Name: Dynamische door licht geïnduceerde eiwitpatronen bij modelmembranen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Leer licht-gereguleerde eiwitpatronen op kunstmatige lipide membranen met hoge precisie. Deze methode gebruikt fotoschakelbare iLID-eiwitten voor reversibele patroonvorming op ondersteunde lipide bilagen en reuze unilamellaire vesikels.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door de European Research Council ERC Starting Grant ARTIST (# 757593 S.V.W.). DDI bedankt de Alexander von Humboldt Foundation voor een postdoctorale fellowship.

1. Experimentele voorbereiding
<ol><li>Druk biotinylated-disiLID (b-disiLID) en mOrange-Nano (zie materiaaltabel) uit en zuiver ze door eerder gerapporteerde procedures 7,8 te volgen.</li>
	<li>Bereid lipidenmengsels in glazen injectieflacons met de geselecteerde lipidensamenstelling en -concentraties. Los eerst lipiden op in chloroform om een uiteindelijke lipidenoplossing te verkrijgen met een concentratie van 1 mg/ml.<ol><li>Meng lipiden om een samenstelling te verkrijgen van 94,9 mol% 2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC), 5 mol% 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamineN-(cap biotinyl) natriumzout (DOPE-biotine) en 0,1 mol% 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindodicarbocyanine (DiD) (zie materiaaltabel). OPMERKING: Het lipidenmengsel kan worden aangepast met verschillende verhoudingen en DOPE-biotineconcentratie en/of verschillende membraankleurstoffen. De aanbevolen DOPE-biotineconcentratie (5 mol%) maakt de vorming van een Streptavidin (SAv)-laag met hoge dichtheid mogelijk in de volgende stappen.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereid kleine unilamellaire blaasjes (SUV's) voor volgens eerder gerapporteerde methoden 7,8,12. Voor deze stap wordt aanbevolen om SUV's met een diameter ≤100 nm voor te bereiden.</li>
	<li>Voor deze studie wordt de sonicatiemethode gebruikt. Verdamp eerst de chloroformoplossing in de glazen injectieflacon met een stikstofstroom terwijl u de injectieflacons draait om een dunne lipidenfilm te vormen. Verwijder vervolgens de resterende chloroform gedurende minimaal 1 uur onder vacuüm.<ol><li>Rehydrateer de gedroogde film in ultrapuur water met een eindconcentratie van 1 mg/ml lipiden door middel van vortexen. Sonificeer ten slotte de verkregen oplossing gedurende 10 minuten totdat de ondoorzichtige oplossing helder wordt. OPMERKING: Bewaar het lipidenmengsel maximaal 2 weken in een microcentrifugebuisje in de koelkast. Er kunnen ook verschillende SUV-bereidingsmethoden (bijv. extrusiemethode) worden gebruikt, zolang de grootte van de uiteindelijke SUV's ≤ 100 nm is.</li>
	</ol></li>
</ol>2. mOrange-Nano rekrutering om gefunctionaliseerde SLB's te disiLID
<ol><li>Voeg 150 μl 2 M NaOH toe aan elk putje van de μ-glaasje 18-wells glazen bodemkamer (zie Materiaaltabel) en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de NaOH en was de putjes 3-5 keer, eerst met 150 μL ultrapuur water en vervolgens 3 keer met 150 μL buffer (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl) met 10 mM CaCl2.</li>
	<li>Voeg 15 μL vers bereide SUV's (bouillonconcentratie 1 mg/ml in water) toe aan de putjes met een buffer van 150 μl met 10 mM CaCl2 om ongeveer een verdunning van SUV's met factor 10 in de buffer te hebben. Laat de SUV's 30 minuten op kamertemperatuur incuberen. Na de incubatietijd worden gebiotinyleerde SLB's gevormd.</li>
	<li>Was de SLB's minstens 7 keer met buffer (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl) zonder CaCl2 door eerst de oplossing te verwijderen en vervolgens in elke stap verse buffer toe te voegen. Het wordt aanbevolen om 80 μL buffer te gebruiken voor elke wasstap. OPMERKING: Een optimale wassing van de SLB's wordt verkregen door verse oplossing meerdere keren op en neer te pipetteren zonder het oppervlak aan te raken. Het pipetteren van de oplossing in de putjes met de nieuw gevormde SLB's moet voorzichtig zijn om de vorming van kleine luchtbelletjes te verminderen die de gevormde SLB's zouden beschadigen. Vanaf dit moment moeten putten voldoende buffer bevatten om te voorkomen dat de SLB's uitdrogen.</li>
	<li>Voor de verdere functionalisering van de gebiotinyleerde SLB's met SAv voegt u een oplossing van SAv toe tot een eindconcentratie van 250 nM en incubeert u gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens het teveel aan SAv door het minstens 5 keer te wassen met een buffer (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl).</li>
	<li>Bewaar de monsters vanaf dit moment onder een beschermend rood licht om ongewenste fotoactivering van fotoschakelbare eiwitten te voorkomen. Voeg b-disiILD (zie materiaaltabel) toe tot een eindconcentratie van 1 μM in de put. Verwijder na 30 minuten incubatie bij kamertemperatuur het overtollige eiwit door minimaal 5 keer met buffer te wassen.</li>
	<li>Voeg mOrange-Nano (zie Materiaaltabel) toe tot een eindconcentratie van 200 nM en houd het monster in het donker door het af te dekken met aluminiumfolie.</li>
	<li>Plaats het μ-glaasje onder de fluorescentiemicroscoop en pas de beeldvormingsinstellingen aan. Stel de 552 nm laser in voor excitatie van mOrange-Nano. Pas het zendbereik aan om het mOrange-signaal te optimaliseren. De fotoactivering van disiLID wordt bereikt met een laser van 488 nm, met behulp van lichtpulsen met intervallen van 2,58 s.</li>
</ol>3. Voorbereiding van GUV's
<ol><li>Bereid een 5% (m/v) oplossing van polyvinylalcohol (PVA, zie materiaaltabel) (MW: 145 000 g/mol) met 100 mM sucrose in ultrapuur water en meng deze gedurende een nacht bij 80 °C bij 400 omw/min.</li>
	<li>Bereid een lipideoplossing in chloroform met de gewenste samenstelling (eindconcentratie 10 mg/ml). Voor deze methode wordt een samenstelling aanbevolen die bestaat uit 10 mg/ml POPC, 10 mol% 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfo-(1'-rac-glycerol) (POPG), 2 mol% DOPE-biotine en 1 mol% DiD (zie materiaaltabel).</li>
	<li>Bereid GUV's voor met de hydratatietechniek 7,8. Verdeel eerst 40 μL van de bereide PVA-oplossing als een homogene dunne laag op een glasplaatje van 60 mm x 24 mm, bij voorkeur met een pipetpunt. Droog vervolgens de dunne laag 30 minuten bij 50 °C.</li>
	<li>Smeer 5 μL van de lipidenoplossing met een naald op de PVA-laag en laat 1 uur drogen bij 30 °C.</li>
	<li>Monteer een kamer op de gefunctionaliseerde glasplaat met behulp van een afstandhouder (~40 mm × 24 mm × 2 mm, zie Materiaaltabel) en een tweede glasplaatje.</li>
	<li>Voeg 1 ml rehydratatiebuffer (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl) toe aan de kamer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur om GUV's te vormen. Keer na 1 uur de kamer om en tik zachtjes met een pipetpunt op de glasoppervlakken.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig het glasplaatje aan één kant om de gebouwde kamer te openen en oogst de GUV's met een pipet.</li>
	<li>Doe de oplossing in een plastic buisje en laat de GUV's 2 uur bezinken.</li>
</ol>4. mOrange-Nano Recruitment om gefunctionaliseerde GUV's te onderscheiden
<ol><li>Voeg een oplossing van SAv toe aan de vers geoogste GUV's en laat 30 minuten op kamertemperatuur staan. OPMERKING: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd met beschermend rood licht om fotoactivering van disiLID te voorkomen.</li>
	<li>Voeg 1 μM b-disiLID toe aan de GUV-oplossing en plaats het monster 30 minuten in het donker en dek het af met aluminiumfolie.</li>
	<li>Behandel een glazen bodemkamer met 18 putjes μ glaasjes gedurende 10 minuten met 150 μL BSA-oplossing (3% m/v in water). Verwijder vervolgens de BSA-oplossing en was de putjes 3 keer met 150 μL ultrapuur water.</li>
	<li>Voeg 145 μL 200 nM mOrange-Nano in buffer (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl) toe aan het putje.</li>
	<li>Voeg vervolgens 5 μL GUV's versierd met b-disiLID toe aan de oplossing en wacht ~15 minuten totdat de GUV's zijn bezonken.</li>
	<li>Plaats het μ-glaasje onder de confocale microscoop. Prikkel het monster bij 552 nm om mOrange (λex = 557 nm; λem = 576 nm) fluorescentie te visualiseren en bij 638 nm om DiD (λex = 644 nm; λem = 665 nm) in de GUV-membranen te visualiseren. De mOrange-Nano-rekrutering wordt elke 5,3 s geactiveerd met blauwlichtpulsen (488 nm, intensiteit 1%) om ongewenste fotobleekeffecten te minimaliseren. OPMERKING: De excitatiegolflengten kunnen worden aangepast op basis van het type microscoop dat wordt gebruikt. Andere veel voorkomende excitatiegolflengten die beschikbaar zijn voor microscopen zijn ook 532 nm of 561 nm en 633 nm, 647 nm, 639 nm of 640 nm lasers.</li>
</ol>

Lichtgestuurde omkeerbare eiwitpatronen op lipidemembranen

<ol><li>Kretschmer, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+on+membranes+and+its+role+in+bacterial+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern formation on membranes and its role in bacterial cell division.</a> Curr Opin Cell Biol. 38, 52-59 (2016).</li>
<li>Yang, H. W., Collins, S. R., Meyer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locally+excitable+Cdc42+signals+steer+cells+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Locally excitable Cdc42 signals steer cells during chemotaxis.</a> Nat Cell Biol. 18 (2), 191-201 (2016).</li>
<li>Caldwell, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optochemical+control+of+protein+localization+and+activity+within+cell-like+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Optochemical control of protein localization and activity within cell-like compartments.</a> Biochem. 57 (18), 2590-2596 (2018).</li>
<li>Kennedy, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).</li>
<li>Guntas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+an+improved+light-induced+dimer+%28iLID%29+for+controlling+the+localization+and+activity+of+signaling+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins.</a> Proc Natl Acad Sci. 112 (1), 112-117 (2015).</li>
<li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461 (7266), 997-1001 (2009).</li>
<li>Bartelt, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+blue+light-switchable+protein+patterns+on+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">Dynamic blue light-switchable protein patterns on giant unilamellar vesicles.</a> Chem Commun. 54 (8), 948-951 (2018).</li>
<li>Di Iorio, D., Bergmann, J., Higashi, S. L., Hoffmann, A., Wegner, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+disordered+tether+to+iLID+improves+photoswitchable+protein+patterning+on+model+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">A disordered tether to iLID improves photoswitchable protein patterning on model membranes.</a> Chem. Commun. 59 (29), 4380-4383 (2023).</li>
<li>Hartzell, E. J., Terr, J., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+blue+light+inducible+Spytag+system+%28BLISS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Engineering a blue light inducible Spytag system (BLISS).</a> J Am Chem Soc. 143 (23), 8572-8577 (2021).</li>
<li>Xu, D., Bartelt, S. M., Rasoulinejad, S., Chen, F., Wegner, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+light+lithography%3A+a+general+strategy+to+create+active+protein+and+cell+micropatterns%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Horiz%22%5BJournal%5D)">Green light lithography: a general strategy to create active protein and cell micropatterns.</a> Mater Horiz. 6 (6), 1222-1229 (2019).</li>
<li>Jia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+printing+of+protein+structures+on+membranes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Light-induced printing of protein structures on membranes in vitro.</a> Nano Lett. 18 (11), 7133-7140 (2018).</li>
<li>Di Iorio, D., Verheijden, M. L., vander Vries, E., Jonkheijm, P., Huskens, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Weak+Multivalent+Binding+of+influenza+hemagglutinin+nanoparticles+at+a+sialoglycan-functionalized+supported+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Weak Multivalent Binding of influenza hemagglutinin nanoparticles at a sialoglycan-functionalized supported lipid bilayer.</a> ACS Nano. 13 (3), 3413-3423 (2019).</li>
<li>Kasahara, M., Torii, M., Fujita, A., Tainaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMN+binding+and+photochemical+properties+of+plant+putative+photoreceptors+containing+two+LOV+domains%2C+LOV%2FLOV+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">FMN binding and photochemical properties of plant putative photoreceptors containing two LOV domains, LOV/LOV proteins.</a> J Biol Chem. 285 (45), 34765-34772 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We hebben een methode beschreven voor de gelokaliseerde rekrutering van mOrange-Nano-eiwitten op modelmembranen, zoals ondersteunde lipidedubbellaag en gigantische unilamellaire blaasjes door gebruik te maken van het fotoschakelbare eiwit disiLID8. Aspecten die bijdragen aan de kwaliteit van het patroon zijn onder andere de kwaliteit van de eiwitten en de goede kwaliteit van SLB's en GUV's.
Om een goede eiwitkwaliteit na expressie en zuivering te garanderen, is het belangrijk om eerst de fotoschakelbare eigenschappen van disiLID te evalueren. Daartoe moet de absorptie van de FMN-cofactor worden gemeten in het donker en na verlichting met blauw licht. Van UV-VIS spectra van disiLID wordt verwacht dat ze de kenmerkende drievoudige piek van de cofactor FMN in het donker vertonen, die aanzienlijk afneemt bij verlichting met blauw licht en zich herstelt in het donker13. Dit fotoschakelbare gedrag is cruciaal voor het verkrijgen van reproduceerbare en omkeerbare rekrutering in de volgende stappen. Het werken met beschermend rood licht en het blootstellen van disiLID aan minimale externe verlichting tijdens de voorbereiding van de monsters verhoogt de prestaties van de experimenten.
Een andere cruciale stap, en misschien wel de meest cruciale, is de vorming van de juiste SLB's. Defecten in de membranen en/of de vorming van inhomogene SLB's (d.w.z. de aanwezigheid van meerlaagse of gepatchte SLB's) zullen de kwaliteit van het eiwitpatroon beïnvloeden. Daarom wordt voor onervaren gebruikers aanbevolen om het protocol te reproduceren door de SUV's te labelen met enkele membraankleurstoffen, zoals DiD en DiO, om fluorescerend gelabelde SLB's te vormen. Op deze manier kunnen de eigenschappen en kwaliteit van SLB's goed worden gekarakteriseerd met fluorescentiemicroscopie. FRAP-metingen vertegenwoordigen een typische benadering voor het beoordelen van de kwaliteit van een SLB door de vloeibaarheid van de membranen te evalueren. Als alternatief, in het geval van gebiotinyleerde SLB's zoals beschreven in dit protocol, kan fluorescerend gelabeld SAv (bijv. Atto 488-SAv) worden gebruikt om de kwaliteit van SLB's te visualiseren en te beoordelen.
Het eerste deel van het protocol beschrijft de vorming van patronen op SLB's. Om een optimaal resultaat te garanderen, is het belangrijk om mOrange-Nano op de SLB's toe te voegen en het monster 15 minuten in het donker te laten incuberen. Tijdens de fotoactivatie is de selectie van de ROI niet beperkt tot een specifieke grootte. De laserintensiteit en belichtingstijd moeten echter worden geregeld om ongewenste fotobleking van de fluorescerende eiwitten te verminderen.
Deze methode is niet beperkt tot gebiotinyleerde eiwitten en andere benaderingen kunnen worden gebruikt om disiLID aan SLB's te verankeren. His-gelabelde disiLID kan bijvoorbeeld tot expressie worden gebracht en worden verankerd op Ni-NTA-bevattende SLB's. Het is echter van cruciaal belang om Nano en disiLID met verschillende tags uit te drukken om vervanging van de eiwitten op de SLB's te voorkomen. Deze methode biedt ook de mogelijkheid om de volgorde van de eiwitten om te keren, waardoor SLB's worden gefunctionaliseerd met Nano en disiLID (of disiLID-gefuseerde eiwitten) worden gerekruteerd bij blauwlichtverlichting.
Voor dynamische controle van eiwitlokalisatie moet de omkeerbare lokalisatie van het eiwit in het geselecteerde gebied herhaaldelijk mogelijk zijn. Om dit te bereiken, is de concentratie van Nano (200 nM) in de oplossing een kritische parameter om een hoge reversibiliteit te verkrijgen.
Een ander punt van zorg is de rekrutering van Nano naar het disiLID-gefunctionaliseerde GUV-oppervlak. Net als in het geval van eiwitpatronen op SLB's, kan deze methode worden uitgebreid naar verschillende membraanfunctionalisatiestrategieën. In dit protocol werd de hele GUV verlicht met blauw licht om mOrange-Nano op het hele GUV-oppervlak te rekruteren. De selectie van kleine ROI's gelokaliseerd op het GUV-membraan zou echter moeten leiden tot de precieze lokalisatie van eiwitten in een beperkter gebied.
Deze methode biedt slechts een beperking met betrekking tot de keuze van de fluorofoor die wordt gebruikt voor beeldvorming van de nano-rekrutering op het membraan van de SUV's of GUV's. Met name fluoroforen met een excitatiespectrum in het blauwlichtbereik moeten worden vermeden, omdat het gebruik ervan de fotoactivering van (dis)iLID zal verstoren. Daarom wordt de keuze van fluoroforen in het groene of roodlichtbereik (bijv. mOrange of Cy5) aanbevolen voor dit soort experimenten.
Het disiLID-ontwerp biedt een eenvoudige en aanpasbare manier om de lokale eiwitrekrutering naar membranen te verbeteren en verbreedt het dynamische bereik van iLID en Nano van optogenetica4. Deze methoden richten zich op de rekrutering van Nano op nabootsende membranen zoals lipidedubbellagen en GUV's. Nochtans is deze benadering uit te breiden naar de talrijke optogenetische hulpmiddelen in cellen waar (dis)iLID of Nano gekoppeld zijn aan een membraan.

De vorming van eiwitpatronen op celmembranen binnen subcellulaire regio's geeft aanleiding tot tal van biologische processen, waaronder migratie, deling en gelokaliseerde cel-tot-celcommunicatie 1,2. Deze eiwitpatronen worden gereguleerd in ruimte en tijd en zijn zeer dynamisch. Het repliceren van dergelijke eiwitpatronen in synthetische cellen is essentieel voor het nabootsen van cellulaire processen die daaruit voortvloeien en voor het verkrijgen van een beter begrip van hoe een dergelijke regulatie op moleculair niveau werkt. Analoog aan wat wordt waargenomen voor membranen in levende cellen, moeten methoden voor het genereren van eiwitpatronen op kunstmatige membranen hun dynamiek vastleggen en nauwkeurige spatiotemporele controle bieden.
Van de verschillende stimuli onderscheidt licht zich door het bieden van de hoogste spatiotemporele controle en verschillende extra voordelen3. Door regeling met licht is het eenvoudig om een gewenst gebied op elk gewenst moment met ongeëvenaarde precisie te verlichten. Bovendien zorgt licht voor een hoge afstembaarheid, omdat zowel de lichtintensiteit als de pulsduur kunnen worden aangepast. Bovendien is zichtbaar licht onschadelijk voor biomoleculen, waaronder eiwitten, en is het zelfs mogelijk om meerdere functionaliteiten met verschillende golflengten aan te spreken. Vandaar dat lichtresponsieve benaderingen op basis van zichtbaar licht naar voren komen als veelbelovende wegen voor de gecontroleerde en biorthogonale regulatie van eiwitpatronen in ruimte en tijd 4,5,6. Door gebruik te maken van fotoschakelbare eiwitparen uit de optogenetica, die fungeren als lichtinduceerbare dimerizers, biedt het een eenvoudige methode om specifieke eiwitten naar membranen te rekruteren. In het bijzonder zijn met succes eiwitpatronen gevormd op kunstmatige membranen met behulp van de door blauw licht getriggerde interactie tussen iLID (verbeterd licht-induceerbaar dimeer, gebaseerd op het fotoschakelbare LOV2-domein van Avena sativa) en Nano (wild-type SspB)7,8, het blauw licht-induceerbare SpyTag-systeem (BLISS)9, het groenlicht-responsieve eiwittetrameer CarH10 en de rood-licht-induceerbare interactie tussen PhyB en PIF611.
Het is aangetoond dat de fotoschakelbare interactie tussen iLID en Nano5 kan worden gebruikt om eiwitten op modelmembranen te fotopatronen met behulp van blauw licht7. De iLID/Nano-interactie is omkeerbaar in het donker, zeer specifiek en werkt onder fysiologische omstandigheden. Door iLID te verankeren op lipidemembraanmodellen, zoals gigantische unilamellaire blaasjes (GUV's) of ondersteunde lipidedubbellagen (SLB's), kan lichtgereguleerde rekrutering van Nano naar deze membranen worden gemaakt, wat omkeerbaar is in het donker. We hebben met name waargenomen dat het introduceren van een ongeordend domein aan de N-terminus van iLID (resulterend in een eiwit met de naam disiLID) als een ketting aan een modellipidemembraan de efficiëntie van nano-rekrutering en de reversiedynamiek verbetert8.
Door gebruik te maken van de disiLID/Nano-interactie hebben we een methode ontwikkeld voor het genereren van contrastrijke patronen van Nano-gefuseerde eiwitten van belang (POI) op SLB's en de externe membranen van GUV's. Deze methode maakt het mogelijk om binnen enkele minuten eiwitpatronen te creëren met een opmerkelijke ruimtelijke en temporele resolutie en een hoge omkeerbaarheid. Het gedetailleerde protocol schetst het proces voor het lokaal rekruteren van eiwitten op kunstmatige membranen. Dit wordt met name bereikt door een gebiotinyleerde versie van disiLID op SLB's en GUV's te immobiliseren via de biotine-streptavidine (SAv) interactie. Vervolgens wordt fluorescerend gelabeld Nano (mOrange-Nano) gerekruteerd naar deze disiLID gefunctionaliseerde membranen onder blauwlichtverlichting. Ons experimentele protocol biedt een eenvoudige en aanpasbare aanpak voor het bereiken van gelokaliseerde eiwitrekrutering naar membranen. Belangrijk is dat deze methodologie niet beperkt is tot de gerapporteerde SLB- en GUV-interfaces of mOrange-Nano; het kan worden uitgebreid naar andere disiLID-gefunctionaliseerde materialen en eiwitten die zijn gefuseerd met Nano.

<table><tbody><tr><td>&micro;-Slide 18 Well</td><td>Ibidi</td><td>81817</td><td>Voor SLB-voorbereiding</td></tr><tr><td>25 &micro;L Microliter Syringe&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>Model 702 N</td><td>Voor de bereiding van lipidenmengsel en het uitspreiden van de lipidenoplossing op de PVA-laag</td></tr><tr><td>Biotinyl Cap PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl)) (natriumzout)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870273C</td><td>Voor SUVs-voorbereiding</td></tr><tr><td>CaCl2 (Calciumchloride)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>Voor SLB-vorming</td></tr><tr><td>Dekvlakken 24 mm x 60 mm</td><td>Engelbrecht</td><td>K12460</td><td>Voor GUVs-vorming</td></tr><tr><td>DiD (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'- Tetramethylindodicarbocyanine)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>D7757</td><td>Membraankleurstof</td></tr><tr><td>disiLID</td><td></td><td></td><td>Volgorde: MGGSGLNDIFEAQKIEWHEGGSH HHHHHGSMAATELRGVVGPGPAA IAALGGGGAGPPVGGGGGRGDA GPGSGAASGTVVAAAAGGPGPG AGGVAAAGPPAPPTGGSGGSGA GGSGSAGEFLATTLERIEKNFVIT DPRLPDNPIIFASDSFLQLTEYSR EEILGRNCRFLQGPETDRATVRK IRDAIDNQTEVTVQLINYTKSGKK FWNVFHLQPMRDYKGDVQYFIG VQLDGTERLHGAAEREAVMLIKK TAFQIAEAANDENYF</td></tr><tr><td>DOPC (1,2-di-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375P</td><td>Voor SUVs-lipidensamenstelling</td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind microcentrifugebuisjes</td><td>Merk</td><td>EP0030108116-100EA</td><td>Voor het verzamelen van vers gemaakte GUVs</td></tr><tr><td>mOrange-Nano</td><td></td><td></td><td>Volgorde: MRGSHHHHHHGSKIEEGKLVI WINGDKGYNGLAEVGKKFEKDT GIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATG DGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLA EITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYN GKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNP PKTWEEIPALDKELKAKGKSALM FNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKY ENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTF LVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFN KGETAMTINGPWAWSNIDTSKVN YGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSA GINAASPNKELAKEFLENYLLTDE GLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELA KDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQM SAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEA LKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGI EGTTENLYFQGSVSKGEENNMAI IKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIE GEGEGRPYEGFQTAKLKVTKGG PLPFAWDILSPQFTYGSKAYVKH PADIPDYFKLSFPEGFKWERVMN FEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYK VKLRGTNFPSDGPVMQKKTMG WEASSERMYPEDGALKGEIKMR LKLKDGGHYTSEVKTTYKAKKPV QLPGAYIVGIKLDITSHNEDYTIVE QYERAEGRHSTGGMDELYKGG SGTSSPKRPKLLREYYDWLVDN SFTPYLVVDATYLGVNVPVEYVK DGQIVLNLSASATGNLQLTNDFIQ FNARFKGVSRELYIPMGAALAIYA RENGDGVMFEPEEIYDELNIG</td></tr><tr><td>NaCl (Natriumchloride)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>Voor buffer</td></tr><tr><td>NaOH (Natriumhydroxide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1064980500</td><td>Voor oppervlakteactivering bij SLB-vorming</td></tr><tr><td>POPC (1-Palmitoyl-2- oleoylphosphatidylcholine)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457C</td><td>Voor GUVs-lipidensamenstelling</td></tr><tr><td>PVA (Polyvinylalcohol) volledig gehydrolyseerd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8148940101</td><td>Voor GUVs-vorming</td></tr><tr><td>SP8 confocale laserscanningmicroscoop</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine</td><td>TermoFisher</td><td>434301</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>84097</td><td>Voor GUVs-vorming</td></tr><tr><td>Tris hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10812846001</td><td>Voor buffer</td></tr></tbody></table>

dynamische door licht geïnduceerde eiwitpatronen bij modelmembranen

Dynamic Light-Induced Protein Patterns at Model Membranes

De precieze lokalisatie en activering van eiwitten op het celmembraan op een bepaald moment geeft aanleiding tot vele cellulaire processen, waaronder celpolarisatie, migratie en deling. Methoden om eiwitten te rekruteren om membranen te modelleren met subcellulaire resolutie en hoge temporele controle zijn dus essentieel bij het reproduceren en beheersen van dergelijke processen in synthetische cellen. Hier wordt een methode beschreven voor het fabriceren van lichtgereguleerde omkeerbare eiwitpatronen op lipidemembranen met hoge spatiotemporele precisie. Voor dit doel immobiliseren we het fotoschakelbare eiwit iLID (verbeterd lichtinduceerbaar dimeer) op ondersteunde lipidedubbellagen (SLB's) en op het buitenmembraan van gigantische unilamellaire blaasjes (GUV's). Bij lokale verlichting van blauw licht bindt iLID zich aan zijn partner Nano (wildtype SspB) en maakt het de rekrutering mogelijk van elk eiwit van belang (POI) dat met Nano is gefuseerd van de oplossing naar het verlichte gebied op het membraan. Deze binding is omkeerbaar in het donker, wat zorgt voor een dynamische binding en release van de POI. Over het algemeen is dit een flexibele en veelzijdige methode voor het reguleren van de lokalisatie van eiwitten met hoge precisie in ruimte en tijd met behulp van blauw licht.

De beschreven procedures maken de vorming van SLB's mogelijk om mOrange-Nano op de synthetische membranen te rekruteren. De vorming van gedefinieerd mOrange-Nano patroon op de SLB's gefunctionaliseerd met b-disiLID wordt weergegeven in figuur 1A. Aangezien een vierkant (24 μm × 24 μm) interessegebied (ROI) op de SLB wordt verlicht met 488 nm blauw licht, wordt een snelle toename van het fluorescentiesignaal waargenomen in het mOrange-kanaal (weergegeven in rood) in de ROI binnen 200 s. Het patroon vertoont zeer gedefinieerde en scherpe randen (Figuur 1B), wat wijst op een hoge ruimtelijke controle over het fotoactieve gebied. De interactie is snel en volledig omkeerbaar omdat de verlichting met blauw licht wordt onderbroken. Deze methode maakt ook de vorming van patronen over verschillende verlichtingscycli mogelijk (Figuur 2). Afwisselende cycli van ~200 s blauw licht en 200 s donker leiden tot omkeerbare rekrutering van mOrange-Nano in het geselecteerde gebied gedurende meerdere keren met vergelijkbare waarden van Δ-intensiteit van fluorescentie in de patronen.
Figuur 3 toont de schematische weergave van de voorbereiding van de GUV's. De rekrutering van mOrange-Nano wordt ook waargenomen op GUV's. Er wordt aangetoond dat GUV's die in het donker zijn geplaatst, geen mOrange-fluorescentie vertonen (Figuur 4A). Omdat de GUV's wereldwijd worden verlicht met blauw licht, wordt mOrange-fluorescentie waargenomen, die colokaliseert met de GUV-membraankleurstof (DiD). De interactie is zeer omkeerbaar omdat de verlichting is beëindigd. De kwantificering van de mOrange-intensiteit op het GUV-membraan in de tijd toont de snelle en effectieve rekrutering van eiwitten en de volledige reversibiliteit (Figuur 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66531/66531fig01.jpg"> Figuur 1: Fluorescentiemicroscopiebeelden van SLB's gefunctionaliseerd met b-disiLID. De fluorescentiebeelden in aanwezigheid van mOrange-Nano voor (A) en tijdens (B) lokale blauw licht (488 nm) verlichting in de ROI. Schaalbalk = 20 μm. (C) Fluorescentie-intensiteit van mOrange gemeten in de ROI voor SLB's gefunctionaliseerd met b-disiLID (bij = 200 s). De figuur is een bewerking van Di Iorio et al.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66531/66531fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66531/66531fig02v3.jpg"> Figuur 2: Fluorescentie-intensiteit van mOrange gerekruteerd in de ROI op SLB's versierd met b-disiLID gedurende drie rekruteringscycli. Na elke fotoactiveringsstap nam de mOrange-Nano-fluorescentie toe binnen de ROI. Het patroon bereikt verzadiging binnen 120 s en de fluorescentie neemt af binnen 120 s, bijna tot achtergrondniveaus. Er wordt geen verlies van patroonkwaliteit waargenomen over verschillende cycli van blauw licht en donker. De figuur is een bewerking van Di Iorio et al.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66531/66531fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66531/66531fig03v2.jpg"> Figuur 3: Schematische weergave van de bereiding van GUV's met behulp van de zachte hydratatiemethode. Het schema biedt een visuele weergave van de verschillende stappen en van de kamer die is gebouwd met behulp van twee glasplaatjes en een afstandhouder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66531/66531fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66531/66531fig04.jpg"> Figuur 4: Fluorescentiemicroscopiemetingen van de lichtafhankelijke rekrutering van mOrange-Nano op GUV-membranen. (A) Fluorescentiebeelden van een disiLID-gefunctionaliseerde GUV in aanwezigheid van mOrange-Nano. In groen is de membraankleurstof van de GUV's en in rood is de mOrange-fluorescentie voor, tijdens en na de verlichting van blauw licht. Schaalbalken = 10 μm. (B) Fluorescentie-intensiteit van mOrange gelokaliseerd op GUV in de loop van de tijd. Bij verlichting bereikt de mOrange-fluorescentie (weergegeven in rood) op het lipidemembraan binnen 60 s de maximale intensiteit, met een 5,9-voudige toename van de fluorescentie-intensiteit. Als de verlichting wordt gestopt, neemt de mOrange-fluorescentie binnen 60 s af tot bijna voorverlichtingswaarden (met een herstel van 90%). De figuur is een bewerking van Di Iorio et al.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66531/66531fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Hier wordt een protocol beschreven voor het genereren van lichtgereguleerde en omkeerbare eiwitpatronen met hoge spatiotemporele precisie bij kunstmatige lipidemembranen. De methode bestaat uit de gelokaliseerde fotoactivering van het eiwit iLID (verbeterd lichtinduceerbaar dimeer) geïmmobiliseerd op modelmembranen dat, onder blauw licht, bindt aan zijn partnereiwit Nano (wildtype SspB).

Dynamische door licht geïnduceerde eiwitpatronen bij modelmembranen

The precise localization and activation of proteins at the cell membrane at a certain time gives rise to many cellular processes, including cell ...

In ons werk streven we ernaar om cellulaire processen te reproduceren in kunstmatige celachtige modellen die de precieze lokalisatie van eiwitten op een bepaalde plek op een bepaald moment vereisen. Hier demonstreren we als voorbeeld de vorming van dynamische eiwitpatronen op modellipidemembranen met hoge precisie en hoge ruimtelijke temporele controle met behulp van fotoschakelbare eiwitten en zichtbaar licht. Een van de huidige experimentele uitdagingen bestaat uit het reproduceren van dynamische eiwitpatronen op modellipidemembranen.Hier moeten we deze eiwitpatronen snel en omkeerbaar met hoge precisie manipuleren op een biocompatibele en niet-invasieve manier. We gebruiken fotoschakelbare eiwitten om interessante eiwitten te rekruteren en te patronen op ondersteunde lipidedubbellagen en gigantische unilamellaire blaasjes. We bereiken een snelle en gelokaliseerde eiwitrekrutering, en het eiwitpatroon is volledig omkeerbaar in het donker en kan meerdere keren worden herhaald.In ons protocol gebruiken we zichtbaar licht om eiwitpatronen te vormen. Licht is een aantrekkelijke trigger om interacties te regelen met een hoge spatiotemporele resolutie en afstembaarheid. Licht is ook niet invasief en beschadigt biomoleculen niet.

dynamic-light-induced-protein-patterns-at-model-membranes

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Hier wordt de bereiding van eiwit-gefunctionaliseerde planaire glas-ondersteunde lipide bilayers, de bepaling van eiwitmobiliteit binnen en de meting van eiwitdichtheden getoond. Een routekaart voor het bouwen van een ruisonderdrukte Total Internal Reflection microscoop wordt geschetst, die het mogelijk maakt om enkele bilayer-residente fluorochromen met hoge ruimtelijk-temporele resolutie te visualiseren.

Single Molecule Fluorescentie Microscopie op Ondersteunde Planar dubbellagen

Wij presenteren een protocol glas functionaliseren met nanometrische eiwit pleisters omgeven door een vloeibare lipide dubbellaag. Deze substraten zijn compatibel met geavanceerde optische microscopie en zullen naar verwachting om te dienen als platform voor celadhesie en migratie studies.

Ligand Nano-cluster Arrays in een ondersteunde lipide dubbellaag

Veel eiwitten voeren hun functie uit wanneer ze aan membraanoppervlakken zijn gehecht. De binding van extrinsieke eiwitten op nanodisc-membranen kan indirect worden afgebeeld door transmissie-elektronenmicroscopie. We laten zien dat de karakteristieke stapelvorming (rouleau) van nanodiscs, veroorzaakt door de negatieve kleuring natriumfosfowolframaat, wordt voorkomen door de binding van extrinsiek eiwit.

Methode om te visualiseren en te analyseren Membrane interagerende eiwitten door Transmission Electron Microscopy

Wij bieden een protocol voor in vitro zelforganisatie testen van geest en mij op een ondersteunde lipide dubbelgelaagde in een open huis. Daarnaast beschrijven we hoe omsluiten de bepaling in lipide-geklede PDMS microcompartments na te bootsen in vivo voorwaarden door reactie opsluiting.

In Vitro Reconstructie van het zelf-organiserende eiwit patronen op ondersteunde lipide Bilayers

Ons algemene doel is om te begrijpen hoe cellen extracellulaire signalen voelen die leiden tot gerichte axonale groei. Hier beschrijven we de methodologie van licht-geïnduceerde moleculaire adsorptie van eiwitten, gebruikt om gedefinieerde micro-patronen van extracellulaire matrix componenten te produceren om specifieke gebeurtenissen te bestuderen die axon-uitgroei en pathfinding beheersen.

Lichtgeïnduceerde moleculaire adsorptie van eiwitten met behulp van het PRIMO-systeem voor micro patronen om Celresponsen te bestuderen op extracellulaire matrix eiwitten

Mitochondriale fusie is een belangrijke homeostatische reactie die ten grondslag ligt aan mitochondriale dynamiek. Hier beschreven is een in vitro reconstitution systeem om mitochondriale binnenmembraan fusie die membraan tethering, docking, hemifusion, en porie opening kan oplossen. De veelzijdigheid van deze aanpak bij het verkennen van celmembraansystemen wordt besproken.

Een modelmembraanplatform voor het reconstrueren van mitochondriale membraandynamica

Dit artikel beschrijft de protocollen voor monstervoorbereiding, gegevensreductie en gegevensanalyse in neutronenspinecho (NSE) studies van lipidemembranen. Verstandige deuteriumetikettering van lipiden maakt toegang tot verschillende membraandynamiek op mesoscopische lengte- en tijdschalen mogelijk, waarover vitale biologische processen plaatsvinden.

Neutron Spin Echo Spectroscopie als een unieke sonde voor lipidemembraandynamiek en membraan-eiwitinteracties

Dit protocol beschrijft een iSCAT-gebaseerde beeldverwerking en single-particle tracking-benadering die het gelijktijdige onderzoek van de moleculaire massa en het diffusieve gedrag van macromoleculen die interageren met lipidemembranen mogelijk maakt. Stapsgewijze instructies voor monstervoorbereiding, massa-naar-contrastconversie, filmacquisitie en nabewerking worden gegeven naast aanwijzingen om mogelijke valkuilen te voorkomen.

Massagevoelige deeltjestracking om membraangeassocieerde macromolecuuldynamica te karakteriseren

Dit protocol beschrijft hoe TIRF-microscopie kan worden gebruikt om individuele ionkanalen te volgen en hun activiteit in ondersteunde lipidemembranen te bepalen, waardoor het samenspel tussen laterale membraanbeweging en kanaalfunctie wordt gedefinieerd. Het beschrijft hoe de membranen moeten worden voorbereid, de gegevens moeten worden vastgelegd en de resultaten moeten worden geanalyseerd.

Single-Molecule Imaging van Laterale Mobiliteit en Ion Channel Activity in Lipid Bilayers met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopie

De diversiteit van membraanlipiden in structuur en samenstelling levert een belangrijke bijdrage aan cellulaire processen en kan een marker van ziekte zijn. Moleculaire dynamica-simulaties stellen ons in staat om membranen en hun interacties met biomoleculen met atomistische resolutie te bestuderen. Hier bieden we een protocol voor het bouwen, uitvoeren en analyseren van complexe membraansystemen.

Realistische membraanmodellering met behulp van complexe lipidenmengsels in simulatiestudies

Er wordt een experimenteel protocol gepresenteerd om gramicidine A-gedoopeerde druppelinterface-dubbellagen samen te stellen, elektrisch te stimuleren en te analyseren. Relaties tussen lipide-eiwitstructuur en -functie worden gekwantificeerd door veranderingen in membraanoppervlakte, ionische flux en enkelkanaalgeleidbaarheid te meten, en deze responsen te relateren aan plasticiteitsachtige veranderingen in ionische geleiding in een membraanmodel geïnspireerd door elektrische synapsen.

Lipid-eiwitmembraan structuur-functie karakterisering met behulp van druppelinterface-dubbellagen

Leer licht-gereguleerde eiwitpatronen op kunstmatige lipide membranen met hoge precisie. Deze methode gebruikt fotoschakelbare iLID-eiwitten voor reversibele patroonvorming op ondersteunde lipide bilagen en reuze unilamellaire vesikels.

Dynamische door licht geïnduceerde eiwitpatronen bij modelmembranen

Meer video's verkennen