Name: Constructie van metabolische netwerken uit evenwicht in blaasjes ter grootte van nano- en micrometer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Leer hoe je metabolische netwerken bouwt in synthetische cellen met membraanreconstitutie en enzymencapsulatie in lipidevesicels. Deze methode ondersteunt autonome groei en toepassingen in diagnostiek en therapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken Aditya Iyer voor het klonen van het pBAD-PercevalHR-gen en Gea Schuurman-Wolters voor haar hulp bij de productie en zuivering van eiwitten. Het onderzoek werd gefinancierd door het NWO Zwaartekracht programma "Building a Synthetic Cell" (BaSyC).

Inkapselingsprotocol voor lipideblaasjes voor complexe eiwitnetwerken

<ol><li>Hirschi, S., Ward, T. R., Meier, W. P., Müller, D. J., Fotiadis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology%3A+bottom-up+assembly+of+molecular+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology: bottom-up assembly of molecular systems.</a> Chem Rev. 122 (21), 16294-16328 (2022).</li>
<li>Ivanov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bottom-up+synthesis+of+artificial+cells%3A+recent+highlights+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Chem+Biomol.+Eng%22%5BJournal%5D)">Bottom-up synthesis of artificial cells: recent highlights and future challenges.</a> Annu Rev Chem Biomol. Eng. 12 (1), 287-308 (2021).</li>
<li>Clomburg, J. M., Crumbley, A. M., Gonzalez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Industrial+biomanufacturing%3A+The+future+of+chemical+production%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Industrial biomanufacturing: The future of chemical production.</a> Science. 355 (6320), (2017).</li>
<li>Shi, T., Han, P., You, C., Zhang, Y. -H. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+synthetic+biology+platform+for+emerging+industrial+biomanufacturing%3A+Bottom-up+pathway+design%5BTitle%5D)+AND+%22Synth+Syst+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An in vitro synthetic biology platform for emerging industrial biomanufacturing: Bottom-up pathway design.</a> Synth Syst Biotechnol. 3 (3), 186-195 (2018).</li>
<li>Wang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-target+and+glucose-responsive+polymersomes+toward+mimicking+endogenous+insulin+secretion+with+improved+hepatic+glucose+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Liver-target and glucose-responsive polymersomes toward mimicking endogenous insulin secretion with improved hepatic glucose utilization.</a> Adv Funct Mater. 30 (13), 1910168(2020).</li>
<li>Kanter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+production+of+scFv+fusion+proteins%3A+an+efficient+approach+for+personalized+lymphoma+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cell-free production of scFv fusion proteins: an efficient approach for personalized lymphoma vaccines.</a> Blood. 109 (8), 3393-3399 (2007).</li>
<li>Zeltins, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+virus-like+particles%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of virus-like particles: a review.</a> Mol Biotechnol. 53 (1), 92-107 (2013).</li>
<li>Jain, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology+and+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Princ+Pract%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology and personalized medicine.</a> Med Princ Pract. 22 (3), 209-219 (2013).</li>
<li>Schwille, P., Frohn, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+protein+functions+and+what+they+may+teach+us%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Hidden protein functions and what they may teach us.</a> Trends Cell Biol. 32 (2), 102-109 (2022).</li>
<li>Sachsenmeier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Industry+5.0-The+relevance+and+implications+of+bionics+and+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Engineering%22%5BJournal%5D)">Industry 5.0-The relevance and implications of bionics and synthetic biology.</a> Engineering. 2 (2), 225-229 (2016).</li>
<li>Schmidt, D., Jiang, Q. -X., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipids+and+the+origin+of+cationic+gating+charges+in+voltage+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors.</a> Nature. 444 (7120), 775-779 (2006).</li>
<li>Godoy-Hernandez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+highly+stable+membrane+reconstitution+by+LAiR+enables+the+study+of+physiological+integral+membrane+protein+functions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Cent+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid and highly stable membrane reconstitution by LAiR enables the study of physiological integral membrane protein functions.</a> ACS Cent Sci. 9 (3), 494-507 (2023).</li>
<li>Sikkema, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+by+ionic+strength+and+safety+check+by+cyclic-di-AMP+in+the+ABC+transporter+OpuA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Gating by ionic strength and safety check by cyclic-di-AMP in the ABC transporter OpuA.</a> Sci Adv. 6 (47), 7697(2020).</li>
<li>Foucaud, C., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactose+transport+system+of+Streptococcus+thermophilus.+Functional+reconstitution+of+the+protein+and+characterization+of+the+kinetic+mechanism+of+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Lactose transport system of Streptococcus thermophilus. Functional reconstitution of the protein and characterization of the kinetic mechanism of transport.</a> J Biol Chem. 267 (31), 22087-22094 (1992).</li>
<li>Yoneda, J. S., Sebinelli, H. G., Itri, R., Ciancaglini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+on+solubilization+and+lipid+reconstitution+of+Na%2CK-ATPase%3A+enzyme+kinetic+and+biophysical+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Rev%22%5BJournal%5D)">Overview on solubilization and lipid reconstitution of Na,K-ATPase: enzyme kinetic and biophysical characterization.</a> Biophys Rev. 12 (1), 49-64 (2020).</li>
<li>Simidjiev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+large%2C+ordered+lamellae+from+non-bilayer+lipids+and+integral+membrane+proteins+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of large, ordered lamellae from non-bilayer lipids and integral membrane proteins in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci. 97 (4), 1473-1476 (2000).</li>
<li>Harris, N. J., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+and+stability+of+membrane+transport+proteins+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+BBA+-+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Folding and stability of membrane transport proteins in vitro.</a> Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 1818 (4), 1055-1066 (2012).</li>
<li>Jackson, M. L., Litman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin-egg+phosphatidylcholine+reconstitution+by+an+octyl+glucoside+dilution+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+BBA+-+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin-egg phosphatidylcholine reconstitution by an octyl glucoside dilution procedure.</a> Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 812 (2), 369-376 (1985).</li>
<li>Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+reconstitution+of+ABC+transporters+and+assays+of+translocator+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function.</a> Nat Protoc. 3 (2), 256-266 (2008).</li>
<li>Rigaud, J. -L., Pitard, B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%3A+application+to+energy-transducing+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+BBA+-+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins.</a> Biochim Biophys Acta BBA - Bioenerg. 1231 (3), 223-246 (1995).</li>
<li>Szoka, F., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+preparation+of+liposomes+with+large+internal+aqueous+space+and+high+capture+by+reverse-phase+evaporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation.</a> Proc Natl Acad Sci. 75 (9), 4194-4198 (1978).</li>
<li>Poolman, B., et al. Synthetic Organelles for Energy Conservation and Delivery of Building Blocks for Lipid Biosynthesis. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.researchsquare.com/article/rs-3385355/v1">https://www.researchsquare.com/article/rs-3385355/v1</a> (2023).</li>
<li>Lee, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosynthetic+artificial+organelles+sustain+and+control+ATP-dependent+reactions+in+a+protocellular+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Photosynthetic artificial organelles sustain and control ATP-dependent reactions in a protocellular system.</a> Nat Biotechnol. 36 (6), 530-535 (2018).</li>
<li>Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aM%C3%A9l%C3%A9ard%2C+P+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. , Elsevier. 161-176 (2009).</li>
<li>Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+a+transmembrane+protein%2C+the+voltage-gated+ion+channel%2C+KvAP%2C+into+giant+unilamellar+vesicles+for+microscopy+and+patch+clamp+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, KvAP, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies.</a> J. Vis. Exp. (95), e52281(2015).</li>
<li>Doeven, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lateral+mobility+and+function+of+membrane+proteins+incorporated+into+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles.</a> Biophys J. 88 (2), 1134-1142 (2005).</li>
<li>Pols, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+metabolic+network+for+physicochemical+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A synthetic metabolic network for physicochemical homeostasis.</a> Nat Commun. 10 (1), 4239(2019).</li>
<li>Bailoni, E., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+recycling+fuels+sustainable+glycerol+3-phosphate+formation+in+synthetic+cells+fed+by+dynamic+dialysis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">ATP recycling fuels sustainable glycerol 3-phosphate formation in synthetic cells fed by dynamic dialysis.</a> ACS Synth Biol. 11 (7), 2348-2360 (2022).</li>
<li>Van Der Heide, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+osmotic+signal+and+osmosensing+mechanism+of+an+ABC+transport+system+for+glycine+betaine%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">On the osmotic signal and osmosensing mechanism of an ABC transport system for glycine betaine.</a> EMBO J. 20 (24), 7022-7032 (2001).</li>
<li>Van'T Klooster, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+lipid+requirements+of+the+lysine+transporter+Lyp1+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane lipid requirements of the lysine transporter Lyp1 from Saccharomyces cerevisiae.</a> J Mol Biol. 432 (14), 4023-4031 (2020).</li>
<li>Lou, G., Anderluzzi, G., Woods, S., Roberts, C. W., Perrie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+microfluidic-based+approach+to+formulate+size-tuneable+large+unilamellar+cationic+liposomes%3A+Formulation%2C+cellular+uptake+and+biodistribution+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">A novel microfluidic-based approach to formulate size-tuneable large unilamellar cationic liposomes: Formulation, cellular uptake and biodistribution investigations.</a> Eur J Pharm Biopharm. 143, 51-60 (2019).</li>
<li>Weiss, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+bottom-up+assembly+of+mechanically+stabilized+synthetic+cells+by+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Sequential bottom-up assembly of mechanically stabilized synthetic cells by microfluidics.</a> Nat Mater. 17 (1), 89-96 (2018).</li>
<li>Pols, T., Singh, S., Deelman-Driessen, C., Gaastra, B. F., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymology+of+the+pathway+for+ATP+production+by+arginine+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Enzymology of the pathway for ATP production by arginine breakdown.</a> FEBS J. 288 (1), 293-309 (2021).</li>
<li>Yandrapalli, N., Robinson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+capacity+microfluidic+trapping+of+giant+vesicles+for+high-throughput+membrane+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Ultra-high capacity microfluidic trapping of giant vesicles for high-throughput membrane studies.</a> Lab Chip. 19 (4), 626-633 (2019).</li>
<li>Ganzinger, K. A., et al. Microfluidic trapping of vesicles reveals membrane-tension dependent FtsZ cytoskeletal re-organisation. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://biorxiv.org/lookup/doi/10.1101/791459">http://biorxiv.org/lookup/doi/10.1101/791459</a> (2019).</li>
<li>Elias, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+characterization+of+biomimetic+membrane+mechanics+with+an+on-chip+micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Micro+Nano+Eng%22%5BJournal%5D)">Microfluidic characterization of biomimetic membrane mechanics with an on-chip micropipette.</a> Micro Nano Eng. 8, 100064(2020).</li>
<li>Robinson, T., Kuhn, P., Eyer, K., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+trapping+of+giant+unilamellar+vesicles+to+study+transport+through+a+membrane+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microfluidic trapping of giant unilamellar vesicles to study transport through a membrane pore.</a> Biomicrofluidics. 7 (4), 044105(2013).</li>
<li>Cooper, A., Girish, V., Subramaniam, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotic+Pressure+Enables+High-Yield+Assembly+of+Giant+Vesicles+in+Solutions+of+Physiological+Ionic+Strengths%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Osmotic Pressure Enables High-Yield Assembly of Giant Vesicles in Solutions of Physiological Ionic Strengths.</a> Langmuir. 39 (15), 5579-5590 (2023).</li>
<li>Tantama, M., Martínez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+energy+status+in+live+cells+with+a+fluorescent+biosensor+of+the+intracellular+ATP-to-ADP+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio.</a> Nat Commun. 4 (1), 2550(2013).</li>
<li>Setyawati, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstitution+of+dynamically+interacting+integral+membrane+subunits+of+energy-coupling+factor+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstitution of dynamically interacting integral membrane subunits of energy-coupling factor transporters.</a> eLife. 9, e64389(2020).</li>
<li>Oropeza-Guzman, E., Ríos-Ramírez, M., Ruiz-Suárez, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+the+coffee+ring+effect+for+a+defect-free+electroformation+of+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Leveraging the coffee ring effect for a defect-free electroformation of giant unilamellar vesicles.</a> Langmuir. 35 (50), 16528-16535 (2019).</li>
<li>Estes, D. J., Mayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroformation+of+giant+liposomes+from+spin-coated+films+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Electroformation of giant liposomes from spin-coated films of lipids.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 115-123 (2005).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerend financieel belang.

We presenteren een protocol voor de synthese van (membraan)eiwit met lipideblaasjes van minder dan een micrometer grootte (proteoLUV's), en de omzetting van proteoLUV's in reus-unilamellaire blaasjes (proteoGUV's). Het protocol moet van toepassing zijn op de reconstitutie van andere membraaneiwitten 13,19,30,40 en de inkapseling van andere metabole netwerken dan de hier gepresenteerde L-arginineafbraak- en glycerol-3-fosfaatsyntheseroutes.
De reconstitutie van membraaneiwitten in liposomen levert over het algemeen een willekeurige oriëntatie van de eiwitten binnen het lipidemembraan op. Voor ArcD en Glpt doet de oriëntatie er niet toe, omdat de eiwitten bidirectioneel werken en de opgeloste stoffen bewegen afhankelijk van het teken van de totale elektrochemische potentiaal. Voor eiwitten die in één richting functioneren, zal de helft van de moleculen niet beschikbaar zijn voor activiteit wanneer hun oriëntatie 50/50 is.
De extrusie van blaasjes door een polycarbonaatfilter vernauwt de grootteverdeling en de blaasjes worden homogener naarmate de poriegrootte van de filters kleiner is. Kleinere blaasjes gaan echter ten koste van een kleiner volume en dus een zeer klein aantal eiwitten (enzymen, membraaneiwitten) per blaasje. Om het aantal LUV's waarbij een of meer componenten ontbreken tot een minimum te beperken, kan de concentratie van de eiwitten worden aangepast zoals weergegeven in figuur 3A,B, maar bij zeer kleine blaasjes zijn stochastische effecten onvermijdelijk.
De gel-geassisteerde zwellingsmethode is gebaseerd op de afzetting van gesoniceerde blaasjes (SUV's) op een gedroogd agarose-oppervlak. Tijdens het droogproces wordt een concentratiegradiënt van blaasjes gevormd en de lipidenconcentratie is het hoogst aan de rand van de plek. Dit komt door een fenomeen dat bekend staat als het koffievlekeffect 41,42. Als gevolg hiervan bevat slechts een klein gebied in de vlek een concentratie lipiden die geschikt zijn voor GUV-vorming. Cirkelvormige ongelijk geconcentreerde lipidevlekken resulteren in grote ongebruikte gebieden die niet beschikbaar zijn voor blaasjesfusie; vandaar dat de efficiëntie van GUV-vorming bij deze aanpak laag wordt. Om de opbrengst van GUV's te verhogen, moet men streven naar een uniforme lipideafzetting, die kan worden bereikt door coating42 te draaien of gebruik te maken van het koffievlekeffect41.
Verdere opmerkingen over het protocol:
Er moet voor worden gezorgd dat gemiddeld meerdere membraaneiwitten (>10) per blaasje worden gereconstitueerd om stochastische effecten te voorkomen. Vermijd dus lipide-eiwitverhoudingen hoger dan 400:1 w/w. Voor de meeste eiwitten wordt uitgegaan van een willekeurige oriëntatie.
Idealiter is het volume van de totale membraaneiwitten zo klein mogelijk en komt het in ieder geval niet boven de 10-20% van het liposoomvolume uit. Door grotere volumes toe te voegen, wordt er meer wasmiddel geïntroduceerd en kunnen de meeste voorgevormde liposomen lyseren, wat een negatief effect kan hebben op de efficiëntie van de reconstitutie.
Pre-equilibratie van de extruder met de juiste oplossing is belangrijk om verdunning van de componenten tijdens de inkapseling te voorkomen. Idealiter zou de pre-equilibratieoplossing ook de oplosbare enzymen moeten bevatten, maar het opnemen van enzymen kan te duur zijn vanwege het relatief grote volume dat nodig is voor de pre-equilibratie van de extruder. Daarom laten we deze componenten meestal weg en accepteren we een verdunning van 5% van de enzymen.
Ionoforen moeten worden toegevoegd aan de mengsels die proteoliposomen bevatten, omdat de moleculen sterk hydrofoob zijn en aan oppervlakken kunnen adsorberen als er geen blaasjes aanwezig zijn. Er moet voor worden gezorgd dat de hoeveelheid toegevoegd oplosmiddel laag is (<1% van het totale reactievolume). Er worden controles uitgevoerd om te controleren of de oplosmiddelen de metabolische netwerken in de blaasjes niet beïnvloeden. Ionofoorconcentraties van ongeveer 1 μM zijn over het algemeen veilig voor totale lipideconcentraties van ~3 mg/ml.
Zorg ervoor dat de druppels goed worden gedroogd. Als de druppels niet droog genoeg zijn, is de vorming van GUV minder efficiënt, omdat lipiden lipideaggregaten vormen en MLV's kunnen worden gevormd wanneer de zwellingsoplossing wordt toegevoegd.
Glucose wordt gebruikt om de osmolariteit van het externe met het interne medium af te stemmen; deze laatste bevat sucrose in plaats van glucose om de dichtheid van de blaasjes te verhogen en zo de sedimentatie van de GUV's te vergemakkelijken. Bovendien versterkt glucose in de externe omgeving het fasecontrast, waardoor het blaasje beter zichtbaar wordt.
Stochastische effecten zijn veel minder een probleem met GUV's; Maar hier kan de verhouding tussen oppervlak en volume onaanvaardbaar laag worden, zodat het aantal membraaneiwitten (bijv. transporters) beperkend wordt voor het interne metabolische netwerk. De methode die in dit protocol wordt beschreven, maakt geen nauwkeurige controle over de grootte van de proteoGUV's mogelijk, maar de meeste vallen in het groottebereik van 5-50 μm.
Concluderend biedt het hier gepresenteerde werk een uitgebreid overzicht van membraaneiwitreconstitutie en enzyminkapseling in lipideblaasjes van verschillende groottes. We demonstreren de constructie van functionele blaasjes voor de synthese van ATP en bouwstenen van eenvoudige precursoren zoals aminozuren en glycerol. Het reconstitueren van membraaneiwitten in GUV's blijft een uitdaging, maar de hier gepresenteerde protocollen maken de weg vrij voor verdere ontwikkelingen in bottom-up synthetisch biologisch onderzoek.

Het vakgebied van bottom-up synthetische biologie richt zich op het bouwen van (minimale) cellen 1,2 en metabole bioreactoren voor biotechnologische 3,4 of biomedische doeleinden 5,6,7,8. De constructie van synthetische cellen biedt een uniek platform dat onderzoekers in staat stelt om (membraan)eiwitten te bestuderen in goed gedefinieerde omstandigheden die die van inheemse omgevingen nabootsen, waardoor opkomende eigenschappen en verborgen biochemische functies van eiwitten en reactienetwerken kunnen worden ontdekt9. Als tussenstap naar een autonoom functionerende synthetische cel worden modules ontwikkeld die essentiële kenmerken van levende cellen vastleggen, zoals metabolisch energiebehoud, eiwit- en lipidensynthese en homeostase. Dergelijke modules vergroten niet alleen ons begrip van het leven, maar hebben ook potentiële toepassingen op het gebied van geneeskunde8 en biotechnologie10.
Transmembraaneiwitten vormen de kern van vrijwel elk metabolisch netwerk, omdat ze moleculen in of uit de cel transporteren, signalen geven en reageren op de kwaliteit van de omgeving, en tal van biosynthetische rollen spelen. De engineering van metabole modules in synthetische cellen vereist dus in de meeste gevallen de reconstitutie van integrale en/of perifere membraaneiwitten tot een membraandubbellaag die is samengesteld uit specifieke lipiden en een hoge integriteit (lage permeabiliteit). De omgang met deze membraaneiwitten is uitdagend en vereist specifieke kennis en experimentele vaardigheden.
Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om membraaneiwitten in fosfolipideblaasjes te reconstrueren, meestal met als doel de functie11,12, regulatie13, kinetische eigenschappen14,15, lipideafhankelijkheid15,16 en/of stabiliteit17 van een specifiek eiwit te bestuderen. Deze methoden omvatten de snelle verdunning van detergent-oplosbaar eiwit in waterige media in aanwezigheid van lipiden18, de verwijdering van detergenten door het incuberen van detergent-solubel eiwit met detergent-gedestabiliseerde lipideblaasjes en absorptie van het detergent(en) op polystyreenkorrels19, of het verwijderen van detergenten door dialyse of grootte-uitsluitingschromatografie20. Organische oplosmiddelen zijn gebruikt om lipideblaasjes te vormen, bijvoorbeeld via de vorming van olie-water-interfasen21, maar de meeste integrale membraaneiwitten worden geïnactiveerd wanneer ze worden blootgesteld aan dergelijke oplosmiddelen.
In ons laboratorium reconstrueren we meestal membraaneiwitten door middel van de detergent-absorptiemethode om grote unilamellaire blaasjes (LUV's) te vormen19. Deze methode maakt de co-reconstitutie van meerdere membraaneiwitten en de inkapseling in het blaasjeslumen van enzymen, metabolieten en sondes mogelijk22,23. De membraaneiwitbevattende LUV's kunnen worden omgezet in reusachtige-unilamellaire blaasjes (GUV's) met/zonder inkapseling van in water oplosbare componenten, met behulp van elektroformatie24 of gelondersteunde zwelling25 en specifieke omstandigheden om de integriteit van de membraaneiwitten te behouden26.
Dit artikel presenteert een protocol voor de reconstitutie in LUV's van een uit evenwicht zijnd metabolisch netwerk dat ATP regenereert door de afbraak van L-arginine in L-ornithine27. De vorming van ATP gaat gepaard met de productie van glycerol-3-fosfaat (G3P), een belangrijke bouwsteen voor de fosfolipidensynthese22,28. De metabole route bestaat uit twee integrale membraaneiwitten, een arginine/ornithine (ArcD) en een G3P/Pi-antiporter (GlpT). Daarnaast zijn drie oplosbare enzymen (ArcA, ArcB, ArcC) nodig voor de recycling van ATP, en GlpK wordt gebruikt om glycerol om te zetten in glycerol 3-fosfaat, waarbij gebruik wordt gemaakt van het ATP uit de afbraak van L-arginine, zie figuur 1 voor een schematisch overzicht van de route. Dit protocol vormt een goed uitgangspunt voor de toekomstige constructie van nog complexere reactienetwerken - voor de synthese van lipiden of eiwitten of de deling van cellen. De lipidensamenstelling van de blaasjes ondersteunt de activiteit van een breed scala aan integrale membraaneiwitten en is geoptimaliseerd voor het transport van diverse moleculen in of uit de blaasjes 27,29,30.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig01v2.jpg"> Figuur 1: Overzicht van de route voor ATP-productie en glycerol-3-fosfaatsynthese en -uitscheiding. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Kortom, gezuiverde membraaneiwitten (opgelost in dodecyl-β-D-maltoside, DDM) worden toegevoegd aan voorgevormde lipideblaasjes die zijn gedestabiliseerd met Triton X-100, waardoor de eiwitten in het membraan kunnen worden ingebracht. De wasmiddelmoleculen worden vervolgens (langzaam) verwijderd door de toevoeging van geactiveerde polystyreenkorrels, wat resulteert in de vorming van goed afgesloten proteoliposomen. Oplosbare componenten kunnen vervolgens aan de blaasjes worden toegevoegd en worden ingekapseld via vries-dooicycli, waardoor de moleculen worden opgesloten in het proces van membraanfusie. De verkregen blaasjes zijn zeer heterogeen en veel zijn multilamellair. Ze worden vervolgens geëxtrudeerd door een polycarbonaatfilter met een poriegrootte van 400, 200 of 100 nm, wat blaasjes van meer uniforme grootte oplevert; Hoe kleiner de poriegrootte, hoe homogener en unilamellair de blaasjes, maar tegen de prijs van een kleiner inwendig volume. Niet-opgenomen eiwitten en kleine moleculen worden uit de externe oplossing verwijderd door middel van grootte-uitsluitingschromatografie. De proteoLUV's kunnen worden omgezet in blaasjes ter grootte van een micrometer door middel van gel-geassisteerde zwelling, en deze proteoGUV's worden vervolgens verzameld en gevangen in een microfluïdische chip voor microscopische karakterisering en manipulatie. Figuur 2 geeft een schematisch overzicht van het volledige protocol.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig02v2.jpg"> Figuur 2: Overzicht van het protocol voor het reconstitueren van membraaneiwitten en het inkapselen van enzymen en wateroplosbare componenten in lipideblaasjes met een submicrometer (LUV's) en micrometergrootte (GUV's). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
De reconstitutie- en inkapselingsprotocollen werken goed en de functionaliteit van de eiwitten blijft behouden, maar de proteoLUV's en proteoGUV's zijn heterogeen van grootte. Microfluïdische benaderingen31,32 maken de vorming van blaasjes ter grootte van een micrometer mogelijk die homogener van grootte zijn, maar functionele reconstitutie van membraaneiwitten is over het algemeen niet mogelijk omdat resterend oplosmiddel in de dubbellaag de eiwitten inactiveert. De proteoLUV's variëren in grootte van 100 tot 400 nm, en bij lage concentraties enzymen kan de inkapseling leiden tot blaasjes met onvolledige metabole routes (stochastische effecten; zie figuur 3). LUV's zijn ideaal voor het bouwen van specifieke metabolische modules, zoals hier te zien is voor de productie van ATP en bouwstenen zoals G3P. Dergelijke proteoLUV's kunnen mogelijk worden ingekapseld in GUV's en dienen als organelachtige compartimenten voor de gastheerblaasjes.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig03v2.jpg"> Figuur 3: Aantal moleculen per blaasje met een diameter van 100, 200 of 400 nm. (A) Wanneer de ingekapselde eiwitten (enzymen, sondes) zich in het bereik van 1-10 μM bevinden. (B) De reconstitutie wordt gedaan bij 1 tot 1.000, 1 tot 10.000 en 1 tot 100.000 membraaneiwitten per lipide (mol/mol). We gaan ervan uit dat moleculen in de aangegeven concentraties worden ingekapseld en in het membraan worden opgenomen in deze eiwit-lipideverhoudingen. Voor sommige enzymen hebben we gezien dat ze zich binden aan membranen, waardoor hun schijnbare concentratie in de blaasjes kan toenemen. Afkorting: LPR = Lipid-Protein-Ratio <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9414-25g</td><td></td></tr><tr><td>Amicon cut-off filter</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Milipore centrifugal filter units Amicon Ultra&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BioBeads</td><td>BioRad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>CHCl3</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>MFCD00000826</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Formedium</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Sucrose</td><td>Formedium</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>DDM</td><td>Glycon</td><td>D97002 -C</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl Ether</td><td>Biosolve</td><td>52805</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855-100ml</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DOPE</td><td>Avanti</td><td>850725P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DOPG</td><td>Avanti</td><td>840475P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Formedium&nbsp;</td><td>DTT005</td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td>J.T.Baker Avantor</td><td>MFCD00003568</td><td></td></tr><tr><td>Extruder</td><td>Avestin Inc</td><td>LF-1</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimeter</td><td>Jasco</td><td>Spectrofluorometer FP-8300</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>BOOM</td><td>51171608</td><td></td></tr><tr><td>Gravity flow column</td><td>Bio-Rad</td><td>732-1010</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton syringe 100 &micro;L</td><td>Hamilton</td><td>7656-01</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton syringe 1000 &micro;L</td><td>Hamilton</td><td>81320</td><td></td></tr><tr><td>Handheld LCP dispenser</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>620-411-00</td><td></td></tr><tr><td>Handheld Sonicator</td><td>Hielscher Ultrasound Technology</td><td>UP50H</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>BOOM</td><td>x76021889.1000</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Roth</td><td>X998.4-250g</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Supelco</td><td>1.05099.1000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>BOOM</td><td>76028270.1</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Supelco</td><td>1.04873.1000</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech Science</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>Large Falcon tube centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5810 R</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5006-100G</td><td></td></tr><tr><td>Light microscope</td><td>Leica</td><td>DM LS2</td><td></td></tr><tr><td>L-Ornithine</td><td>Roth</td><td>T204.1</td><td></td></tr><tr><td>LSM Laser Scanning Confocal Microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM 710 ConfoCor 3</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Microfluidic chip</td><td>Homemade&nbsp;</td><td>PDMS based</td><td>DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J</td></tr><tr><td>Na-ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754-1G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Supelco</td><td>1.06404.1000</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop Spectrometer</td><td>Isogen Life Science</td><td>ND-1000 spectrophotometer NanoDrop</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Supelco</td><td>1.06498.1000</td><td></td></tr><tr><td>Needles for GUVs</td><td>Henke-Ject</td><td>14-14575</td><td>27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm</td></tr><tr><td>Needles for microfluidics</td><td>Henke-Ject</td><td>14-15538</td><td>18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm</td></tr><tr><td>Ni2+ Sepharose</td><td>Cytiva</td><td>17526802</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>VWR</td><td>83007-210</td><td></td></tr><tr><td>Osmolality meter</td><td>Gonotec Salmenkipp</td><td>Osmomat 3000 basic freezing point osmometer</td><td></td></tr><tr><td>Plasmacleaner</td><td>Plasma Etch</td><td>PE-Avenger</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonate filter</td><td>Cytiva Whatman</td><td>Nuclepor Track-Etch Membrane Product: 10417104</td><td>0.4 &micro;m</td></tr><tr><td>Polycarbonate ultracentrifuge tube</td><td>Beckman Coulter</td><td>355647</td><td></td></tr><tr><td>Pyranine</td><td>Acros Organics</td><td>H1529-1G</td><td></td></tr><tr><td>Quartz cuvette (black)</td><td>Hellma Analytics</td><td>108B-10-40</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-75 resin&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0050-01</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Sonics Sonics &amp; Materials INC</td><td>Sonics vibra cell</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>Sarstedt</td><td>Filtropur S plus 0.2</td><td>0.2 &micro;m</td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>A-42467</td><td></td></tr><tr><td>Tabletop centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>centrifuge 5418</td><td></td></tr><tr><td>Teflon spacer</td><td>Homemade&nbsp;</td><td>Teflon based</td><td>45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm</td></tr><tr><td>Tris</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1086.1000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima Max-E</td><td></td></tr><tr><td>UV lamp</td><td>Spectroline</td><td>ENB-280C/FE</td><td></td></tr><tr><td>UV/VIS Spectrometer</td><td>Jasco</td><td>V730 spectrophotometer</td><td></td></tr><tr><td>Valinomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0627-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Widefield fluorescence microscope</td><td>Zeiss</td><td>AxioObserver</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Casein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5890-500g</td><td></td></tr></tbody></table>

constructie van metabolische netwerken uit evenwicht in blaasjes ter grootte van nano- en micrometer

Construction of Out&#45;of&#45;Equilibrium Metabolic Networks in Nano&#45; and Micrometer&#45;Sized Vesicles

We presenteren een methode om complexe eiwitnetwerken in blaasjes op te nemen, met integrale membraaneiwitten, enzymen en op fluorescentie gebaseerde sensoren, met behulp van gezuiverde componenten. Deze methode is relevant voor het ontwerp en de bouw van bioreactoren en de studie van complexe metabole reactienetwerken die uit evenwicht zijn. We beginnen met het reconstrueren van (meerdere) membraaneiwitten tot grote unilamellaire blaasjes (LUV's) volgens een eerder ontwikkeld protocol. Vervolgens kapselen we een mengsel van gezuiverde enzymen, metabolieten en op fluorescentie gebaseerde sensoren (fluorescerende eiwitten of kleurstoffen) in via vries-dooi-extrusie en verwijderen we niet-opgenomen componenten door centrifugatie en/of grootte-uitsluitingschromatografie. De prestaties van de metabole netwerken worden in realtime gemeten door de ATP/ADP-verhouding, metabolietconcentratie, interne pH of andere parameters te bewaken door middel van fluorescentie-uitlezing. Onze membraaneiwitbevattende blaasjes met een diameter van 100-400 nm kunnen worden omgezet in reuzen-unilamellaire blaasjes (GUV's), met behulp van bestaande maar geoptimaliseerde procedures. De aanpak maakt het mogelijk om oplosbare componenten (enzymen, metabolieten, sensoren) op te nemen in blaasjes ter grootte van een micrometer, waardoor het volume van de bioreactoren met ordes van grootte wordt opgeschaald. Het metabolische netwerk dat GUV's bevat, zit gevangen in microfluïdische apparaten voor analyse door optische microscopie.

De reconstitutie van opgeloste membraaneiwitten in liposomen vereist de destabilisatie van voorgevormde blaasjes. De toevoeging van kleine hoeveelheden Triton X-100 resulteert in eerste instantie in een toename van de absorptie bij 540 nm (A540) als gevolg van een toename van de lichtverstrooiing door de zwelling van de blaasjes (Figuur 4). De maximale A540-waarde is het punt waar de liposomen verzadigd zijn met wasmiddel (Rsat), waarna elke verdere toevoeging van Triton X-100 zal resulteren in gedeeltelijke oplosbaarheid van de blaasjes. Bij Rsol zijn de liposomen volledig oplosbaar (Figuur 4). Voor de reconstitutie van membraaneiwitten gebruiken we meestal blaasjes die tot 60% voorbij Rsat zijn gedestabiliseerd (aangegeven met pijl).
Het gereconstitueerde membraaneiwit ArcD wordt gebruikt om L-arginine in en L-ornithine uit de blaasjes te transporteren en wordt samen met de ingekapselde enzymen ArcA, ArcB en ArcC gebruikt om ATP uit ADP en anorganisch fosfaat te recyclen. GlpT is een glycerol 3-fosfaat/fosfaat antiporter die samen met GlpK nodig is voor de synthese (en uitscheiding) van glycerol 3-fosfaat uit glycerol plus ATP geproduceerd door de afbraak van L-arginine. De toevoeging van 5 mM L-arginine bij t = 0 aan de proteoliposomen resulteert in een sterke toename van de verhouding van de PercevalHR-fluorescentie bij 500 en 430 nm excitatie39, die de ATP/ADP-verhouding in de blaasjes weerspiegelt (Figuur 5). Na toevoeging van glycerol wordt de ATP gebruikt voor de synthese van glycerol 3-fosfaat, wat resulteert in een verlaging van de ATP/ADP-verhouding28. De afbraak van L-arginine leidt ook tot pH-veranderingen, die kunnen worden gekwantificeerd met behulp van pyranine of pHluorin27.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig05v2.jpg"> Figuur 5: Recycling van ATP via de L-arginine-afbraakroute. LUV's van 2,7 mg lipide/ml worden in een cuvet geplaatst en de verhouding van fluorescentie bij 500 nm en 430 nm wordt geregistreerd. 5 mM L-arginine wordt toegevoegd bij t = 0. De F500/F430-verhouding is een maat voor de ATP/ADP-verhouding in de blaasjes. Afkorting: LUV's = large-unilamellaire vesikels. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
De ATP-producerende LUV's kunnen ook worden gebruikt om GUV's te vormen. Rehydratatie van gedroogde proteo-LUV's op een LGT-agarosegel resulteert in de vorming van blaasjes ter grootte van een micrometer (Figuur 6). De vorming van proteo-GUV's in de gedroogde LUV-vlekken hangt sterk af van de lokale concentratie van lipiden en de mate van uitdroging. Sommige gebieden hebben grote plekken met GUV's, terwijl op andere plaatsen in dezelfde druppel geen of weinig GUV's kunnen worden gevormd. De vorming van GUV's via LGT-agarose-geassisteerde zwelling resulteert in een reeks GUV-groottes, meestal van enkele micrometers tot meer dan 50 μm.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig06v2.jpg"> Figuur 6: DIC-beelden van proteoGUV's gevormd door gel-geassisteerde zwelling. Schaal balk = 25 μm. Afkortingen: DIC = differentieel interferentiecontrast; GUVs = reusachtig-unilammellar blaasjes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
De GUV's worden geoogst en opgesloten in een β-caseïne gepassiveerd PDMS-gebaseerd microfluïdisch apparaat (Figuur 7). Het apparaat is zo ontworpen dat veel blaasjes kunnen worden opgevangen en geanalyseerd binnen een enkel experiment, en het apparaat wordt gebruikt om de externe omgeving te regelen (stroomsnelheid, buffersamenstelling, enz.) 34. Zelfs wanneer het rendement van proteo-GUV's laag is, maakt de constante stroom van GUV's door de microfluïdische chip het mogelijk om veel blaasjes te verzamelen. Zodra er voldoende GUV's zijn opgevangen, wordt het systeem gewassen met een osmotisch uitgebalanceerde buffer om externe componenten zoals oplosbare eiwitten, kleine moleculen en fluorescerende sondes te verwijderen. De wasbuffer wordt vervolgens vervangen door een substraatoplossing van gelijke osmolaliteit met 50 mM KPi (pH 7,0), variërende hoeveelheden glucose (om de osmolaliteit aan te passen) en substraten zoals 10 mM L-arginine. Er wordt een tijdreeksexperiment uitgevoerd op verschillende vallen van de microfluïdische chip en er worden elke 90 s beelden gemaakt (405 nm en 488 nm excitatie wanneer PercevalHR wordt gebruikt). Verder wordt op elk tijdstip een helderveldopname gemaakt. De verhouding van de emissie-intensiteiten na excitatie bij 488 en 405 nm is een maat voor de ADP/ATP-verhouding in de blaasjes.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig07.jpg"> Figuur 7: Insluiting van blaasjes met de microfluïdische chip. (A) Insluiting van de blaasjes, vergezeld van het vermogen om de externe omgeving en het debiet te beheersen. (B) ProteoGUV's gevangen in een microfluïdisch apparaat en geëxciteerd met een laser van 405 nm (groen) en laser 488 (rood). De emissie voor beide kanalen wordt gemeten bij >500 nm. Het helderveldbeeld maakt visualisatie van de blaasjes mogelijk zonder fluorescentie. Schaal balk = 25 μm. Afkorting: GUVs = gigantisch-unilamellaire blaasjes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

We presenteren een protocol voor het reconstitueren van membraaneiwitten en het inkapselen van enzymen en andere in water oplosbare componenten in lipideblaasjes van submicrometer en micrometer grootte.

Constructie van metabolische netwerken uit evenwicht in blaasjes ter grootte van nano- en micrometer

We present a method to incorporate into vesicles complex protein networks, involving integral membrane proteins, enzymes, and fluorescence-based sensors, ...

In Nederland wil het BaSyC-consortium synthetische cellen bouwen uit moleculaire componenten. Het BaSyC-consortium bestaat uit onderzoeksgroepen variërend van moleculaire biologie tot scheikunde, natuurkunde en computationele wetenschappen. Het doel van dit consortium is om een zelfreplicerend systeem te creëren dat in staat is tot autonome groei, om informatie te verzenden en te verdelen.En we richten ons momenteel op het bouwen van moleculaire netwerken die worden geïntegreerd in complexere moleculaire systemen. Recente ontwikkelingen in de synthetische biologie omvatten de engineering van modules voor cellulaire functies, waarbij deze worden geïntegreerd in complexe netwerken voor toepassingen in diagnostiek, therapie, synthetische immunologie en adaptieve materialen. Deze vooruitgang strekt zich uit over groepen in Europa, Amerika en Azië, waarbij zowel top-down als bottom-up benaderingen van synthetische celconstructie worden bevorderd.Huidige technologieën in ons vakgebied omvatten de technische en evolutionaire methoden om metabolische netwerken te construeren en te optimaliseren. We gebruiken AI voor moleculaire selectie en geavanceerde biochemische en biofysische technieken voor het isoleren van componenten en netwerkvorming. We maken ook gebruik van membraanreconstitutie, fysieke inkapseling en visualisatie via fluorescentiespectroscopie en microscopie.Met de integratie van modules neemt het aantal membraaneiwitten en enzymen enorm toe, wat beperkingen oplegt aan onze reconstitutie- en inkapselingstechnologieën. Stochastische inkapseling wordt een probleem met blaasjes van submicrongrootte, en de efficiëntie van het vormen van blaasjes ter grootte van een micrometer neemt af wanneer meerdere membraaneiwitten worden gereconstitueerd in het lipidemembraan. In Groningen hebben we metabolische netwerken ontwikkeld voor ATP-producties en het in stand houden van een toestand uit evenwicht door substraatvoeding en productexport.Bovendien hebben we ATP-recycling gekoppeld aan de synthese en uitscheiding van lipideprecursoren, waardoor secundaire blaasjes lipiden kunnen produceren, wat een aanzienlijke vooruitgang is in ons vakgebied.

construction-out-equilibrium-metabolic-networks-nano-micrometer-sized

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Hierin beschrijven we eenvoudige werkwijzen voor de bereiding van vesicles, de inkapseling van transcriptie en translatie, en de controle van eiwitproductie. De verkregen celvrije systemen kunnen worden gebruikt als een uitgangspunt steeds complexe cellulaire nabootst.

De inkapseling van de Cell-free transcriptie en vertaling Machines in Blaasjes voor de bouw van Cellular Mimics

Het gepresenteerde protocol beschrijft de analyse van membraaneiwitgemedieerde transport op het niveau van enkelvoudige transporteurs met behulp van porie-overspande, oplosmiddelvrije lipide dubbellagen. Dit wordt bereikt door de creatie van in grote aantallen geproduceerde nanopore-arraychips, gecombineerd met zeer parallelle dataverwerving en analyse, waardoor de toekomstige vestiging van membraaneiwiteffectorscreenings mogelijk wordt.

Membraan transportprocessen geanalyseerd door een Highly Parallel Nanopore Chip System aan Single Protein Resolution

Veel eiwitten voeren hun functie uit wanneer ze aan membraanoppervlakken zijn gehecht. De binding van extrinsieke eiwitten op nanodisc-membranen kan indirect worden afgebeeld door transmissie-elektronenmicroscopie. We laten zien dat de karakteristieke stapelvorming (rouleau) van nanodiscs, veroorzaakt door de negatieve kleuring natriumfosfowolframaat, wordt voorkomen door de binding van extrinsiek eiwit.

Methode om te visualiseren en te analyseren Membrane interagerende eiwitten door Transmission Electron Microscopy

Veel proteïnen in de cel zin en membraan kromming veroorzaken. Beschrijven we een methode om te halen membraan nanotubes van lipide blaasjes te bestuderen de interactie van proteïnen of elke kromming-actieve molecuul met gebogen membranen in vitro.

Membraan Nanotubes trekken van Giant Unilamellar blaasjes

Solid-ondersteund, eiwit-vrij, dubbele fosfolipide dubbelgelaagde membranen (DLBM) kunnen worden omgezet in complexe en dynamische lipide nanobuis netwerken en kunnen dienen als 2D onderop modellen van het endoplasmatisch reticulum.

Spontane vorming en omlegging van kunstmatige lipide nanobuis netwerken als een Bottom-Up-Model voor endoplasmatisch Reticulum

Dit protocol beschrijft een proces voor het fabriceren van lipide nanobuisnetwerken met behulp van glijdende kinesinemotiliteit in combinatie met gigantische unilamellaire lipideblaasjes.

Multi-Component Lipid Nanotube Networks fabriceren met behulp van de Gliding Kinesin Motility Assay

Op het snijvlak van organische en waterige oplosmiddelen assembleren op maat gemaakte amfifiele elastine-achtige eiwitten zich in complexe supramoleculaire structuren zoals blaasjes, vezels en coacervaten die worden geactiveerd door omgevingsparameters. De beschreven assemblageprotocollen leveren Op eiwitmembraan gebaseerde compartimenten (PMBC's) met tunable eigenschappen, waardoor de inkapseling van verschillende lading.

Geleid Assemblage van Elastin-achtige eiwitten in gedefinieerde supramoleculaire structuren en cargo-encapsulation in vitro

In dit manuscript demonstreren we de experimentele technieken om het F-actinecytoskelet in te kapselen in gigantische unilamellaire lipideblaasjes (ook wel liposomen genoemd), en de methode om een cortex-biomimicking F-actinelaag te vormen aan de binnenste folder van het liposoommembraan.

In vitro Reconstitutie van het Actin Cytoskelet Inside Giant Unilamellar Vesicles

Het huidige protocol beschrijft octanol-assisted liposome assembly (OLA), een microfluïdische techniek om biocompatibele liposomen te genereren. OLA produceert monodisperse, micron-sized liposomen met efficiënte inkapseling, waardoor onmiddellijke experimenten op de chip mogelijk zijn. Dit protocol is naar verwachting bijzonder geschikt voor synthetische biologie en synthetisch celonderzoek.

On-chip octanol-geassisteerde liposoomassemblage voor bio-engineering

Dit artikel introduceert een eenvoudige reconstitutie in één pot van cytoskeletale netwerken in fasegescheiden reuzenblaasjes. De methode kan worden veralgemeend en toegepast op inkapseling of opsluiting van een breed scala aan biomoleculen.

In vitro Reconstitutie van cytoskeletale netwerken in fasegescheiden gigantische unilamellaire blaasjes (GUV's)

Leer hoe je metabolische netwerken bouwt in synthetische cellen met membraanreconstitutie en enzymencapsulatie in lipidevesicels. Deze methode ondersteunt autonome groei en toepassingen in diagnostiek en therapie.

Constructie van metabolische netwerken uit evenwicht in blaasjes ter grootte van nano- en micrometer

Meer video's verkennen