Name: Zuivering en karakterisering van extracellulaire blaasjes uit humane van vet afgeleide mesenchymale stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T13:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 54 s
Description: Leer de zuivering en karakterisering van extracellulaire blaasjes uit humane vet-afgeleide mesenchymale stamcellen met ultracentrifugatie. Deze gestandaardiseerde methode verbetert de zuiverings-efficiëntie voor therapeutische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82202473).

Het overzicht van de protocolstappen is weergegeven in figuur 1. De details van de reagentia en apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Voorbereiding van de media
<ol><li>Bereid een kweekmedium voor ADSC zonder exosomen met behulp van 450 ml basaal kweekmedium, 50 ml foetaal runderserum zonder exosomen en 5 ml drievoudige antibiotica.</li>
</ol>2. Reanimeren en cultiveren van ADSC's
OPMERKING: Reanimeer ADSC's.
<ol><li>Zet vooraf de UV-straling van de ultra-clean tafel aan en desinfecteer deze gedurende 30 min.</li>
	<li>Verwarm het medium vooraf voor in een waterbad van 37 °C.</li>
	<li>Haal 2 tubes bevroren ADSC's (P3) uit vloeibare stikstof en schud ze in een waterbad van 37 °C met constante temperatuur tot ze volledig ontdooid zijn. NOTITIE: De opening van de vriezerbuis mag niet in contact komen met water om besmetting te voorkomen.</li>
	<li>Desinfecteer de cryopreservatiebuis met 75% alcohol en verplaats deze vervolgens naar de ultraschone tafel. Zuig de celsuspensie op met een pipet en plaats deze in een centrifugebuisje van 15 ml.</li>
	<li>Plaats de centrifugebuis in een centrifugemachine met lage snelheid en centrifugeer op 250 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Bereid vier kweekschaaltjes van 10 cm voor en doe in elk schaaltje 9 ml medium. Markeer de naam, het celtype, de generatie en de experimentele datum en verwarm ze vervolgens voor in een thermostatische celincubator van 37 °C.</li>
	<li>Desinfecteer de centrifugebuis en verplaats deze naar de ultraschone tafel. Verwijder het supernatans met een pipet.</li>
	<li>Voeg 4 ml medium toe en schud de oplossing voorzichtig (1 x 105 cellen/ml) totdat deze gelijkmatig is verdeeld. OPMERKING: Zorg ervoor dat de celpellet niet wordt geëxtraheerd bij het extraheren van het supernatant.</li>
	<li>Voeg 1 ml celsuspensie toe aan elk gerecht. Schud de gerechten met een kruismethode. NOTITIE: Plaats de plaat op een vlakke ondergrond en schud hem in een kruispatroon (beweeg hem omhoog, omlaag, naar links en naar rechts) gedurende 5-6 herhalingen. Vermijd cirkelvormige bewegingen, omdat deze celophoping in het midden kunnen veroorzaken.</li>
	<li>Observeer de cellen met een vergroting van 40x met de optische microscoop en plaats de schaaltjes vervolgens in de couveuse. OPMERKING: Het primaire doel van het observeren van de cellen is om te bepalen of ze gelijkmatig zijn verdeeld, aangezien een ongelijke verdeling de daaropvolgende groei zal beïnvloeden.</li>
	<li>Bereid uitwisselingsmedium voor de cellen voor.<ol><li>Zet vooraf de UV-straling van de ultra-clean tafel aan en desinfecteer deze gedurende 30 min.</li>
		<li>Verwarm het medium vooraf voor in een waterbad van 37 °C.</li>
		<li>Observeer de celtoestand onder de optische microscoop bij een vergroting van 40x. Het samenvloeiingsniveau is ongeveer 50%. OPMERKING: Het samenvloeiingsniveau wordt berekend als de verhouding tussen het gebied dat door de cellen wordt ingenomen en het oppervlak van de petrischaal nadat de cellen zich aan de wand hechten en volledig zijn uitgerekt.</li>
		<li>Breng de kweekschaal na desinfectie over naar de ultraschone tafel (bioveiligheidsniveau 2) en verwijder het medium.</li>
		<li>Spoel elk kweekschaaltje twee keer voorzichtig af met 2 ml PBS-oplossing.</li>
		<li>Voeg 10 ml medium toe aan elk gerecht. Breng de schaaltjes over naar de broedmachine.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Het verzamelen van de ADSC's als supernatant en het extraheren van de EV's
<ol><li>Zet vooraf de UV-straling van de ultra-clean tafel aan en desinfecteer deze gedurende 30 min.</li>
	<li>Observeer de celtoestand onder een microscoop. Het samenvloeiingsniveau is ongeveer 80%.</li>
	<li>Breng de schaal na desinfectie over naar de ultraschone tafel. Vang het supernatans voorzichtig op met een pipet en plaats het in een centrifugebuisje van 50 ml. OPMERKING: Cellen kunnen worden ingevroren of weggegooid. Als steriliteit niet vereist is, kunnen de volgende stappen op de operatietafel worden uitgevoerd. Op dit punt kan het experiment worden gepauzeerd en later opnieuw worden gestart. Als het experiment wordt stopgezet, bewaar het supernatans dan niet langer dan een week in een koelkast van 4 °C. Langdurige opslag wordt niet aanbevolen, omdat dit de activiteit van EV's kan beïnvloeden. De optimale aanpak is om EV's onmiddellijk te extraheren.</li>
	<li>Centrifugeer (300 x g, 10 min, bij kamertemperatuur) om zwevende cellen te verwijderen. Verzamel het supernatans met een pipet. LET OP: Niet gieten. Laat een beetje overdrijvend over om te voorkomen dat de korrel wordt opgezogen.</li>
	<li>Centrifugeer om celresten te verwijderen (2000 x g, 10 min, 4 °C) en ga vervolgens door met het verzamelen van het supernatans met een pipet. OPMERKING: De belangrijkste punten zijn dezelfde als in stap 3.4.</li>
	<li>Filtreer het supernatans met een membraan van 0,22 um om grote deeltjes en celresten te verwijderen. OPMERKING: Filtreer het supernatans met 2 ml steriel PBS om het filtermembraan te bevochtigen vóór filtratie.</li>
	<li>Centrifugeer in de ultracentrifugemachine (10.000 x g, 30 min, 4 °C).</li>
	<li>Centrifugeer vervolgens 70 minuten bij 1,00,000 x g bij 4 °C om de pellet te verwijderen en het supernatant op te vangen. OPMERKING: De verkregen EV's werden meerdere keren gezuiverd door centrifugeren om hun zuiverheid te vergroten. De pellet is mogelijk niet zichtbaar voor het blote oog. Daarom is het van cruciaal belang om de pipet voorzichtig te bedienen en een beetje supernatans op de bodem achter te laten om te voorkomen dat de korrels zich ophopen.</li>
	<li>Verwijder het supernatans met een pipet. Resuspendeer de pellet met PBS en centrifugeer (1,00,000 x g, 70 min, 4 °C). NOTITIE: De pellet is mogelijk niet zichtbaar voor het blote oog. Daarom is het bij het opzuigen van het supernatans met een pipet van cruciaal belang om het supernatans voorzichtig en grondig te verwijderen om de zuiverheid van EV's te maximaliseren.</li>
	<li>Verwijder het supernatans en verkrijg de EV-pellet. Resuspendeer het met 1 ml PBS, breng het over in een centrifugebuis van 1 ml en bewaar het in een koelkast van 4 °C voor latere detectie. NOTITIE: De pellet is mogelijk niet zichtbaar voor het blote oog. Daarom is het bij het opzuigen van het supernatans met een pipet van cruciaal belang om het supernatans voorzichtig en grondig te verwijderen om de zuiverheid van EV's te maximaliseren. Als de monsters voor een langere periode niet nodig zijn, bewaar ze dan in een koelkast van -80 °C.</li>
</ol>

Ultracentrifuge-gebaseerde isolatie van extracellulaire blaasjes uit menselijke ADSC's

<ol><li>Al-Ghadban, S., Artiles, M., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+stem+cells+in+regenerative+medicine%3A+Looking+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Adipose stem cells in regenerative medicine: Looking forward.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 837464(2021).</li>
<li>Xin, H., Li, Y., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%2FmiRNAs+as+mediating+cell-based+therapy+of+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Exosomes/miRNAs as mediating cell-based therapy of stroke.</a> Front Cell Neurosci. 8, 377(2014).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tissue+origin+effect+of+extracellular+vesicles+on+cartilage+and+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">The tissue origin effect of extracellular vesicles on cartilage and bone regeneration.</a> Acta Biomater. 125, 253-266 (2021).</li>
<li>Gao, X., Salomon, C., Freeman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+from+adipose+tissue-a+potential+role+in+obesity+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles from adipose tissue-a potential role in obesity and type 2 diabetes.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 8, 202(2017).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+biological+effects+of+extracellular+vesicles+from+adipose-derived+stem+cells+were+markedly+increased+by+low-intensity+ultrasound+stimulation+for+promoting+diabetic+wound+healing%29%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev+Rep%22%5BJournal%5D)">Production and biological effects of extracellular vesicles from adipose-derived stem cells were markedly increased by low-intensity ultrasound stimulation for promoting diabetic wound healing).</a> Stem Cell Rev Rep. 19 (3), 784-806 (2023).</li>
<li>Mou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+from+human+adipose-derived+stem+cells+for+the+improvement+of+angiogenesis+and+fat-grafting+application%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles from human adipose-derived stem cells for the improvement of angiogenesis and fat-grafting application.</a> Plast Reconstr Surg. 144 (4), 869-880 (2019).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+bone+immobilized+with+human+adipose+stem+cells-derived+exosomes+promotes+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered bone immobilized with human adipose stem cells-derived exosomes promotes bone regeneration.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 10 (6), 5240-5254 (2018).</li>
<li>Han, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cell-derived+extracellular+vesicles+inhibit+the+fibrosis+of+fibrotic+buccal+mucosal+fibroblasts+via+the+microRNA-375%2Ffoxf1+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicles inhibit the fibrosis of fibrotic buccal mucosal fibroblasts via the microRNA-375/foxf1 axis.</a> Stem Cells Int. 2021, 9964159(2021).</li>
<li>Brezgin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technological+aspects+of+manufacturing+and+analytical+control+of+biological+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Technological aspects of manufacturing and analytical control of biological nanoparticles.</a> Biotechnol Adv. 64, 108122(2023).</li>
<li>Kim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Character+comparison+of+abdomen-derived+and+eyelid-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Character comparison of abdomen-derived and eyelid-derived mesenchymal stem cells.</a> Cell Prolif. 46 (3), 291-299 (2013).</li>
<li>Gan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+from+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+improve+liver+fibrosis+by+regulating+the+miR-20a-5p%2FTGFBR2+axis+to+affect+the+p38+MAPK%2FNF-%CE%BAB+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Exosomes from adipose-derived mesenchymal stem cells improve liver fibrosis by regulating the miR-20a-5p/TGFBR2 axis to affect the p38 MAPK/NF-κB pathway.</a> Cytokine. 172, 156386(2023).</li>
<li>Jung, M. K., Mun, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+and+imaging+of+exosomes+by+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Sample preparation and imaging of exosomes by transmission electron microscopy.</a> J Vis Exp. (131), e56482(2018).</li>
<li>Han, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-transplantation+of+exosomes+derived+from+hypoxia-preconditioned+adipose+mesenchymal+stem+cells+promotes+neovascularization+and+graft+survival+in+fat+grafting%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Co-transplantation of exosomes derived from hypoxia-preconditioned adipose mesenchymal stem cells promotes neovascularization and graft survival in fat grafting.</a> Biochem Biophys Res Commun. 497 (1), 305-312 (2018).</li>
<li>Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+centrifugation+induces+aggregation+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 4, 29509(2015).</li>
<li>Lamparski, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+clinical+grade+exosomes+derived+from+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells.</a> J Immunol Methods. 270 (2), 211-226 (2002).</li>
<li>Baranyai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+exosomes+from+blood+plasma%3A+Qualitative+and+quantitative+comparison+of+ultracentrifugation+and+size+exclusion+chromatography+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isolation of exosomes from blood plasma: Qualitative and quantitative comparison of ultracentrifugation and size exclusion chromatography methods.</a> PLoS One. 10 (12), e0145686(2015).</li>
<li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+extracellular+vesicles+by+three-dimensional+dynamic+culture+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Engineering extracellular vesicles by three-dimensional dynamic culture of human mesenchymal stem cells.</a> J Extracell Vesicles. 11 (6), e12235(2022).</li>
<li>Eguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+with+cancer+stem+cell-like+properties+secrete+exosomes+and+HSP90+in+a+3D+nanoenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Organoids with cancer stem cell-like properties secrete exosomes and HSP90 in a 3D nanoenvironment.</a> PLoS One. 13 (2), e0191109(2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen financieel belang aan te geven.

Tijdens het formele experimentele proces zijn verschillende punten cruciaal voor het bereiken van de beste experimentele resultaten. Op basis van onze eerdere ervaring is het aan te raden om te kiezen voor doorgang 3-6 ADSC's, omdat deze zorgen voor de best mogelijke celtoestand. Vóór P3 zijn rode bloedcellen, endotheelcellen en andere diverse cellen mogelijk niet gescreend. Na P6 kunnen de cellen geleidelijk verouderen, wat de toestand van uitgescheiden EV's kan beïnvloeden. Ten tweede moet het supernatans worden verzameld wanneer de celconfluentiegraad tussen 80% en 90% ligt om voldoende secretie van zoveel mogelijk EV's te garanderen. Om de maximale zuiverheid van EV's te behouden, moeten de onderzoekers voorzichtig zijn tijdens de eerste drie centrifugaties en ervoor zorgen dat er geen vloeistofresten achterblijven om te voorkomen dat onzuiverheden en pellets worden opgezogen. Zorg er tijdens de laatste twee centrifugaties voor dat het supernatans volledig is verwijderd terwijl u de pellet beschermt.
Ultracentrifugatie is kosteneffectief en vereist geen verdere behandeling. Deze techniek is op grote schaal gebruikt in EV-studies en heeft een bevredigende efficiëntie aangetoond bij het verkrijgen van EV's, zoals bevestigd door karakteriseringsexperimenten. Toch zijn er enkele onvermijdelijke nadelen. Ten eerste is het herstelpercentage van EV's laag. Ten tweede hebben EV's soms de neiging om samen te aggregeren. Bovendien kunnen niet-cellulaire componenten worden geïsoleerd en kunnen sommige EV's tijdens het proces scheuren, wat leidt tot ophoping van puin 14,15,16. Om deze defecten aan te pakken, richt het meeste onderzoek zich op het zuiveren van EV's12,13. Dit protocol omvat echter het hele proces van celkweek tot exosoomzuivering, omdat we geloven dat het hele proces van invloed is op de status en zuiverheid van de uiteindelijke geëxtraheerde EV's. Het is van cruciaal belang om zich tijdens het gebruik aan de bovengenoemde richtlijnen te houden. Bovendien kan het verzamelen van meer supernatans en het implementeren van 3D-celcultuur nuttig zijn, aangezien talrijke onderzoeken hebben aangetoond dat 3D-cultuur effectiever is in het stimuleren van de afscheiding van EV's in vergelijking met 2D-cultuur17,18.
Dit protocol schetst het proces van het extraheren van EV's uit ADSC's met behulp van ultracentrifugatie. Het biedt praktische richtlijnen en stelt onderzoekers in staat om details tijdens de operatie zoveel mogelijk te vermijden. Samenvattend helpt het protocol onderzoekers bij het verbeteren van de kwaliteit van monsters en herinnert het ons eraan dat we ons niet alleen moeten concentreren op de details van elke stap, maar ook het experiment als geheel moeten beschouwen.

De meeste ADSC's zijn afgeleid van vetweefsel en het is aangetoond dat ze de regeneratie en reconstructie van verschillende weefsels en organen bevorderen, waaronder het myocardium, het bot ende huid. Recent onderzoek suggereert dat de regeneratieve functie van ADSC's te wijten kan zijn aan intercellulair contact en de paracriene effecten van de cellen2. Het paracriene effect is een belangrijk middel voor cellen om te interageren en informatie over korte afstanden over te dragen, en deze functie wordt bereikt door extracellulaire vesikels (EV's).
EV's zijn dubbellaagse membraanstructuren die door cellen worden geproduceerd en met een diameter variërend van 40 nm tot 160 nm (met een gemiddelde van ongeveer 100 nm). Ze beïnvloeden verschillende cellulaire functies, zoals de productie van cytokines, celproliferatie, apoptose en metabolisme 3,4. Er zijn talloze onderzoeken uitgevoerd naar de functies van ADSC EV's, waaronder het bevorderen van botregeneratie, regeneratie van mondslijmvliesweefsel, overleving van vetweefsel na weefseltransplantatie en herstel van huidwonden 5,6,7,8. Het enorme potentieel van ADSC EV's in de regeneratieve geneeskunde is evident. Er bestaan verschillende methoden om EV's te extraheren en te scheiden van de supernatant, zoals technieken op basis van centrifugatie, precipitatie, moleculaire grootte, affiniteit en microfluïdica. De ultracentrifugatiemethode wordt algemeen beschouwd als de gouden standaard voor het isoleren van EV's9. Het fundamentele principe van ultracentrifugatie voor EV-scheiding is gebaseerd op het feit dat deeltjes in het monster verschillende bezinkingscoëfficiënten hebben, wat resulteert in hun sedimentatie en aggregatie in verschillende scheidingslagen. Desalniettemin is er nog geen gedetailleerd protocol opgesteld waarin de nadruk wordt gelegd op voorzorgsmaatregelen tijdens ultracentrifugatie.
Daarom schetst deze studie objectief de ADSC-cultuur, het verzamelen van supernatanten en de ultracentrifugatieprocedures en kernpunten van EV's met een logische informatiestroom en duidelijke, formele taal. Dit biedt een waardevolle referentie voor toekomstige experimenten.

<table><tbody><tr><td>Acrodisc Needle Filter of Supor Membrane</td><td>Acros Organics</td><td>4652</td><td>0,22 &mu;m</td></tr><tr><td>Basal Medium For Cell Culture</td><td>OriCell</td><td>BHDM-03011</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum Without EXO + Culture Supplement (For Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells)</td><td>OriCell</td><td>HUXMD-05002</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>OLYMPUS</td><td>Lx70-S8F2</td><td></td></tr><tr><td>Low Speed Centrifuge</td><td>Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co.,Ltd.</td><td>SC-3612</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-nr-05</td><td></td></tr><tr><td>Optima Max-XP Tabletop Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Gentamicin Solution (100x)</td><td>Solarbio</td><td>P1410</td><td></td></tr></tbody></table>

zuivering en karakterisering van extracellulaire blaasjes uit humane van vet afgeleide mesenchymale stamcellen

Purification and Characterization of Extracellular Vesicles from Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells

Humane, van vet afgeleide mesenchymale stamcellen (ADSC's) kunnen de regeneratie en reconstructie van verschillende weefsels en organen bevorderen. Recent onderzoek suggereert dat hun regeneratieve functie kan worden toegeschreven aan cel-celcontact en celparacriene effecten. Het paracriene effect is een belangrijke manier voor cellen om te interageren en informatie over korte afstanden over te dragen, waarbij extracellulaire blaasjes (EV's) een functionele rol spelen als dragers. Er is een aanzienlijk potentieel voor ADSC EV's in de regeneratieve geneeskunde. Meerdere onderzoeken hebben gerapporteerd over de effectiviteit van deze methoden. Er worden momenteel verschillende methoden beschreven voor het extraheren en isoleren van EV's op basis van principes zoals centrifugatie, precipitatie, moleculaire grootte, affiniteit en microfluïdica. Ultracentrifugatie wordt beschouwd als de gouden standaard voor het isoleren van EV's. Toch ontbreekt er nog steeds een nauwgezet protocol om voorzorgsmaatregelen tijdens ultracentrifugatie te benadrukken. Deze studie presenteert de methodologie en cruciale stappen die betrokken zijn bij ADSC-cultuur, supernatantverzameling en EV-ultracentrifugatie. Hoewel ultracentrifugatie kosteneffectief is en geen verdere behandeling vereist, zijn er nog steeds enkele onvermijdelijke nadelen, zoals een laag herstelpercentage en EV-aggregatie.

Ten eerste werden ADSC's gekarakteriseerd en geïdentificeerd, inclusief hun morfologie10 en oppervlakte-antilichamen. Op basis van figuur 2A is het duidelijk dat ADSC's in een spilvorm zijn gerangschikt en een draaikolk vormen na dichte groei. De gekweekte cellen werden gedifferentieerd in adipogene, osteogene en chondrogene cellen en gekleurd met Oil Red O, Alizarin Red en Alcian Blue11. Het geïnduceerde differentiatie-experiment en de flowcytometrie bevestigden dat het inderdaad ADSC's zijn met het potentieel voor multidirectionele differentiatie. 22% van de cellen is echter CD45-positief in de resultaten, wat de conclusie niet zal beïnvloeden omdat voldoende positieve en negatieve antilichamen dit ondersteunen (Figuur 2A,B).
Vervolgens is de identificatie van de geëxtraheerde EV's essentieel. Het omvat voornamelijk drie aspecten: morfologie, deeltjesgrootte en markereiwitten. De TEM-resultaten tonen duidelijk de komvormige EV-structuur met een dubbellaags membraan12 (Figuur 3A). NTA geeft aan dat EV's een deeltjesgrootteverdeling hebben van ongeveer 50-150 nm, met een concentratie van ongeveer 1,6 x10 10 deeltjes/ml (Figuur 3B). Western Blot-analyse laat ook zien dat de markereiwitten van EV's, waaronder CD9, CD63 en TSG10113, soepel tot expressie worden gebracht (Figuur 3C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66585/66585fig01v2.jpg"> Figuur 1: Overzicht van de protocolstappen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66585/66585fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66585/66585fig02.jpg"> Figuur 2: Karakterisering van ADSC's. (A) De morfologie van ADSC's is spoelvormig. ADSC's werden in het medium gekweekt voor respectievelijk adipogene, osteogene en chondrogene differentiatie. Adipogene differentiatie werd geïdentificeerd door Olie Rood O kleuring. Osteogene en chondrogene differentiatie werd bevestigd door respectievelijk Alizarin Red-kleuring en Alcian Blue-kleuring. Schaalbalk: 100 μm. (B) Flowcytometrieanalyse van ADSC's voor MSC-oppervlaktemarkers (CD90, CD105, CD29 en CD73) en hematopoëtische celspecifieke markers (CD31, CD34, CD45 en HLA-DR). De poortstrategie: omcirkel eerst de lege groep. Op basis daarvan omcirkel je achtereenvolgens CD90, CD105, CD29, CD73, CD31, CD34, CD45 en HLA-DR volgens de gelabelde antilichamen van elke groep. Deze figuur is een bewerking van Han, Y. D. et al.13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66585/66585fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66585/66585fig03.jpg"> Figuur 3: Karakterisering van EV's. (A) De TEM-resultaten laten duidelijk de komvormige EV-structuur van het dubbellaagse membraan zien. Schaal balk: 200 nm. (B) NTA geeft aan dat EV's een deeltjesgrootteverdeling hebben van ongeveer 50-150 nm, met een concentratie van ongeveer 1,6 x10 10 deeltjes/ml. (C) Detectie van TSG101-, CD9- en CD63-expressies in exosomen door Western blot. Deze figuur is een bewerking van Han, Y. D. et al.13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66585/66585fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Dit protocol beschrijft alle procedures, van het kweken van humane, van vet afgeleide mesenchymale stamcellen (ADSC's) en het verzamelen van supernatans tot het extra-extracellulaire blaasjes (EV's) met behulp van ultracentrifugatie.

Zuivering en karakterisering van extracellulaire blaasjes uit humane van vet afgeleide mesenchymale stamcellen

Human adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) can promote the regeneration and reconstruction of various tissues and organs. Recent research ...

Ons onderzoek richt zich op de bereiding en zuivering van extracellulaire blaasjes uit humane, van vet afgeleide mesenchymale stamcellen. Het probleem dat we willen oplossen, is hoe we dit proces kunnen standaardiseren en de zuiveringsefficiëntie kunnen verbeteren. Momenteel worden er veel technologieën gebruikt om extracellulaire blaasjes te extraheren, zoals ultracentrifugatie, ultrafiltratie, volume-uitsluitingschromatografie, polymeerprecipitatie, immunoaffiniteitscaptatie, microfluïdische technologie, enzovoort.Ultracentrifugatie wordt echter erkend als een gouden standaard, toegegeven. In de toekomst zullen we ons richten op de toepassing van extracellulaire blaasjes als vectoren, waaronder het vervoeren van MRNA, plasmiden en andere kleine moleculen en het transfecteren ervan in cellen.

purification-characterization-extracellular-vesicles-from-human

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Dit protocol biedt een enzym vrije methode voor het isoleren van mesenchymale stamcellen uit correctie-en lipoaspirate-monsters met behulp van een explant methode. De afwezigheid van harde enzymen of centrifugeer stappen voorziet in klinisch relevante stamcellen die kunnen worden gebruikt voor studies in vitro of teruggeplaatst naar de kliniek.

Een enzym vrije methode voor isolatie en uitbreiding van mesenchymale stamcellen van menselijke adipeus

Dit protocol laat zien hoe de kleine extracellulaire blaasjes (hUC-MSC-sEV's) van menselijke navelstreng-afgeleide mesenchymale stamcellen kunnen worden geïsoleerd met een eenvoudige benchtop-instelling op laboratoriumschaal. De grootteverdeling, eiwitconcentratie, sEV-markers en morfologie van geïsoleerde hUC-MSC-sEV's worden gekenmerkt door respectievelijk nanodeeltjestrackinganalyse, BCA-eiwittest, western blot en transmissie-elektronenmicroscoop.

Een eenvoudige benchtop-filtratiemethode om kleine extracellulaire blaasjes te isoleren van menselijke mesenchymale stamcellen

Dit protocol beschrijft de differentiële centrifugatie voor het isoleren en karakteriseren van representatieve EV's (exosomen en microvesicles) uit gekweekte menselijke MSC's. Verdere toepassingen van deze EV's worden in dit artikel ook toegelicht.

Isolatie, karakterisering en therapeutische toepassing van extracellulaire blaasjes uit gekweekte menselijke mesenchymale stamcellen

Dit protocol beschrijft een methodologie voor het isoleren en identificeren van van vetweefsel afgeleide mesenchymale stamcellen (MSC's) van Sprague Dawley-ratten.

Isolatie en identificatie van mesenchymale stamcellen afgeleid van vetweefsel van Sprague Dawley-ratten

Het vetweefsel is een uitstekende bron van mesenchymale stamcellen. Hier brengen we de stapsgewijze extractie, cultivatie en karakterisering van van vetweefsel afgeleide stamcellen (ADSC's) uit epididymaal vetweefsel van Zwitserse muizen.

Isolatie, in-vitro-expansie en karakterisering van mesenchymale stamcellen uit epididymaal vetweefsel van muizen

Dit protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van het sorteren van extracellulaire blaasjes (EV's) die vrijkomen door mesenchymale stromale cellen. Het richt zich met name op de instelling van het instrument en de optimalisatie van de sorteeromstandigheden. Het doel is om extracellulaire blaasjes te sorteren met behoud van hun kenmerken.

Een succesvolle sortering instellen voor extracellulaire isolatie van blaasjes

Het protocol gebruikt een adipocyt-specifieke CD63-GFP reportermuislijn om de secretie van adipocyten-afgeleide extracellulaire blaasjes (EV's) te visualiseren en te kwantificeren en hun opname door voorlopercellen aan te tonen, waarmee een paracriene route in vetweefsel wordt onthuld.

Karakterisering van door adipocyten afgeleide extracellulaire vesikelsecretie met behulp van een CD63-GFP Reporter Mouse Model in vivo en in vitro

Hier presenteren we een standaardmethode om effectief stamcellen en adipocyten van vetweefsel te isoleren, gekenmerkt door &gt;90% vermindering van verwerkingstijd, hoge cellevensvatbaarheid en brede compatibiliteit.

Efficiënte isolatie van vetweefselstamcellen en adipocyten uit varkensvet vetweefsel

Dit protocol beschrijft de isolatie van vet-afgeleide stromale cellen van lipoaspirate en de oprichting van een 4 mm kritische grootte calvarial defect aan het skelet regeneratie te evalueren.

Reparatie van een kritische grootte Calvarial Defect Model Met behulp van Adipose-afgeleide stromale cellen geoogst uit Lipoaspirate

De werkwijze beschreven isolatie en karakterisering van menselijke pulpa stamcellen (hDPSCs) door...

Isolatie, karakterisering en vergelijkende differentiatie van humane Dental Pulp stamcellen uit permanente tanden met behulp van twee verschillende methoden

Leer de zuivering en karakterisering van extracellulaire blaasjes uit humane vet-afgeleide mesenchymale stamcellen met ultracentrifugatie. Deze gestandaardiseerde methode verbetert de zuiverings-efficiëntie voor therapeutische toepassingen.

Zuivering en karakterisering van extracellulaire blaasjes uit humane van vet afgeleide mesenchymale stamcellen

Meer video's verkennen