Name: Niet-destructieve op SPE-UPLC gebaseerde kwantificering van aflatoxinen en stilbenoïde fytoalexinen in enkele pindas (Arachis spp.) Zaden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-19T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Leer een UPLC-methode voor kwantificering van aflatoxinen en stilbenoïde fytoalexinen in enkele pinda's (Arachis spp.). Deze techniek ondersteunt screening op resistentie tegen Aspergillus.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk ontving de financiële steun van USDA-ARS CRIS project 6044-42000-011-00D en CRIS project 6044-21000-005-000-D. We danken Dan Todd voor het maken van het rek met minikolommen. De vermelding van handelsnamen of commerciële producten in dit artikel is uitsluitend bedoeld om specifieke informatie te verstrekken en impliceert geen aanbeveling of onderschrijving door het Amerikaanse ministerie van Landbouw.

1. Voorbereiding van zaden voor schimmelprovocatie
<ol><li>Incubeer de afplatoxigene Aspergillus flavus NRRL 3357 op een scheutje aardappeldextrose-agar (PDA) in een reageerbuis gedurende 6 dagen bij 30 °C. Oogst schimmelsporen uit de reageerbuis met 10 ml water met Tween 20 (100 μL Tween in 1 L gedestilleerd steriel water), filtreer door glaswol in een trechter en tel de sporen met een hemocytometer volgens de gebruikershandleiding.</li>
	<li>Verdun de sporensuspensie met steriel water tot een concentratie van 1.000 sporen/μL. Bevestig de concentratie met een hemocytometer. OPMERKING: Bereid de sporensuspensie niet eerder dan 2 uur voor de uitdagende experimenten voor.</li>
	<li>Breek de pindapeulen voorzichtig en verwijder de schillen. Doe de zaden in een steriel bekerglas zodat het volume van het zaad niet groter is dan 1/5 van het volume van het bekerglas, voeg 0,05% waterstofperoxideoplossing toe aan ongeveer 70% van het volume van het bekerglas en laat de zaden gedurende 3 uur water in zich opnemen.</li>
	<li>Decanteer de waterstofperoxide-oplossing uit de zaden en voeg ongeveer 3x de hoeveelheid 80% ethanol-watermengsel (v/v) toe aan het bekerglas om de zaden te bedekken. Laat 1 minuut staan en spoel de zaden vervolgens 2x af met gelijke volumes steriel gedestilleerd water.</li>
	<li>Voeg een 5-voudig volume 3% waterstofperoxide toe aan het bekerglas met de met ethanol gesteriliseerde zaden en laat 5 minuten staan, decanteer vervolgens de vloeistof en spoel de zaden twee keer af met gelijke volumes steriel water (Figuur 2A).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig2.jpg"> Figuur 2: Bereiding van pindazaden voor inoculatie, incubatie en extractie van aflatoxine- en fytoalexinefracties. (A) Steriliseren van opgenomen zaden met 3% waterstofperoxide; (B) het verwijderen van testa (huid) van zaden; (C) het afsnijden van het deel van de embryonale as; (D,E) het boren van een holte in een halve zaadlob met een boor; F) het plaatsen van geboorde delen van zaden op agar; (G) het aanbrengen van schimmelsporen in de geboorde holte. H) petrischaaltje met zaden na incubatie; (I) het plaatsen van geïncubeerde enkelvoudige zaden (foto van controlemonsters) in versterkte parelbuisjes; (J) toevoeging van het gemeten volume van het extractieoplosmiddel; (K) het verpulveren van monsters in een parelruptor; (L) centrifugeren van verpulverde drijfmest. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<ol start="6"><li>Leg de zaden op een steriele papieren handdoek, verwijder de zaadtesta met een tang en snijd ongeveer 1/3 van het zaad met de embryonale as af met een scalpel (Figuur 2B,C).</li>
	<li>Gooi dit deel van het zaad weg of gebruik het om een plant te laten groeien in een reageerbuis met groeimedium (Figuur 1B,E).</li>
	<li>Verdeel het resterende deel van het zaad in twee zaadlobben, plaats ze in een petrischaaltje, bedek de zaaddelen met vochtig steriel filtreerpapier, plaats het deksel terug om uitdroging te voorkomen en ga onmiddellijk verder met de inoculatiestap.</li>
	<li>Voordat u de uitdagende experimenten uitvoert, bereidt u een voldoende aantal petrischaaltjes met zaadincubatiemedium door 26 ml 1,5% steriele agar in water in de schaaltjes van 100 x 15 mm te gieten en ze een nacht te laten stollen.</li>
	<li>Maak in het midden van de buitenzijde van elke overgebleven zaadlob een holte van 1,5-2 mm diep door het zaad handmatig te boren met een steriele scherpe boor met een diameter van 1,6-2,34 mm. Het duurt ~2-5 s om een holte te maken (Figuur 2D, E).</li>
	<li>Doe 4 tot 6 "geboorde" stukjes van de zaden in een petrischaaltje met agar en breng 2 μL van de 1.000 sporen/μL suspensie aan in de geboorde holte van elk halfzaadlobbig stuk met een pipeter van 10 μL. Breng in plaats van de sporensuspensie steriel water aan op de controlezaden (Figuur 2F,G).</li>
	<li>Dek alle petrischaaltjes af met deksel en incubeer bij 30 °C zonder licht gedurende 72 uur.</li>
</ol>2. Bemonstering en bereiding van de geïncubeerde zaadstukjes voor de analyse van aflatoxine en fytoalexine
<ol><li>Verzamel zaadstukjes na 72 uur door ze met een tang uit de agar te halen en ze allemaal in geëtiketteerde flesjes van 7 ml met 13 zirkoniumkeramische kralen (12 met een diameter van 2,8 mm en 1 met een diameter van 6,5 mm) te plaatsen (Figuur 2H,I). OPMERKING: Op dit punt kunnen de injectieflacons, indien niet onmiddellijk verwerkt, in een vriezer van -80 °C worden geplaatst en maximaal 2 maanden worden bewaard voordat ze verder worden verwerkt.</li>
	<li>Fytoalexinen en aflatoxinen worden in hetzelfde zaadextract bepaald. Voeg voor de extractie, afhankelijk van de visuele zaadgrootte (klein, middelgroot of groot), 2 of 4 ml nauwkeurig afgemeten methanol-watermengsel (90:10, v/v) toe aan de kraalflesjes en verpulver met 5,5 m/sec gedurende 45 s. Plaats de injectieflacons met verpulverd zaad in een centrifuge en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 1.860 × g (Figuur 2J - L). OPMERKING: De volgende belangrijke 17,22 stilbenoïde derivaten worden bepaald (allemaal in transconfiguratie): resveratrol, arachidin-1, arachidine-2, arachidine-3, 3′-isopentadienyl-3,5,4'-trihydroxystilbeen (IPD) en SB-1.</li>
	<li>Voor aflatoxineanalyses moet u, voordat u de uitdagende experimenten uitvoert, als volgt een voldoende aantal opruimkolommen voorbereiden. Plaats een bijpassende polyethyleen poreuze (20 μL) fritte in een polypropyleen kolom van 1,5 ml met behulp van een glazen staaf die in een hoek van 90o is gesneden. Plaats 50 mg van de magnesiumsilicagel (100-200 mesh) in de kolom met een op maat gemaakte schep en sluit de kolom af met een identieke frit door deze met een glazen staaf naar beneden te duwen (Figuur 3A - E). OPMERKING: Deze hoeveelheid magnesiumsilicagel neemt een volume van 75 μL in beslag en de hoogte van de adsorberende laag is 3 mm.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig3.jpg"> Figuur 3: Voorbereiding van opruimkolommen en filters. (A,B) Een poreuze frit in een vat plaatsen; (C,D) vulvat met magnesiumsilicagel; (E) het verpakken van het adsorbens en het inbrengen van een bovenste poreuze frit in het vat. (F) Plaats een cirkel van glasvezel met een diameter van 11,5 mm op een pasteurpipet. (G,H) Duw het midden van de cirkel met een plastic of houten staaf naar de bodem van de Pasteur-pipetcilinder en verdicht de glasvezel stevig. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<ol start="4"><li>Bereid nu een bijpassend aantal op maat gemaakte filters voor, zoals weergegeven in afbeelding 3F - H.</li>
	<li>Meet voor aflatoxineanalyses nauwkeurig tot 0,5 ml aliquot van het supernatans (verkregen zoals beschreven in stap 2.2), breng het over in de op maat verpakte minikolom en laat het extract door zwaartekracht uitlekken in een glazen injectieflacon van 4 ml. Breng 1,0 ml methanol-water (90:10, v/v) mengsel over naar de kolom om onzuiverheden door zwaartekracht weg te spoelen in dezelfde injectieflacon van 4 ml (Figuur 4A).</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig4.jpg"> Figuur 4: Zuivering van zaadextracten en voorbereiding voor de UPLC-analyses. (A) Rek met ingepakte kolommen. (B) Verdampingsoplosmiddel metN2-gas uit zes injectieflacons van 4 ml met gezuiverd extract geëlueerd uit reinigingskolommen. (C) Injectieflacons en filters op een temperatuur onder het vriespunt brengen in schuimcontainers (1 en 2) met ijs voor en na toevoeging van het injectieoplosmiddel (MeOH-H2O 9:1, v/v) aan de injectieflacons van 4 ml. (D) Filteren van gekoeld extract uit een injectieflacon van 4 ml in een injectieflacon met automatische monsterneming van 400 μl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<ol start="6"><li>Gooi de gecombineerde eluaten weg. Eluto de aflatoxinefractie door zwaartekracht uit de kolom in een schone glazen injectieflacon van 4 ml met een mengsel van 1,2 ml aceton-acetonitril-water-88% mierenzuur (65:31:3.5:0.5, v/v) (Figuur 4A).</li>
	<li>U kunt ook aflatoxinen uit de kolom elueren met 2,0 ml acetonitril-water-88% mierenzuur (96:3,5:0,5, v/v) mengsel en een aliquot van het eluaat, tot 2 μL, rechtstreeks in het ultra performance liquid chromatography (UPLC)-systeem injecteren (zonder verdamping van het oplosmiddel met N2). OPMERKING: Verwacht in dit geval een tot 10-voudig lagere kwantificeringslimiet voor aflatoxinen; In de meeste gevallen is een dergelijke daling van de gevoeligheid acceptabel, aangezien de aflatoxineconcentraties in uitgedaagd zaad vaak hoog zijn.</li>
	<li>Verwijder het oplosmiddel uit de injectieflacons in een stroom van N2 in een verwarmd blok bij 45 °C. Sluit de injectieflacon af en plaats deze 30-45 s in een container met gemalen ijs om verdamping van het oplosmiddel dat in de volgende stap wordt toegevoegd tot een minimum te beperken. Plaats op maat gemaakte filters in wegwerpreageerbuisjes en steek de buisjes in ijs in een andere container om verdamping van oplosmiddel bij filtratie te minimaliseren (Figuur 4B,C).</li>
	<li>Los na verdamping van het oplosmiddel het droge residu op in nauwkeurig afgemeten 0,25-1,0 ml methanol-watermengsel (90:10, v/v) en vortex gedurende 1-2 s. Plaats injectieflacons met gezuiverde extracten in de UPLC-autosampler en injecteer 0,1 tot 3,0 μl in het UPLC-systeem (Figuur 5A,B). OPMERKING: Als het vermoeden bestaat dat de oplossing na het vortexen enkele zwevende deeltjes bevat, filtreer de oplossing dan door het afgekoelde filter (Figuur 4D).</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig5.jpg"> Figuur 5: Het proces en de resultaten van UPLC-analyses van gezuiverde extracten. (A) Het plaatsen van een rek met gezuiverde monsterextracten in de UPLC-autosampler. (B) Het uitvoeren van de instrumentele analyses, het verkrijgen van gegevens en het interpreteren van resultaten. (C) UPLC van vier belangrijke aflatoxinen; de belangrijkste pieken van belang, aflatoxinen B1 en B2 vertegenwoordigen respectievelijk 0,04 en 0,004 ng. d) UPLC van aflatoxinen B1 en B2; piek 2 vertegenwoordigt aflatoxineB1 op een niveau van 2 pg (met een stroomcel van 8 μL). (E) UPLC van gezuiverd extract van een zaadje dat is geoogst van een lokaal pindaveld met een wilde Arachis-soort . (F) UPLC van het extract van een uitgedaagd pindazaad, gezuiverd met een minikolom van basisch aluminiumoxide. G) UPLC van het extract van uitgedaagd pindazaad dat is gezuiverd met een Florisil-kolom; blauwe chromatogram toont onzuiverheden die uit de kolom worden gewassen met 1 ml methanol-water (90:10 v/v) mengsel; zwart chromatogram toont pieken van aflatoxinen M1 en B1. Het niveau van aflatoxineB1 is 48 ng/g. (H) Een typisch chromatogram van pinda-stilbenoïden uit een uitgedaagd zaad; afkorting: IPD = 3′-isopentadienyl-3,5,4′-trihydroxystilbeen. Opmerking: Alle stilbenoïden in zaadextracten zijn in transconfiguratie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> 
<ol start="10"><li>Voor fytoalexineanalyses brengt u uit elke injectieflacon met parels 200 μl supernatans over in het bovenstaande pasteurpipetfilter. Gebruik N2-gas uit een gecomprimeerde stikstoftank om de filtratie in een injectieflacon met UPLC-autosampler van 400 μl te versnellen en sluit de injectieflacon af met een bijpassende dop met een PTFE-septum (Figuur 4D).</li>
</ol>3. Aflatoxine-analyses
<ol><li>Gebruik voor scheidingen van aflatoxinen in zaadextracten een UPLC-systeem dat is uitgerust met een autosampler, een quaternaire pomp, een fluorescentiedetector, een UPLC BEH C18 3,0 mm x 100 mm, een kolom van 1,7 μm met een bijpassende voorkolom en een fotochemische reactor na de kolom (PHRED) met een standaard gebreide PTFE-spoel met een interne diameter van 0,25 die op 25% van de oorspronkelijke lengte is gesneden. OPMERKING: Het UPLC-instrument en de bijbehorende apparatuur die door de auteurs worden gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.</li>
	<li>Gebruik water (A), methanol (B) en acetonitril (C) in de volgende gradiënt: beginomstandigheden, 62,7% A, 24% B, 13,3% C, lineair veranderd in 30% A, 45% B, 25% C in 3,75 min, veranderd in 0% A, 64,4% B, 35,6% C in 3,751 min, isocratisch gehouden gedurende 3,249 min, vervolgens overgeschakeld naar initiële condities in 0,01 min en isocratisch gehouden gedurende 2,499 min voor de volgende injectie. Stel het debiet in op 0.45 ml/min en de looptijd op 9.5 min. Houd de kolom op 40 °C in de systeemkolomverwarmer. Gebruik 362 nm en 440 nm als respectievelijk de excitatie- en emissiegolflengten voor kwantificering van aflatoxinen B1, B2, G1, G2 en M1 . De structuren van de belangrijkste aflatoxinen zijn weergegeven in figuur 6A. OPMERKING: Onder de experimentele omstandigheden wordt verwacht dat alleen aflatoxinen B1 en B2 worden geproduceerd door A. flavus NRRL 3357; als een A. parasiticus-stam wordt gebruikt voor zaaduitdaging, wordt de productie van aflatoxinen B1, B2, G1 en G2 verwacht.</li>
	<li>Bepaal de concentraties van aflatoxinen aan de hand van piekgebieden van overeenkomstige authentieke standaarden (kalibratiecurve) zoals beschreven in de gebruikershandleiding van de software. OPMERKING: Aangezien de UPLC-procedure basislijnruis vertoont bij de hoge gevoeligheidsinstellingen voor de fluorescentiedetector, worden de detectielimiet (LOD) en de kwantificeringslimiet (LOQ) voor aflatoxinen geëvalueerd met behulp van de algemeen aanvaarde signaal-ruisverhouding van 3:1 voor LOD en 10:1 voor LOQ. In de routinematige experimentele opstelling voor de analyse van pindazaden, beschreven in de secties 2 en 3, wordt verwacht dat de kwantificeringslimieten voor aflatoxinen G1 en B1 lager of gelijk zijn aan 0,8 en 0,08 ng/g voor respectievelijk aflatoxinenG 2 enB2.</li>
</ol>4. Analyses van stilbenoïde fytoalexine
<ol><li>Gebruik voor de afscheiding van stilbenoïden water (A), methanol (B) en 88% mierenzuur (C) in de volgende gradiënt: beginomstandigheden, 53% A, 42% B, 5% C, lineair veranderd in 35% A, 60% B, 5% C in 2,0 min, isocratisch gehouden gedurende 4 min, veranderd in 0% A, 95% B, 5% C in 0,5 min, isocratisch gehouden gedurende 2,5 min, vervolgens in 0,1 minuut overgeschakeld naar de begintoestand en 2,9 minuten isocratisch gehouden vóór de volgende injectie. Stel het debiet in op 0.5 ml/min en de looptijd op 12.0 min.</li>
	<li>Bepaal de concentraties van stilbenoïden aan de hand van piekgebieden van overeenkomstige authentieke standaarden (kalibratiecurve) en/of gepubliceerde coëfficiënten van molaire extincties zoals beschreven in de gebruikershandleiding van de software. De structuren van de belangrijkste van stilbeen afgeleide fytoalexinen zijn weergegeven in figuur 6B. OPMERKING: De scheiding van fytoalexinen wordt bereikt met hetzelfde systeem, maar zonder een fluorescentiedetector en een PHRED-reactor. In plaats daarvan wordt een Diode Array Detector gebruikt voor de detectie en kwantificering van pinda-stilbenoïden. De kwantificeringslimiet (LOQ) voor de belangrijkste stilbenoïde fytoalexinen heeft geen praktische betekenis, aangezien de stilbenoïdeconcentraties de concentraties van aflatoxinen in hetzelfde extract met enkele ordes van grootte overschrijden; Na 3 dagen incubatie worden stilbenoïden betrouwbaar gekwantificeerd.</li>
</ol>

Evaluatie van wilde pindasoorten op resistentie tegen aflatoxine-accumulatie

<ol><li>Janila, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+breeding+for+introgression+of+fatty+acid+desaturase+mutant+alleles+%28ahFAD2A+and+ahFAD2B%29+enhances+oil+quality+in+high+and+low+oil+containing+peanut+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular breeding for introgression of fatty acid desaturase mutant alleles (ahFAD2A and ahFAD2B) enhances oil quality in high and low oil containing peanut genotypes.</a> Plant Sci. 242, 203-213 (2016).</li>
<li>Rasooly, R., Hernlem, B., He, X., Friedman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-linear+relationships+between+aflatoxin+B1+levels+and+the+biological+response+of+monkey+kidney+vero+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Non-linear relationships between aflatoxin B1 levels and the biological response of monkey kidney vero cells.</a> Toxins (Basel). 5 (8), 1447-1461 (2013).</li>
<li>American Association for Cancer Research: AACR. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+chemicals+and+industrial+processes+associated+with+cancer+in+humans+based+on+human+and+animal+data%3A+IARC+Monographs+Volumes+1+to+20%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">An evaluation of chemicals and industrial processes associated with cancer in humans based on human and animal data: IARC Monographs Volumes 1 to 20.</a> Cancer Res. 40 (1), 1-12 (1980).</li>
<li>Turner, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+epidemiology+of+chronic+aflatoxin+driven+impaired+child+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Scientifica%22%5BJournal%5D)">The molecular epidemiology of chronic aflatoxin driven impaired child growth.</a> Scientifica. , 21(2013).</li>
<li>Williams, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+aflatoxicosis+in+developing+countries%3A+a+review+of+toxicology%2C+exposure%2C+potential+health+consequences%2C+and+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Human aflatoxicosis in developing countries: a review of toxicology, exposure, potential health consequences, and interventions.</a> Am. J. Clin. Nutr. 80 (5), 1106-1122 (2004).</li>
<li>van Egmond, H. P., Jonker, M. A. Worldwide regulations on aflatoxins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avan+Egmond%2C+HP+%22Aflatoxinandfood+safety%22">Aflatoxinandfood safety</a>. Abbas, H. K. , Taylor and Francis. Baca Raton, Florida. 77-93 (2005).</li>
<li>European Commission. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commission+Regulation+%28EC%29+1525%2F98%5BTitle%5D)+AND+%22Off.+J.+Eur.+Comm.+L%22%5BJournal%5D)">Commission Regulation (EC) 1525/98.</a> Off. J. Eur. Comm. L. 201, 43-46 (1998).</li>
<li>Bressano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introgression+of+peanut+smut+resistance+from+landraces+to+elite+peanut+cultivars+%28Arachis+hypogaea+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Introgression of peanut smut resistance from landraces to elite peanut cultivars (Arachis hypogaea L).</a> PLoS ONE. 14 (2), e0211920(2019).</li>
<li>de Blas, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+smut+resistance+in+wild+Arachis+species+and+its+introgression+into+peanut+elite+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of smut resistance in wild Arachis species and its introgression into peanut elite lines.</a> Crop Sci. 59 (4), 1657-1665 (2019).</li>
<li>Mallikarjuna, N., Pande, S., Jadhav, D. R., Sastri, D. C., Rao, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introgression+of+disease+resistance+genes+from+Arachis+kempff-mercadoi+into+cultivated+groundnut%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Breeding%22%5BJournal%5D)">Introgression of disease resistance genes from Arachis kempff-mercadoi into cultivated groundnut.</a> Plant Breeding. 123 (6), 573-576 (2004).</li>
<li>Moretzsohn, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+diversity+of+peanut+%28Arachis+hypogaea+L.%29+and+its+wild+relatives+based+on+the+analysis+of+hypervariable+regions+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic diversity of peanut (Arachis hypogaea L.) and its wild relatives based on the analysis of hypervariable regions of the genome.</a> BMC Plant Biol. 4, 1-10 (2004).</li>
<li>Arias, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+to+screen+wild+peanut+species+for+aflatoxin+accumulation+and+genetic+fingerprinting%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">New tools to screen wild peanut species for aflatoxin accumulation and genetic fingerprinting.</a> BMC Plant Biol. 18 (1), 170(2018).</li>
<li>Dorner, J. W., Cole, R. J., Sanders, T. H., Blankenship, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrelationship+of+kernel+water+activity%2C+soil+temperature%2C+maturity%2C+and+phytoalexin+production+in+preharvest+aflatoxin+contamination+of+drought-stressed+peanuts%5BTitle%5D)+AND+%22Mycopathologia%22%5BJournal%5D)">Interrelationship of kernel water activity, soil temperature, maturity, and phytoalexin production in preharvest aflatoxin contamination of drought-stressed peanuts.</a> Mycopathologia. 105 (2), 117-128 (1989).</li>
<li>Paxton, J. D. Biosynthesis and accumulation of legume phytoalexins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxton%2C+JD+%22Mycotoxins+and+phytoalexins%22">Mycotoxins and phytoalexins</a>. Sharma, R. P., Salunkhe, D. K. , CRC Press. Boca Raton, Florida. 485-499 (1991).</li>
<li>Cole, R. J., Dorner, J. W. Peanut phytoalexins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCole%2C+RJ+%22Mycotoxins+and+phytoalexins%22">Mycotoxins and phytoalexins</a>. Sharma, R. P., Salunkhe, D. K. , CRC Press. Boca Raton, Florida. 501-509 (1991).</li>
<li>Subba Rao, P. V., Strange, R. N. Chemistry, biology, and role of groundnut phytoalexins in resistance to fungal attack. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSubba+Rao%2C+PV+%22Handbook+of+phytoalexin+metabolism+and+action%22">Handbook of phytoalexin metabolism and action</a>. Daniel, M., Purkayastha, R. P. , Marcel Dekker. New York. 199-227 (1995).</li>
<li>Sobolev, V. S., Guo, B. Z., Holbrook, C. C., Lynch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrelationship+of+phytoalexin+production+and+disease+resistance+in+selected+peanut+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food.+Chem%22%5BJournal%5D)">Interrelationship of phytoalexin production and disease resistance in selected peanut genotypes.</a> J. Agric. Food. Chem. 55 (6), 2195-2200 (2007).</li>
<li>Paxton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytoalexins%3A+a+working+redefinition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Phytoalexins: a working redefinition.</a> J. Phytopathol. 101, 106-109 (1981).</li>
<li>Mansfield, J. W. The role of phytoalexins in disease resistance. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMansfield%2C+JW+%22Phytoalexins%22">Phytoalexins</a>. Bailey, J. A., Mansfield, J. W. , John Wiley. New York. 153-288 (1982).</li>
<li>Strange, R. N. Resistance: the role of the hypersensitive response and phytoalexins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStrange%2C+RN+%22Plant+response+to+foliar+pathogens%22">Plant response to foliar pathogens</a>. Ayers, P. G. , Biosis Scientific. Oxford. 39-56 (1992).</li>
<li>Sobolev, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+activity+of+peanut+%28Arachis+hypogaea%29+phytoalexins+and+selected+natural+and+synthetic+stilbenoids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Biological activity of peanut (Arachis hypogaea) phytoalexins and selected natural and synthetic stilbenoids.</a> J. Agric. Food Chem. 59 (5), 1673-1682 (2011).</li>
<li>Sobolev, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+production+of+phytoalexins+by+peanut+%28Arachis+hypogaea%29+kernels+in+response+to+invasion+by+Aspergillus+Species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Localized production of phytoalexins by peanut (Arachis hypogaea) kernels in response to invasion by Aspergillus Species.</a> J. Agric. Food Chem. 56 (6), 1949-1954 (2008).</li>
<li>Sobolev, V. S., Neff, S. A., Gloer, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+stilbenoids+from+peanut+%28Arachis+hypogaea%29+seeds+challenged+by+an+Aspergillus+caelatus+strain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">New stilbenoids from peanut (Arachis hypogaea) seeds challenged by an Aspergillus caelatus strain.</a> J. Agric. Food Chem. 57 (1), 62-68 (2009).</li>
<li>Trucksess, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+column+coupled+with+solution+fluorometry+or+liquid+chromatography+postcolumn+derivatization+for+determination+of+aflatoxins+in+corn%2C+peanuts%2C+and+peanut+butter%3A+collaborative+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC+Int%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity column coupled with solution fluorometry or liquid chromatography postcolumn derivatization for determination of aflatoxins in corn, peanuts, and peanut butter: collaborative study.</a> J. AOAC Int. 74 (1), 81-88 (1991).</li>
<li>Dorner, J. W., Blankenship, P. D., Cole, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+two+immunochemical+assays+in+the+analysis+of+peanuts+for+aflatoxin+at+37+field+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC+Int%22%5BJournal%5D)">Performance of two immunochemical assays in the analysis of peanuts for aflatoxin at 37 field laboratories.</a> J. AOAC Int. 76 (3), 637-643 (1993).</li>
<li>Stroka, J., Anklam, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+column+cleanup+with+liquid+chromatography+using+post-column+bromination+for+determination+of+aflatoxins+in+peanut+butter%2C+pistachio+paste%2C+fig+paste%2C+and+paprika+powder%3A+collaborative+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC+Int%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity column cleanup with liquid chromatography using post-column bromination for determination of aflatoxins in peanut butter, pistachio paste, fig paste, and paprika powder: collaborative study.</a> J. AOAC Int. 83 (2), 320-340 (2000).</li>
<li>Pal, A., Acharya, D., Saha, D., Roy, D., Dhar, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+sample+cleanup+during+immunoassay%3A+a+simple+method+for+rapid+detection+of+aflatoxin+B1+in+food+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">In situ sample cleanup during immunoassay: a simple method for rapid detection of aflatoxin B1 in food samples.</a> J. Food Prot. 68 (10), 2169-2177 (2005).</li>
<li>Sobolev, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple%2C+rapid%2C+and+inexpensive+cleanup+method+for+quantitation+of+aflatoxins+in+important+agricultural+products+by+HPLC%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Simple, rapid, and inexpensive cleanup method for quantitation of aflatoxins in important agricultural products by HPLC.</a> J. Agric. Food Chem. 55 (6), 2136-2141 (2007).</li>
<li>Sobolev, V. S., Dorner, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleanup+procedure+for+determination+of+aflatoxins+in+major+agricultural+commodities+by+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC+Int%22%5BJournal%5D)">Cleanup procedure for determination of aflatoxins in major agricultural commodities by liquid chromatography.</a> J. AOAC Int. 85 (3), 642-645 (2002).</li>
<li>Levi, C. P., Borker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+of+green+coffee+for+potential+aflatoxin+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC%22%5BJournal%5D)">Survey of green coffee for potential aflatoxin contamination.</a> J. AOAC. 51 (3), 600-602 (1968).</li>
<li>Levi, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaborative+study+on+a+method+for+detection+of+aflatoxins+B1+in+green+coffee+beans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC%22%5BJournal%5D)">Collaborative study on a method for detection of aflatoxins B1 in green coffee beans.</a> J. AOAC. 52 (6), 1300-1303 (1969).</li>
<li>Scott, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Note+on+analysis+of+aflatoxins+in+green+coffee%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC%22%5BJournal%5D)">Note on analysis of aflatoxins in green coffee.</a> J. AOAC. 51, 609(1968).</li>
<li>Bicking, M. K. L., Kniseley, R. N., Svec, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled-column+system+for+quantitating+low+levels+of+aflatoxins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC%22%5BJournal%5D)">Coupled-column system for quantitating low levels of aflatoxins.</a> J. AOAC. 66 (4), 905-908 (1983).</li>
<li>Kamimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple%2C+rapid+cleanup+method+for+analysis+of+aflatoxins+and+comparison+with+various+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC%22%5BJournal%5D)">Simple, rapid cleanup method for analysis of aflatoxins and comparison with various methods.</a> J. AOAC. 68 (3), 458-461 (1985).</li>
<li>Hoogenboom, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotoxicity+testing+of+extracts+from+aflatoxin-contaminated+peanut+meal%2C+following+chemical+decontamination%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Addit.+Contam%22%5BJournal%5D)">Genotoxicity testing of extracts from aflatoxin-contaminated peanut meal, following chemical decontamination.</a> Food Addit. Contam. 18 (4), 329-341 (2001).</li>
<li>Castro, L., Vargas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+aflatoxins+B1%2C+B2%2C+G1+and+G2+in+maize+using+Florisil+clean+up+with+thin+layer+chromatography+and+visual+and+densitometric+Quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Cienc.+Tecnol.+Ailment.+Campinas%22%5BJournal%5D)">Determining aflatoxins B1, B2, G1 and G2 in maize using Florisil clean up with thin layer chromatography and visual and densitometric Quantitation.</a> Cienc. Tecnol. Ailment. Campinas. 21, 115-122 (2001).</li>
<li>Arias, R. S., Dang, P. M., Sobolev, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-mediated+Control+of+Aflatoxins+in+Peanut%3A+Method+to+Analyze+Mycotoxin+Production+and+Transgene+Expression+in+the+Peanut%2FAspergillus+Pathosystem%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem.</a> J. Vis. Exp. (106), e53398(2015).</li>
<li>Whitaker, T. B., Dorner, J. W., Giesbrecht, F. G., Slate, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+among+aflatoxin+test+results+on+runner+peanuts+harvested+from+small+field+plots%5BTitle%5D)+AND+%22Peanut+Sci%22%5BJournal%5D)">Variability among aflatoxin test results on runner peanuts harvested from small field plots.</a> Peanut Sci. 31 (1), 59-63 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Op basis van onze eerdere ervaring28 hebben we een eenvoudige, goedkope, milieuvriendelijke, chemische procedure ontwikkeld die geschikt is voor de exploratie van wilde Arachis kiemplasmacollecties om soorten te identificeren die resistent zijn tegen Aspergillus en om nieuwe bronnen van genetische resistentie tegen deze opportunistische schimmel te bepalen en te karakteriseren. Deze methode is gebaseerd op de zuivering van zaadextract door middel van een vastefase-extractietechniek (SPE) en kwantificering van aflatoxine door Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) en wordt gekenmerkt door een voldoende hoog herstel, precisie en nauwkeurigheid. De voorgestelde "Florisil"-methode is een aanpassing van de opruimprocedure met één minikolom die is gebaseerd op de unieke eigenschap van Florisil (magnesiumsilicagel) om aflatoxinen sterk en selectief vast te houden28. Net als bij de oorspronkelijke methode werden zaadmonsters geëxtraheerd met MeOH-H2O-mengsel, maar in een andere verhouding van 90:10 (v/v) in vergelijking met de gepubliceerde 80:20 (v/v). Deze verandering heeft de stroomsnelheid van oplosmiddelen door de opruimkolom verhoogd tot 2,5x met dezelfde aflatoxine-terugwinningssnelheid. Dit 90:10 (v/v) methanol-watermengsel zorgde voor bijna 100% herstel van de aflatoxinen B1, B2, G1 en G2 normen toegevoegd aan het extraheren van oplosmiddel bij piekniveaus gelijk aan 5-50 ng aflatoxineconcentraties in 1 g van een substraat, en zorgde ook voor voldoende hoge terugwinning van de spiked pindazaadmonsters (tabel 1).
Het is aangetoond dat aflatoxinen alleen kunnen worden geëlueerd uit het Florisil-adsorbens met grote hoeveelheden aceton30, aceton-methanol 31,32 en aceton-watermengsels 33,34,35,36. In de loop van het huidige onderzoek ontdekten we dat aangezuurd acetonitril zich op dezelfde manier gedraagt als aceton in zijn vermogen om aflatoxinen uit Florisil te elueren. Voor zover wij weten is deze eigenschap van acetonitril niet gerapporteerd in de literatuur. De ontdekking van deze eigenschap maakt het mogelijk om gezuiverd extract rechtstreeks in het UPLC-systeem te injecteren, zonder de verdampingsstap van het oplosmiddel, wat de bereidingstijd aanzienlijk verkort. Zelfs wanneer acetonitril werd gemengd met aceton (aceton-acetonitril-water-88% mierenzuur (65:31:3.5:0.5, v/v)), zorgde het voor een soepele, volledige en snelle verwijdering van water uit de gezuiverde eluaten, waardoor de verdampingstijd van het oplosmiddel aanzienlijk werd verkort. De aanwezigheid van acetonitril maakte het gebruik van een enkel oplosmiddel, methanol-water (90:10, v/v) mengsel mogelijk om onzuiverheden effectief uit de Florisil-kolom te verwijderen in vergelijking met een gepubliceerde methode, waarbij twee extra wasoplosmiddelen, methanol en chloroform-methanolmengsel, nodig waren. 28 okt.
Gemiddeld was het standaardherstel van aflatoxineB1 ~98% bij gebruik van 1,2 ml voor de elutie van aflatoxinen. De hoeveelheid van 50 mg Florisil werd zo gekozen dat 1,2 ml van het elutieoplosmiddel de minikolom tot aan de bovenkant van het vat vulde en tegelijkertijd voor een bevredigend herstel zorgde (tabel 1). Deze aanpak versnelt de opruimprocedure, omdat het kolomvat slechts één keer hoeft te worden gevuld. In de beginfase van dit project was het niet duidelijk of een commerciële Florisil-fractie met een relatief grote deeltjesgrootte, 100-200 mesh, geschikt zou zijn voor een kleine kolom met slechts een laag van 3 mm van het adsorbens. Daarom hebben we verschillende Florisil-fracties onderzocht die zijn verkregen uit een commercieel 100-200 mesh-product met behulp van de Amerikaanse standaard testzeven 120-140, 140-170, 170-200, 200-270, 270-400 en >400 mesh. Al deze fracties leverden reproduceerbare, bijna overeenkomende resultaten op met bevredigend herstel. Hoewel kleinere fracties van deeltjesgrootte smallere aflatoxinebanden in de kolom vertoonden onder UV-licht, waren die fracties in geen enkel opzicht superieur aan het commerciële 100-200 mesh-product. Bovendien vertoonde de 100-200 mesh-fractie de kortste elutietijden (8-12 min) voor de hele procedure.
Gradiënte UPLC-oplosmiddelafgifte zorgde voor een bevredigende scheiding van aflatoxinen en voor volledige verwijdering van niet-polaire onzuiverheden uit de kolom (figuur 5G). Deze aanpak leidde tot een vlekkeloze werking van de kolommen en reproduceerbare resultaten van de analyses van honderden monsters. De identiteit van aflatoxinen die uit de Florisil-kolom werden geëlueerd, werd bevestigd zoals eerder beschreven. 28 De analytische UPLC-kolom met een diameter van 3 mm die hier werd gebruikt, vertoonde een hogere selectiviteit en een betrouwbaardere scheiding van aflatoxinen B1, B2, G1 en G2 bij hogere concentraties in vergelijking met de kolom met een diameter van 2,1 mm van dezelfde chemie. Bovendien was de levensduur van de 3 mm-kolom (meer dan 1.200 injecties) aanzienlijk hoger dan die van de 2,1 mm-kolom (tot 800 injecties). Hoewel de kolom van 3 mm een hogere snelheid van de mobiele fase vereiste (40% meer), werd dit nadeel overtroffen door de bovenstaande voordelen van de kolom.
De Florisil-minikolom was effectief voor de zuivering van extracten van pindazaden die zwaar verontreinigd waren met Aspergillus-metabolieten (Figuur 5G); Dergelijke zaden bevatten ook hoge niveaus van stilbenoïde fytoalexinen die door zaden werden geproduceerd als reactie op de schimmelinvasie. Al die onzuiverheden kunnen de aflatoxineconcentratie in de zaden overschrijden tot 106-voudig 22, waardoor deze zaden uitdagende objecten zijn voor aflatoxineanalyses. Figuur 5G toont het ontbreken van storende pieken in het chromatogram binnen de aflatoxineretentietijden, waardoor de detectie en kwantificering van aflatoxine op alle geteste niveaus onaangetast bleven (tabel 1). Zoals te zien is in tabel 1, waren de nauwkeurigheid en precisie van de methode voldoende hoog binnen het geteste bereik van 1,0-50,0 ng/g, wat ook het meest kritische bereik is voor de detectie van aflatoxine. De herstelacties op verschillende niveaus voor verschillende genotypen van wilde pinda's waren uniform en de standaarddeviaties voor vijf verschillende extracties waren in wezen laag.
De methode werd ook getest op pinda-, katoen-, maïs- en rijstzaden die van nature besmet waren van nul tot extreem hoge niveaus - meer dan 10.000 ng/g totale aflatoxinen. Het herstel van aflatoxinen B1, B2, G1 en G2 uit maïs, katoenzaad en rijst op het niveau van 5 ng/g varieerde van respectievelijk 76,1% tot 93,7%, 77,1% tot 86,6% en 90,5% tot 96,2%. Het hoogste herstel van aflatoxinen uit rijst ging gepaard met de "zuiverheid" van het eluent, dat wil zeggen vrijwel het ontbreken van onzuiverheden. Verder vertegenwoordigde rijst het kleinste geteste object, gemiddeld 19 mg/zaad.
De totale bereidingstijd van een enkel pindazaadje (inclusief schillen, wegen, extraheren, centrifugeren en zuiveren) met behulp van een Florisil-kolom bedroeg niet meer dan 20 minuten. De kosten van de Florisil minizuil zijn >10x lager dan die van commerciële opruimzuilen. Extra besparingen vloeien voort uit het gebruik van lagere hoeveelheden adsorptiemiddelen, oplosmiddelen en stikstofgas in vergelijking met de gepubliceerde procedure28. De minikolom heeft geen pomp- of vacuümapparaten nodig om te werken en is voor onbepaalde tijd houdbaar.
Het onderzoeken van plantenkiemplasma op resistentie tegen aflatoxinen is buitengewoon moeilijk omdat de accumulatie van mycotoxinen geen normale verdeling volgt 37,38; Een groot aantal aflatoxineanalyses in enkelvoudige zaden is nodig om dit fenomeen te ondervangen. Naast het aflatoxinegehalte is informatie over de kwantitatieve samenstelling van fytoalexine zeer waardevol in het licht van een grote hoeveelheid informatie die kan worden verkregen uit een enkel zaadje (figuur 1A) en kan worden getraceerd naar een specifieke plant (figuur 1E). De methode is met succes gebruikt voor het screenen van honderden toevoegingen, waaronder landrassen, geavanceerde veredelingslijnen en elite pindavariëteiten. De methode wordt voorgesteld voor gebruik in onderzoeksprogramma's voor het voorkweken en veredelen van pinda's en kan helpen bij de karakterisering van pindagenen voor schimmelresistentie.

Pinda (Arachis hypogaea L.) is een van de belangrijkste voedselgewassen ter wereld. Het wordt geteeld in meer dan 100 landen met een totale productie van meer dan 45 miljoen ton1. Landbouwproducten, zoals pinda's, maïs en katoenzaad, worden vaak binnengevallen door soorten Aspergillus, op de bodem geboren schimmels die aflatoxinen produceren. Deze grondstoffen zijn bijzonder gevoelig voor aflatoxinebesmetting vóór de oogst wanneer de omgevingsomstandigheden worden gekenmerkt door hoge temperaturen en droogte. Aflatoxinen behoren tot de krachtigste kankerverwekkende stoffen die bekendzijn 3. Ze besmetten een kwart van de landbouwproducten in de wereld4 , waardoor ongeveer de helft van de wereldbevolking chronisch wordt blootgesteld aan aflatoxinen5. Vanwege hun hoge kankerverwekkendheid en toxiciteit wordt de aanwezigheid van aflatoxine in voedsel in de meeste landen van de wereld gereguleerd op de laagste, praktisch aanvaardbare limieten6.
De Europese Unie (EU) heeft een maximumgehalte vastgesteld van 2 ng/g voor aflatoxineB1 en 4 ng/g voor totale aflatoxinen (B1, B2, G1 en G2) in producten voor menselijke consumptie7. Dergelijke lage limieten leggen een aanzienlijke druk op de landbouw en de voedingsindustrie die met aflatoxinen verontreinigde goederen verwerkt. Aflatoxinemonitoring en herverwerking van besmette pinda's kan worden beschouwd als een passieve en kostbare strategie om te voorkomen dat aflatoxinen in de voedselketen terechtkomen. Dat is de reden waarom alle belangrijke segmenten van de pinda-industrie enorme winstverliezen lijden als gevolg van de aflatoxinebesmetting van de huidige pindacultivars die vaak een beperkte resistentie tegen schimmelziekten vertonen. Een prospectieve benadering om het aflatoxineprobleem op te lossen, is het verkrijgen van schimmelresistente pindacultivars door middel van genintrogressie, dat wil zeggen de overdracht van genetische informatie van resistente wilde pindasoorten naar elite-cultivars. In de afgelopen jaren hebben 8,9 wilde pindasoorten veel aandacht gekregen als bronnen van genetische ziekteresistentie, omdat de smalle genetische basis van gecultiveerde pinda's niet langer het benodigde niveau van resistentie tegen de pindaplant kan bieden10,11. Succesvolle introgressie van wilde pindasoorten vereist de analyses van duizenden enkele, kleine en schaarse zaden (Figuur 1A) 12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig1.jpg"> Figuur 1: Stroomdiagram voor single-seed analyse. (A) Vergelijkende omvang van pindacultivars van verschillende markttypen versus wilde Arachis spp. (1) Virginia; (2) loper; (3) Spaans; (4) wilde Arachis spp. (B) Wilde Arachis spp. (plaat A, zaad 4) in drie delen gesneden, (5) half zaad met embryonale as; dit deel van het zaad wordt gebruikt om een plant te laten groeien (E). (C) De onderdelen (6) en (7) worden geboord met een boor en (D) geënt met schimmelsporen. Na een incubatietijd van 72 uur bij 30 °C wordt een van de zaaddelen (6) of (7) gebruikt voor aflatoxine- en fytoalexineanalyses en een ander deel voor de sequencing van RNA/transcriptoom. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Resistentie van pinda's tegen schimmelpathogenen wordt sterk geassocieerd met fytoalexinen 13,14,15,16,17. Pinda-fytoalexinen worden vertegenwoordigd door antimicrobiële stilbenoïden die worden gebiosynthetiseerd en geaccumuleerd in plantenweefsels na blootstelling aan exogene stimuli, met name aan schimmelinvasie 16,17,18. Snelle accumulatie van voldoende concentraties fytoalexinen op de plaats van schimmelinvasie is remmend voor schimmelgroei en is van cruciaal belang voor de verdediging van planten19,20,21. De ziekteverwekker stopt met groeien wanneer fytoalexinen zich ophopen tot remmende concentraties16,22. De rol van stilbenoïden als verdedigingsstoffen tegen aflatoxingene schimmels in pinda's werd meer dan 30 jaar geleden geëvalueerd in veldexperimenten13. Die experimenten ondersteunden duidelijk de hypothese dat pinda-stilbenoïden een cruciale weerstandsfactor zijn bij aflatoxinebesmetting vóór de oogst. Dergelijk bewijs is gebaseerd op het feit dat stilbenen van nature worden geproduceerd in door het veld beschadigde pinda's; stilbenen vertonen een merkbare biologische activiteit tegen aflatoxinene schimmels; En aflatoxinebesmetting in zaden werd pas gedetecteerd toen pinda's het vermogen voor fytoalexinesynthese verloren als gevolg van door droogte veroorzaakte zaaduitdroging. Een andere reeks veldexperimenten bevestigde het verband tussen de productie van fytoalexine en resistentie van het pindagenotype tegen voor de landbouw belangrijke pindaziekten17.
Een beter begrip van het natuurlijke, op fytoalexine gebaseerde mechanisme van pindaresistentie tegen schimmelinvasie is een veelbelovende strategie voor de beheersing van aflatoxinebesmetting15,17.Daarom is het belangrijk om naast de aflatoxineanalyses dezelfde zaden kwantitatief te analyseren op fytoalexines. Hoewel dit mechanisme voor resistentie niet volledig is onderzocht en begrepen, is het toch cruciaal voor het veredelen en genetisch modificeren van pindaplanten voor nieuwe schimmelresistente cultivars23. Ondanks het bestaan van verschillende analytische methoden voor de bepaling van aflatoxine in verschillende producten, is er nog steeds behoefte aan eenvoudige methoden voor specifiek onderzoek, vooral wanneer traditionele methoden niet voldoen aan analytische en kosteneffectieve eisen. De meeste moderne opruimmethoden die door de pinda-industrie, de landbouw en particuliere laboratoria worden gebruikt, zijn op antilichamen gebaseerde24- en immunoassay 25,26,27-apparaten. Ze zijn selectief en gevoelig, maar aanzienlijk duurder dan minikolommen vol met gewone adsorptiemiddelen. Bovendien was geen van deze methoden ontworpen voor de analyse van monsters met een gewicht van enkele milligrammen. Op basis van ons eerdere onderzoek naar het analytisch gebruik van met magnesiumsilicagel (Florisil) verpakte minikolommen28, hebben we deze procedure aangepast om te voldoen aan de behoeften van lopende en toekomstige pre-fok- en fokprogramma's.
Het doel van dit werk was het ontwikkelen van een niet-destructieve, gemiddelde doorvoer, milieuvriendelijke methode voor de kwantitatieve bepaling van aflatoxinen en fytoalexinen in enkelvoudige pindazaden. Een dergelijke methode is ontwikkeld. De voordelen ten opzichte van gepubliceerde methoden zijn een hogere gevoeligheid, het vermogen om aflatoxinen en fytoalexinen in een extract van één zaad te analyseren, het ontbreken van de noodzaak om monsters te wegen en lagere kosten dankzij kleinere hoeveelheden verbruiksartikelen. Het stroomschema van de geïntegreerde methode is weergegeven in figuur 1. De genetische analyses en andere stappen worden in deze tekst genoemd en in de figuur gedemonstreerd om het belang van de voorgestelde methode te tonen en hoe deze is geïntegreerd in de hele procedure.

<table><tbody><tr><td>Acetone, Optima</td><td>Fisher Scientific</td><td>A929-4</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile, Optima</td><td>Fisher Scientific</td><td>A996-4</td><td></td></tr><tr><td>Acquity BEH C18 2.1 x 5mm Van-Guard pre-column</td><td>Waters Corporation</td><td>186003975</td><td></td></tr><tr><td>Acquity BEH C18 3 x 100mm column</td><td>Waters Corporation</td><td>186004661</td><td></td></tr><tr><td>Acquity BEH C18 2.1 x 100mm column</td><td>Waters Corporation</td><td>186002352</td><td></td></tr><tr><td>Aflatoxins B1, B2, G1, and G2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9441-1VL</td><td>Los op de inhoud van de commerciële flesjes in 5 mL methanol om 5 &micro;g/mL voor aflatoxinen B1 en G1 en 1.5 &micro;g/mL voor B2 en G2 te verkrijgen</td></tr><tr><td>Aflatoxin B1 (1mg)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6636-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Aflatoxin B2 (1mg)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9887-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Aflatoxin G1 (1mg)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0138-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Aflatoxin G2 (1mg)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0263-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Aflatoxin M1 (10 &micro;g)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CRM46319</td><td></td></tr><tr><td>Agar, gegranuleerd (2kg)</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD214510</td><td></td></tr><tr><td>Basisch aluminiumoxide (60-325 mesh)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A941-500</td><td></td></tr><tr><td>Basal medium</td><td>Murashige en Skoog</td><td>M5519</td><td></td></tr><tr><td>Bead Ruptor 24&nbsp;</td><td>Omni International</td><td>19-042E</td><td></td></tr><tr><td>Kolf (1000mL)</td><td>Corning (Pyrex)</td><td>10001L</td><td></td></tr><tr><td>Kolf (250mL)</td><td>Corning (Pyrex)</td><td>1000250</td><td></td></tr><tr><td>Kolf (400mL)</td><td>Corning (Pyrex)</td><td>1000400</td><td></td></tr><tr><td>Kolf (600mL)</td><td>Corning (Pyrex)</td><td>1000600</td><td></td></tr><tr><td>Mes</td><td>Feather</td><td>#10</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge (LSE Compact)</td><td>Corning</td><td>Model: 6755</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Corning</td><td>Model: 6770</td><td></td></tr><tr><td>Keramische kralen (2.8 mm)</td><td>Omni International</td><td>19-646</td><td></td></tr><tr><td>Keramische kralen (6.5 mm)</td><td>Omni International</td><td>19-682</td><td></td></tr><tr><td>Chromeleon 7 series Software</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boor (1,6 mm)</td><td>Kyocera</td><td>07896</td><td></td></tr><tr><td>Boor (2,0 mm)</td><td>Kyocera</td><td>07357</td><td></td></tr><tr><td>Boor (2,34 mm)</td><td>Kyocera</td><td>07985</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (200 proof)</td><td>Decon Labs</td><td>2805M</td><td></td></tr><tr><td>Stroom stikstof</td><td>organimation</td><td>11106</td><td>6-position</td></tr><tr><td>Excel, Microsoft</td><td>Microsoft</td><td>Office 365</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier (#4)</td><td>Cytiva Whatman</td><td>1004-090</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier snijder, roestvrij staal (ID 11.5mm)</td><td>Onbekend</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier, glasvezel</td><td>Cytiva Whatman</td><td>934-AH</td><td></td></tr><tr><td>Kolf (2800mL)</td><td>Corning (Pyrex)</td><td>44202XL</td><td></td></tr><tr><td>Florisil (100-200 mesh)</td><td>Fisher Scientific</td><td>F101-500</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Integra Lifescience (Miltex)</td><td>PM-0300</td><td></td></tr><tr><td>Mierenzuur (88%, ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A118P-500</td><td></td></tr><tr><td>Diepvrieskast (-80oC)</td><td>Fisher Scientific</td><td>TSX70086D</td><td></td></tr><tr><td>Trechter (15 x 80mm)</td><td>DWK Life Sciences (Kimax)</td><td>2902060</td><td></td></tr><tr><td>Gelzan (medium)</td><td>Caisson Labs&nbsp;</td><td>G024</td><td></td></tr><tr><td>Glas staaf (op maat)</td><td>Op maat gemaakt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glaswol</td><td>Corning (Pyrex)</td><td>3950</td><td></td></tr><tr><td>Handvat, scalpel&nbsp;</td><td>Feather</td><td>#7</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>Waterstofperoxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-4</td><td>30%, gecertificeerd ACS</td></tr><tr><td>IJsemmer, rond met deksel</td><td>Corning</td><td>432122</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Percival</td><td>136VL</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech SCIENCE Brand Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>34120</td><td>8.2" x 4.39"</td></tr><tr><td>Kimtech SCIENCE Brand Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>34256</td><td>16.4" x 14.43"</td></tr><tr><td>Labjas</td><td>Cenmed</td><td>B113660SBXL</td><td></td></tr><tr><td>Methanol, Optima</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td></td></tr><tr><td>Mini kolomrek (op maat)</td><td>Op maat gemaakt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mixer, touch (maxi mix II)</td><td>Thermolyne</td><td>37600 (model 231)</td><td></td></tr><tr><td>Nitril handschoenen&nbsp;</td><td>Microflex</td><td>XC310M</td><td></td></tr><tr><td>Stroomstikstof, gecomprimeerd (ultra hoge zuiverheid)</td><td>Jones Welding</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papier handdoek</td><td>Georgia-Pacific</td><td>20023 (D400)</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Fisher Scientific (Accumet)</td><td>13-636-AB15</td><td></td></tr><tr><td>pH/ATC elektrode</td><td>Fisher Scientific (Accumet)</td><td>13-620-111</td><td></td></tr><tr><td>PhCR Photochemische Reactor</td><td>Waters (Vicam)</td><td>600001222</td><td></td></tr><tr><td>Pipet, Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td>9"</td></tr><tr><td>Pipettor (1 mL) (Referentie 2)</td><td>Eppendorf</td><td>4924000088</td><td></td></tr><tr><td>Pipettor (10 &mu;L) (Referentie)</td><td>Eppendorf</td><td>022470051D</td><td></td></tr><tr><td>Pipettentips: 10 &mu;L, 200 &mu;L, 1 mL</td><td>Eppendorf</td><td>F144054M</td><td></td></tr><tr><td>Pipettor (200 &micro;L)(Ergofit)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-146-67

niet-destructieve op spe-uplc gebaseerde kwantificering van aflatoxinen en stilbenoïde fytoalexinen in enkele pinda's (arachis spp.) zaden

Non-destructive SPE-UPLC-based Quantification of Aflatoxins and Stilbenoid Phytoalexins in Single Peanut (Arachis spp.) Seeds

Aflatoxinen zijn zeer kankerverwekkende secundaire metabolieten van sommige schimmelsoorten, met name Aspergillus flavus. Aflatoxinen besmetten vaak economisch belangrijke landbouwproducten, waaronder pinda's, en vormen een hoog risico voor de gezondheid van mens en dier. Door de smalle genetische basis vertonen pindacultivars een beperkte resistentie tegen schimmelpathogenen. Daarom hebben talrijke wilde pindasoorten met tolerantie voor Aspergillus veel aandacht gekregen van wetenschappers als bronnen van ziekteresistentie.
Het onderzoeken van plantenkiemplasma op resistentie tegen aflatoxinen is moeilijk omdat de accumulatie van aflatoxinen geen normale verdeling volgt, wat de noodzaak dicteert van de analyses van duizenden enkele pindazaden. Voldoende gehydrateerde pindazaden (Arachis spp.) zijn, wanneer geïnfecteerd door Aspergillus-soorten , in staat om biologisch actieve stilbenen (stilbenoïden) te produceren die worden beschouwd als defensieve fytoalexinen. Pindastilbenen remmen de ontwikkeling van schimmels en de productie van aflatoxinen. Daarom is het van cruciaal belang om dezelfde zaden te analyseren op pinda-stilbenoïden om de aard van zaadresistentie/vatbaarheid voor de Aspergillus-invasie te verklaren. Geen van de gepubliceerde methoden biedt analyses van enkelvoudige zaden voor aflatoxinen en/of stilbeen fytoalexinen.
We hebben geprobeerd te voldoen aan de vraag naar een dergelijke methode die milieuvriendelijk is, goedkope verbruiksartikelen gebruikt en gevoelig en selectief is. Bovendien is de methode niet-destructief, omdat slechts de helft van het zaad wordt gebruikt en de andere helft met de embryonale as intact blijft. Een dergelijke techniek maakt het mogelijk om de pindaplant te ontkiemen en te laten groeien tot volledige rijpheid uit hetzelfde zaad dat wordt gebruikt voor de analyse van aflatoxine en stilbenoïde. Het geïntegreerde deel van deze methode, het handmatig uitdagen van de zaden met Aspergillus, is een beperkende stap die meer tijd en arbeid vereist in vergelijking met andere stappen in de methode. De methode is gebruikt voor de exploratie van wild Arachis-kiemplasma om soorten te identificeren die resistent zijn tegen Aspergillus en om nieuwe bronnen van genetische resistentie tegen deze schimmelpathogeen te bepalen en te karakteriseren.

De ontwikkelde methode voor het kwantificeren van aflatoxine in zaden is de kern van de hele procedure voor het evalueren van wilde pindasoorten op resistentie tegen aflatoxine-accumulatie. Op maat verpakte minikolommen en filters leveren aanzienlijke besparingen op en vereenvoudigen de algehele procedure door het ontbreken van grote hoeveelheden oplosmiddelen, dure en onnodige commerciële filters van 0,22 of 0,45 μm en pompapparatuur. De methode voor aflatoxineanalyses biedt een hoge terugwinning, nauwkeurigheid en precisie binnen het geteste bereik van 1,0-50,0 ng/g aflatoxinen uit gemalen zaden, zoals te zien is in tabel 1. Sterk besmette monsters werden verdund tot de lineair geteste waarde. Figuur 5C toont een basislijnscheiding van vier belangrijke aflatoxinen, B1, B2, G1 en G2 binnen een elutietijd van 5 minuten, wat acceptabel is aangezien de schimmelprovocatie van pindazaden de beperkende fase van de procedure is en niet UPLC-analyses.
De voorgestelde methode is voldoende gevoelig met een kwantificeringslimiet van 2 pg voor aflatoxineB1 (figuur 5D). De hoge zuiverheid van de extracten maakt een eenduidige kwantificering van aflatoxinen mogelijk, gezien vanaf een UPLC (Figuur 5E) van gezuiverd extract van zaden geoogst van een veld met een wilde Arachis-soort . Een eerder gepubliceerde minicolumnmethode29 is niet in staat om een bevredigende zuiverheid te bereiken voor door schimmels aangetaste pindazaden (Figuur 5F) in vergelijking met de voorgestelde methode (Figuur 5G). Uit figuur 5F blijkt duidelijk dat aflatoxinen B2, G1 en G2 niet betrouwbaar kunnen worden gedetecteerd en gekwantificeerd vanwege de aanwezigheid van hoge concentraties storende onzuiverheden, waarvan vele, geëlueerd na aflatoxinen, stilbenoïde fytoalexinen en schimmelmetabolieten zijn. Figuur 5G toont daarentegen de hoge efficiëntie van de magnesiumsilicagelkolom bij het verwijderen van onzuiverheden uit de aflatoxinefractie. Blauwe chromatogram toont storende onzuiverheden die uit de kolom worden gewassen met 1 ml methanol-water (90:10) mengsel; zwart chromatogram toont onverhulde pieken van aflatoxinen M1 en B1. Dit chromatogram vertegenwoordigt het extract van een uitgedaagd zaad van een wilde soort. Het niveau van aflatoxineB1 is 48 ng/g.
Kwantificering van pinda-fytoalexinen is een waardevolle aanvulling op de analyses van aflatoxinen in hetzelfde zaad, dat een natuurlijk zaad van een veld kan zijn of een door schimmels uitgedaagd zaad. Figuur 5H toont een typisch chromatogram van pinda-defensieve stilbenoïden uit een uitgedaagd zaad. De scheiding van de verbindingen wordt bereikt met behulp van dezelfde analytische kolom die wordt gebruikt voor aflatoxineanalyses. De kolom en de gekozen chromatografische omstandigheden zorgen voor een bevredigende scheiding van de pieken, waardoor een betrouwbare kwantificering van de stilbenoïden mogelijk is. Evaluatie van de relatie tussen aflatoxine en fytoalexine in uitgedaagde zaden valt buiten het bestek van deze presentatie en de methode wordt hier voorgesteld als een potentieel onderzoeksinstrument, dat al enkele jaren in het laboratorium van de auteurs wordt gebruikt en nuttig is gebleken.

<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig6.jpg"> Figuur 6: Structuren van belangrijke aflatoxinen en van stilbeen afgeleide pinda-fytoalexinen. (A) Structuren van belangrijke aflatoxinen: 1, B1; 2, B2; 3, G1; 4, G2. (B) Structuren van belangrijke van stilbeen afgeleide pinda-fytoalexinen: 6, resveratrol; 7, arachidine-1; 8, arachidine-2; 9, arachidine-3; 10, IPD (3′-isopentadienyl-3,5,4′-trihydroxystilbeen); 11, SB-1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2">Spike niveaua (ng/g)</td>
			<td colspan="4">Aflatoxinen</td>
		</tr><tr><td>B1 Zoekertjes</td>
			<td>B2 Zoekertjes</td>
			<td>G1</td>
			<td>G2</td>
		</tr><tr><td>50</td>
			<td>85.87 (0.97)</td>
			<td>82.33 (0.67)</td>
			<td>86.63 (2.89)</td>
			<td>84.01 (0.86)</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>91.43 (2.76)</td>
			<td>87.32 (0.47)</td>
			<td>88.08 (2.08)</td>
			<td>87.73 (0.77)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>81.21 (3.16)</td>
			<td>85.33 (1.98)</td>
			<td>81.76 (4.66)</td>
			<td>88.46 (3.24)</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Terugwinning van aflatoxinen uit pindazaden met behulp van de Florisil-kolom en 1,2 ml van het elutiemengsel van de aflatoxinefractie. [gemiddelde (SD), %; n = 5]. Aflatoxinevrije grondmonsters (50 g) van Georgia 06G-pindacultivar werden gelijkmatig verrijkt met behulp van een microspuit met aflatoxine-bouillonoplossing op een niveau van 50, 5 of 1 ng/g en gedurende 16 uur bij kamertemperatuur bewaard. a Spike-niveaus worden gegeven voor aflatoxinen B1 en G1; voor aflatoxinenB2 enG2 moet de vermenigvuldigingsfactor van 0,33 worden gebruikt.

We demonstreren een medium-throughput methode voor het kwantificeren van aflatoxinen en stilbenoïde fytoalexinen in enkele pindazaden met behulp van ultra performance vloeistofchromatografie. Deze methode is speciaal ontwikkeld voor de analyses van wilde Arachis-soorten die worden uitgedaagd door de afplatoxigene Aspergillus-soorten .

Niet-destructieve op SPE-UPLC gebaseerde kwantificering van aflatoxinen en stilbenoïde fytoalexinen in enkele pinda's (Arachis spp.) Zaden

Aflatoxins are highly carcinogenic secondary metabolites of some fungal species, particularly Aspergillus flavus. Aflatoxins often contaminate ...

De reikwijdte van het onderzoek was het ontwikkelen van een methode voor het kwantificeren van aflatoxinen en defensieve fytoalexinen in duizenden pindazaden voor de exploratie van wilde Arachis-kiemplasma, het identificeren van soorten die resistent zijn tegen aspergillus en het bepalen en karakteriseren van nieuwe bronnen van genetische resistentie tegen deze schimmelpathogeen . Onze onderzoeksgroep heeft ontdekt dat de meest veelbelovende benadering om pindakiemplasma te identificeren dat geen aflatoxine ophoopt, is om een holistische analyse uit te voeren van elk afzonderlijk zaadje, inclusief de transcriptomics, genomica, fytoalexinen en mycotoxineprofielen. We hebben protocollen ontwikkeld voor de analyse van wilde en gecultiveerde pindazaden, wat betekent dat we 1/4 van een enkel zaad gebruiken voor chemische profilering, het ontwikkelen van high-throughput-methoden voor effectieve zaaduitdaging, extractie en nauwkeurige kwantificering van fytoalexinen in pindazaadmonsters.We hebben talloze pinda-fytoalexinen ontdekt en efficiënte en goedkope methoden ontwikkeld voor aflatoxine-analyse, evenals voor het screenen van pindakiemplasma met verminderde of geen aflatoxine-accumulatie. De methoden omvatten genotypering en bepaling van de levensvatbaarheid van zaden.

non-destructive-spe-uplc-based-quantification-aflatoxins-stilbenoid

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

De verwoesting van de graangewassen door zaad-infecterende schimmels heeft ertoe geleid dat tal van onderzoeksinspanningen om beter te begrijpen plant-pathogeen interacties. Om zaad-schimmel interacties in een laboratorium te bestuderen, ontwikkelden we een robuuste methode voor de kwantificering van de schimmel reproductie, biomassa en verontreiniging met mycotoxinen met behulp van kernel bioassays.

Kwantificering van schimmelkolonisatie, Sporogenesis, en de productie van mycotoxinen Met behulp van Kernel Bioassays

We tonen een werkwijze voor de analyse van aflatoxinen en transgenexpressie in pindazaden dat RNA-stoorsignalen bevatten voor silencing aflatoxine-synthese genen in de schimmel Aspergillus flavus. RNAi-gemedieerde regulering van mycotoxinen in planten is niet eerder gerapporteerd.

RNAi-gemedieerde controle van Aflatoxines in Peanut: Methode om Mycotoxine Productie en transgenexpressie Analyseer de Peanut /<em&gt; Aspergillus</em&gt; Pathosystem

Hier presenteren we een protocol om Aspergillus flavus groei en productie van aflatoxine in maïs kernels uiting van een antischimmel eiwit te analyseren.  Met behulp van een stam GFP-uiten A. flavus bewaakt we de infectie en de verspreiding van de schimmel in volwassen kernels in real-time. De bepaling is snel, betrouwbaar en reproduceerbaar.

Remming van de groei van de Aspergillus flavus en aflatoxine productie in transgene maïs uiten van de α-amylase Inhibitor van Lablab purpureus L.

We zijn erin geslaagd een methode te ontwikkelen voor RNA-isolatie uit plantenzaden die grote hoeveelheden oliën, eiwitten en polyfenolen bevatten, die remmende effecten hebben op RNA-isolatie met hoge zuiverheid. Onze methode is geschikt voor het monitoren van de expressie van genen met transcripten op laag niveau in zaden.

Een efficiënte methode voor het isoleren van zeer gezuiverde RNA uit zaden voor gebruik in Quantitative Analysis Transcriptome

Hier geven we een stap-voor-stap protocol van de lange lengte elektrostatische repulsie-hilic-tandem massaspectrometrie (LERLIC-MS / MS) methode. Dit is een nieuwe methode die het mogelijk maakt voor het eerst kwantificering en karakterisering van glutamine en asparagine deamidering isovormen door shotgun proteomics.

LERLIC-MS / MS Gedetailleerde karakterisering en kwantificering van glutamine en asparagine Deamidatie in Shotgun Proteomics

Hier presenteren we een methode voor het meten van direct transfer-RNA opladen niveaus van gezuiverde Escherichia coli RNA als een manier om te vergelijken van de relatieve niveaus van transfer-RNA, of elke andere korte RNA, over verschillende steekproeven gebaseerd op de toevoeging van spike-in cellen die een referentie-gen uitdrukt.

Kwantificering van de overvloed en het opladen van de niveaus van overdracht RNAs in Escherichia coli

Een niet-label niet-radio-isotopische methode voor DNA-polymerase proeflezen en een DNA repair assay werd ontwikkeld met behulp van hoge-resolutie MALDI-TOF massa spectrometrie en een strategie voor de uitbreiding van één nucleotide. De test bleek te zijn van de zeer specifieke, eenvoudig, snel en gemakkelijk uit te voeren voor het proeflezen en reparatie patches korter dan 9-nucleotiden.

Proeflezen en DNA Repair Assay met behulp van één Nucleotide uitbreiding en MALDI-TOF massa spectrometrie analyse

We beschrijven drie experimentele methoden voor de evaluatie van de activiteit van de verdikking van chemische stoffen in vitro: kwantificering van 1) cellulaire tyrosinase-activiteit en 2) melanine inhoud, en 3) meting van melanine door cellulaire melanine kleuring en beeld-analyse.

Kwantificering van hypopigmentatie activiteit In Vitro

Hier presenteren we een protocol om te beoordelen van de labeling homogeniteit voor elke soort eiwit in een complexe eiwitSteekproef op het niveau van één molecuul.

Proteoom bestrijkende kwantificering van Labeling homogeniteit op het niveau van één molecuul

Kwantitatieve multiplex Immunoprecipitation (QMI) gebruikt Flowcytometrie voor gevoelige detectie van verschillen in de overvloed van gerichte eiwit-eiwit interacties tussen twee monsters. QMI kan worden uitgevoerd met een kleine hoeveelheid biomateriaal, vereist geen genetisch gemanipuleerde Tags en kan worden aangepast voor elk eerder gedefinieerd proteïne-interactie netwerk.

Kwantificering van eiwit interactie netwerk dynamiek met Multiplexed co-immunoprecipitatie

Leer een UPLC-methode voor kwantificering van aflatoxinen en stilbenoïde fytoalexinen in enkele pinda's (Arachis spp.). Deze techniek ondersteunt screening op resistentie tegen Aspergillus.

Niet-destructieve op SPE-UPLC gebaseerde kwantificering van aflatoxinen en stilbenoïde fytoalexinen in enkele pindas (Arachis spp.) Zaden (Video) | JoVE Journal

Niet-destructieve op SPE-UPLC gebaseerde kwantificering van aflatoxinen en stilbenoïde fytoalexinen in enkele pinda's (Arachis spp.) Zaden

Meer video's verkennen