig is, vindt die filtratie plaats in de chip.

De tweede stap houdt in dat we, omdat we moleculaire assays uitvoeren, de cellen en de micro-organismen in dat monster moeten lyseren. We voeren daarom een lysestap uit, waarbij het monster gewoonlijk door een filter met een kleine poriegrootte wordt geperst. Soms bevat dat filter ook nanodeeltjes, zoals koolstofnanobuisjes, die scherpe randen hebben; deze kunnen worden gebruikt om organismen met robuustere celwanden open te breken, zoals C difficile, een grampositieve bacterie waarmee we werken en die zeer moeilijk te lyseren is.

Daarom moeten we robuustere lysiskolommen hebben. Gewoonlijk voeren we een gecombineerde chemische en mechanische lysis uit in de chip. Ons doel is vervolgens om het lysaat te nemen en de gezuiverde nucleïnezuren te extraheren.

Vervolgens leiden we het lysaat over een vaste-fase-extractiekolom die is geïntegreerd in de microfluidische chip. Deze vaste-fase-extractiekolom is van kunststof en is vervaardigd met behulp van foto-geïnitieerde chemie binnen het microfluidische kanaal nadat dit reeds is gefabriceerd. Daarnaast is de kolom gewoonlijk geïmpregneerd met silicadeeltjes, omdat we nucleïnezuren willen binden en weer vrijmaken.

In sommige gevallen hebben we oligo DT-beads gebruikt als we specifiek mRNA willen binden en vrijmaken, of beads met specifieke antilichamen, als we bepaalde eiwitten willen binden en vrijmaken. We kunnen extractiekolommen maken die al deze functies vervullen. Vandaag laten we u echter zien hoe u de base-extractiekolom met silica-beads maakt.

Nadat we dat hebben gedaan, brengen we het lysaat over de silicakolom; dit werkt precies zoals een Qiagen-kit zou werken in een laboratorium op macroschaal. Vervolgens wassen we om alle andere ongewenste componenten te verwijderen, zoals alle koolhydraten, lipiden en overige stoffen in het cellysaat en in de rest van het menselijke monster die we niet nodig hebben. Helemaal aan het einde elueren we met water.

Het mooie van deze microscale vaste-fase-extractiekolommen is dat we kunnen elueren met een zeer kleine hoeveelheid water, gewoonlijk in de orde van één tot vijf microliters. We krijgen bijna alle nucleïnezuren terug die we hebben toegevoegd. We hebben een efficiëntie van ongeveer 70 tot 90% in de eerste 10 microliters die we uit dat kanaal terugkrijgen.

Wanneer we dus twee keer wassen met 2 tot 10 µL, krijgen we bijna alle nucleïnezuren terug die we hebben toegevoegd. Zo verkrijgen we niet alleen een schoon monster dat geschikt is voor PCR, maar ook een monster met een veel hogere concentratie dan mogelijk is met een standaard benchtop-kit. Het uiteindelijke doel van al deze technieken voor monstervoorbereiding is om resultaten te behalen die compatibel zijn met andere onderzoeken die zijn uitgevoerd.

Zeer mooi werk in het veld dat aantoont dat PCR-amplificatie op een chip kan worden uitgevoerd. De reverse transcriptase-reactie kan op een chip worden gedaan als u werkt met een RNA-virus of als u een genexpressie-experiment wilt uitvoeren. Onze technieken voor monstervoorbereiding kunnen direct worden gekoppeld aan PCR op een chip, waardoor het niet langer nodig is om die zuivering en monstervoorbereiding aan de werkbank uit te voeren.

En, en, en ook de concentratiestap die nodig is om de zeer kleine volumes te verkrijgen die vereist zijn voor gemultiplexte PCR op een kleine chip. De experimenten die we u vandaag laten zien, tonen hoe we de microfluidische chip assembleren, die is gemaakt van thermoplast en niet van PDMS. Hierdoor is een iets ander fabricageproces vereist dan gewoonlijk wordt gebruikt, evenals de wijze waarop deze chips worden afgedicht.

Vervolgens laten we zien hoe we de licht-geïnitieerde chemie binnen de chip uitvoeren om de polymeer-monolieten te maken die worden gebruikt voor zowel cellyse als voor vaste-fase-extractie. Aan het einde van dat proces — welke momenteel modulaire processen in het laboratorium zijn, maar kunnen worden en zijn geïntegreerd — verkrijgt u een sterk geconcentreerd monster van nucleïnezuren, RNA en DNA in water. Dit kan vervolgens downstream naar een PCR-module of een andere amplificatiemodule gaan, waar identificatie van een micro-organisme of een infectie kan plaatsvinden. We werken momenteel aan een subsidieproject waarbij we menselijke monsters verzamelen van het Boston Medical Center van patiënten die mogelijk wel of niet geïnfecteerd zijn met Influenza A. Aangezien het griepseizoen is, zijn dat de monsters die we verzamelen.

En vervolgens voeren we in het laboratorium de gouden standaard assays uit om te bepalen of iemand besmet is met Influenza A, wat in essentie een kweekassay is die meerdere dagen duurt om uit te voeren. Parallel daaraan halen we deze monsters door de huidige modules van onze chip. We laten ze door de lysiskolom en de kolom voor vastfase-extractie gaan, en vervolgens voeren we de PCR uit om te zien hoe we presteren in vergelijking met de gouden standaard methoden.

Dit is de fase waarin we ons momenteel bevinden. Als deze experimenten slagen, denk ik dat we over de komende vier tot zes jaar in een situatie zullen zijn waarin we een geïntegreerde chip en een volledige assay hebben voor influenza A; daarnaast werken we aan clostridium difficile en ontlastingmonsters. We zijn er bovendien zeer dicht bij om niet alleen het apparaat, maar ook de assay te hebben geïntegreerd.

Zowel de ontwikkeling van de assay als het ontwerp van de chip moeten dus hand in hand gaan. Voor een specifieke toepassing, om tot een klinische implementatie te komen, is het echt een doelgericht proces. Men moet het monster waarmee men start en het micro-organisme waarnaar men zoekt kennen om de chip te optimaliseren voor gebruik aan het bed van de patiënt.

Dus ik denk dat we niet heel ver verwijderd zijn van het realiseren hiervan in de vorm van een prototype. Dat zijn onze einddoelen, dus ik hoop dat we dat bereiken.