Microfluïdische Aanvragen voor eenmalig gebruik Diagnostics

Mijn naam is Catherine CloudBridge en ik ben professor in productie, techniek en biomedische techniek aan de Boston University. En ik ben de directeur van het Biomedical Micro Devices and Microenvironments Laboratory. We werken voornamelijk aan het maken van wegwerpbare diagnostiek voor toepassingen in omgevingen met beperkte middelen.

Dus we gebruiken microfluidics om die apparaten te maken. We zijn geïnteresseerd in eigenlijk twee studievelden. Primair zijn we geïnteresseerd in het onderzoeken hoe biomoleculen en cellen interageren met kunststof oppervlakken.

Dat is onze grote overkoepelende factor. Dat werk wordt belichaamd in microfluïdische toepassingen voor wegwerpbare diagnostiek. Dus in het laboratorium maken we microfluïdische apparaten.

In thermoplastische materialen gebruiken we doorgaans PDMS, wat het rubberachtige materiaal is dat de meeste mensen gebruiken om microfluïdische apparaten in het laboratorium te maken. We maken onze apparaten van thermoplasten. We zijn geïnteresseerd in het gebruik van die thermoplastische apparaten om moleculaire biologie op microschaal te doen op een manier dat die moleculaire biologie in het veld ver weg van een gecentraliseerd laboratorium kan worden uitgevoerd.

Hoe dat werkt in, in het lab is dat we kleine plastic kaarten maken en binnenin die kleine plastic kaarten zijn solid phase extraction kolommen of cel lysis kolommen of meng kolommen. We doen ook polymerase chain reaction op de chip als detectietechniek. Al deze dingen zijn geïntegreerd in een klein apparaat dat uiteindelijk, in de lange termijnvisie van het onderzoek, zou moeten resulteren in een geïntegreerd apparaat dat handmatig kan worden vastgehouden en in het veld of in omgevingen kan worden meegenomen waar een grootschalig laboratorium met alle bijbehorende centraal fusen en verwarming incubators en dergelijke niet beschikbaar zou zijn.

Dus we willen idealiter kunnen beginnen met een menselijk monster zoals bloed, urine, ontlasting of een nasofaryngeale afstrijker, bijvoorbeeld, wat slijm zou zijn. En dan bij de uitvoer van de chip een antwoord hebben of iemand wel of niet besmet is met een bepaald micro-organisme. En de manier waarop we dat doen, is door te zoeken naar het DNA van dat specifieke of RNA, afhankelijk van het micro-organisme van dat specifieke micro-organisme in het monstersteek van de patiënt.

Dus de technische uitdagingen die zich voordoen, zitten grotendeels aan de kant van de monstersvoorbereiding in die vergelijking. Dus wanneer je begint met bloed of ontlasting of urine, moet je van een situatie komen waar je een rommelige menselijke steek hebt met veel potentieel deeltjes erin of remmers voor PCR of andere versterkingstechnieken. En je wil uiteindelijk eindigen met een zeer schone elueerde steek van nucleïnezuren die je dan kunt gebruiken om een specifiek DNA of RNA te versterken of te zoeken naar een specifiek DNA of RNA dat je zal vertellen of een micro-organisme dat je zoekt er was.

Dus om die monsters schoon te maken, moet je een paar dingen doen. Eerst moet je het monster filteren, wat, afhankelijk van het monster, grove filtratie of een snelle centrifugeerstap kan omvatten voordat het monster op de chip gaat. Dus we proberen altijd te beginnen met monsters zoals ze van de clinicus komen.

Dus met urine en ontlasting en nasofaryngeale afstrijkers is ons doel om de clinicus hun werk te laten doen zoals ze normaal zouden doen en het monster te nemen zoals ze normaal zouden doen. En dan nemen we dat monster en leggen het op de chips. Dus als er nog meer filtratie nodig is in die stap, zou die filtratie in de chip gebeuren.

De tweede stap omvat, omdat we moleculaire tests doen, moeten we de cellen en de micro-organismen in dat monster lyseren. Dus we voeren dan een lysisstap uit, die meestal het forceren van het monster door een filter met een kleine poriegrootte inhoudt. Soms heeft dat filter ook nanodeeltjes zoals koolstof nanobuisjes, die scherpe randen hebben, die kunnen worden gebruikt om sommige van de organismen die robuustere celwanden hebben te scheuren, zoals C difficile, wat een gram-positieve bacterie is waarmee we werken, die erg moeilijk te lyseren is.

Dus we moeten robuustere lysis kolommen hebben. Maar doorgaans doen we een gecombineerde chemische en mechanische lysis binnenin de chip. Daarna is ons doel om het lyseaat te nemen en vervolgens de gezuiverde nucleïnezuren te extraheren.

Dus we laten het lysis overgaan, we laten het lyseaat over een solid phase extractiekolom gaan die resoneert in de microfluïdische chip. En die solid phase extractiekolom is gemaakt van kunststof en wordt gemaakt met behulp van foto-geïnitieerde chemie binnenin het microfluïdische kanaal nadat het al is vervaardigd. En het is ook geïmpregneerd met meestal silicadeeltjes omdat we nucleïnezuren willen binden en vrijgeven.

In sommige gevallen hebben we oligo DT kralen opgenomen als we specifiek mRNA willen binden en vrijgeven, bijvoorbeeld, of kralen die bepaalde antilichamen erop hebben, als we specifieke eiwitten willen binden en vrijgeven. En we kunnen extractie kolommen maken die al die dingen doen. Maar vandaag laten we je zien hoe je de solid phase extractiekolom kunt maken met de silicadeeltjes.

Dus nadat we dat hebben gedaan, laten we het lyseaat over de silicakolom gaan, het werkt net zoals een kyogen kit zou werken in het macro schaal laboratorium. We wassen vervolgens om van alle andere dingen af te komen die we niet willen, alle koolhydraten en de lipiden en andere dingen in het cel lyseaat en in de rest van het menselijke monster dat we niet willen. En dan aan het eind, we elueren met water.

En wat mooi is aan deze microschaal solid phase extractie kolommen is dat we kunnen elueren met een zeer kleine hoeveelheid water, meestal in de orde van één tot vijf microliter. En we krijgen bijna alle nucleïnezuren terug die we erin hebben gestopt. We hebben ongeveer een 70 tot 90% efficiëntie ratio en de eerste 10 microliter die we terugkrijgen van die kanaal.

Dus als we twee keer wassen met twee tot 10 microliter, krijgen we bijna alle nucleïnezuren terug die we erin hebben gestopt. Dus het is niet alleen een schone steek die PCR kan worden gedaan, het is ook een steek die veel meer geconcentreerd is dan je zou kunnen krijgen met een standaard laboratorium