Kwantificering van de activiteit van het Yersinia pseudotuberculose type III secretiesysteem na ijzerhonger en anaërobe groei

Bacteriële pathogenen gebruiken virulentiefactoren om verschillende niches binnen het gastheerorganisme te koloniseren. We werken eraan om te begrijpen hoe bacteriële pathogenen specifieke omgevingssignalen in gastheerweefsels waarnemen om de expressie van virulentiefactoren te reguleren. De menselijke ziekteverwekker Yersinia pseudotuberculose gebruikt de virulentiefactor van het type drie secretiesysteem om effectoreiwitten in gastheercellen te injecteren.

Het type drie secretiesysteem stelt de bacteriën in staat om de afweermechanismen van de gastheer te ondermijnen en gastheerweefsels te koloniseren. De expressie van het Yersinia Type III secretiesysteem is echter metabolisch belastend, dus de expressie van type drie secretiesysteemgenen wordt strikt gereguleerd als reactie op omgevingsfactoren zoals temperatuur. Onze eerdere publicaties toonden aan dat de expressie van het Yersinia Type III secretiesysteem wordt gecontroleerd door de beschikbaarheid van ijzer en zuurstofspanning via een transcriptiefactor die ISCR wordt genoemd.

Deze bevindingen zijn belangrijk omdat Yersinia gastheerweefsels koloniseert die variëren in hun ijzergehalte en zuurstofspanning. Zo bevat het darmlumen voldoende ijzer voor de groei van Yersinia maar heeft het een lage zuurstofspanning. Weefsels zoals het bloed hebben daarentegen een zeer lage beschikbaarheid van ijzer, maar een hogere zuurstofspanning.

Onze methode stelt ons in staat om Yersinia te kweken in kweekomstandigheden die variëren in de hoeveelheid beschikbaar ijzer en zuurstof, om te bestuderen hoe deze omgevingsfactoren de expressie van het type drie secretiesysteem beïnvloeden. Deze methode zal ons helpen het moleculaire mechanisme te bepalen waarmee de beschikbaarheid van ijzer en zuurstof de expressie van het type drie secretiesysteem regelt, en ons helpen begrijpen hoe dit de uitkomst van Yersinia-infectie regelt. Streep om te beginnen Yersinia Pseudo-tuberculose op Lysogeny bouillon agarplaten.

Incubeer de platen 48 uur bij kamertemperatuur. Zodra zichtbare kolonies zijn gevormd, inoculeert u een enkele geïsoleerde kolonie in vier milliliter M9-media. Kweek het 's nachts bij 26 graden Celsius met beluchting bij 250 RPM.

Plaats een cuvet met de cultuur in een spectrometer en verdun de cultuur vervolgens in 14 milliliter steriel gechelateerd M9-medium zonder ijzersuppletie om een OD600-waarde van 0,1 te bereiken. Plaats de kolven in een shaker van 26 graden Celsius en broed gedurende acht uur uit. Nadat de incubatie is voltooid, gebruik je de cultuur om drie nieuwe culturen te starten; twee voor anaërobe groei en één voor aërobe groei.

Voor aërobe kweek verdunt u de cultuur tot een OD600-waarde van 0,1 in 14 milliliter steriel gechelateerd M9-medium zonder ijzersuppletie. Vervolgens kweken met beluchting bij 26 graden Celsius gedurende 12 uur. Voor anaërobe kweek verdunt u de cultuur in 14 milliliter steriel gechelateerd M9-medium in twee met zuur gewassen glazen buisjes.

Voeg in de eerste tube filtergesteriliseerd ijzersulfaat toe tot een uiteindelijke concentratie van één milligram per liter. Voeg in de tweede tube ijzersulfaat toe voor een uiteindelijke concentratie van 0,01 milligram per liter. Incubeer beide buizen in een anaërobe kamer bij kamertemperatuur gedurende 12 uur.

Induceer vervolgens de activiteit van het type drie secretiesysteem door de anaërobe culturen te verschuiven naar 37 graden Celsius en de incubatie gedurende vier uur voort te zetten. Verdun vervolgens de aëroob groeiende culturen tot een OD600-waarde van 0,2 door 14 milliliter gechelateerde M9-media toe te voegen aan twee met zuur gewassen kolven. Voeg ijzersulfaat in de vereiste eindconcentraties toe aan de kolven.

Incubeer beide kolven met beluchting bij 26 graden Celsius bij 250 RPM gedurende twee uur. Verplaats de culturen na twee uur naar 37 graden Celsius met beluchting bij 250 RPM gedurende vier uur om activiteit van het type drie secretiesysteem te induceren. Na het induceren van het type drie secretiesysteem in Yersinia pseudotuberculose, worden genormaliseerde volumes van deze cultuur geïncubeerd in buisjes van 15 milliliter overgebracht.

Voeg vier microliter runderserumalbumine toe aan elke buis als controle van de eiwitprecipitatie. Centrifugeer de culturen bij 3.200 G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Filtreer het bovenstaande in een nieuwe buis van 15 milliliter met behulp van een PVDF-filter van 0,22 micron dat aan een spuit is bevestigd.

Voeg vervolgens trichloorazijnzuur toe dat overeenkomt met 10% van het bovenstaande volume. Draai de buizen krachtig gedurende een minuut. Incubeer de buisjes een nacht op ijs in een koude ruimte bij vier graden Celsius.

Voeg vervolgens twee milliliter van elk monster toe aan een buis van twee milliliter en centrifugeer vervolgens 15 minuten bij 21.000 G bij vier graden Celsius. Zuig het bovenstaande op met behulp van een vacuümhulpstuk. Herhaal het pipetteren van twee milliliter monster in dezelfde buis, centrifugeer en aspireer het supernatant op.

Consolideer de neerslagreacties in een enkele buis van twee milliliter. Was de pellets met een milliliter ijskoude 100% aceton, gevolgd door centrifugeren en opzuigen van supernatant. Nadat u het bovenstaande voor de laatste keer hebt verwijderd, droogt u de korrel een uur op de bank.

Het neergeslagen eiwit moet eruitzien als een waas langs de zijkant van de buis. Resuspendeer vervolgens elke pellet in 50 microliter F-S-B-DTT-oplossing. Draai grondig gedurende een minuut.

Kook de monsters vervolgens op een warmteblok op 95 graden Celsius gedurende 15 minuten. Centrifugeer vervolgens kort op maximale snelheid bij kamertemperatuur. Laad 15 microliter van elk anaëroob monster en 10 microliter van elk aëroob monster in een 12,5%SDS-PAGE-gel voor analyse.

Nadat de gelrun is voltooid, gebruikt u zilverkleuring om eiwitten op de gel te visualiseren. Plaats om te beginnen een SDS-PAGE-gel met gescheiden aërobe monsters van Yersinia pseudotuberculose in een beeldvormingssysteem. Selecteer in de software de banden die het type drie secretiesysteemeffectoreiwit, YopE, in alle putjes vertegenwoordigen.

Stel de YopE-referentieband in op de juiste sample. Exporteer de door de software berekende relatieve kwantificeringswaarden voor alle YopE-banden. Selecteer vervolgens alle BSA-banden in alle putjes.

Zorg ervoor dat de referentie BSA-band overeenkomt met de steekproef van de referentie YopE-band. Exporteer de relatieve kwantificeringswaarden voor alle BSA-banden. Deel de YopE-waarde door de BSA-waarde voor elke aandoening om genormaliseerde resultaten te produceren.

Met zilver bevlekte SDS-PAGE-gel onthulde dat in de anaërobe monsters 38 keer meer YopE aanwezig was in de monsters met een laag ijzergehalte in vergelijking met de monsters met een hoog ijzergehalte. In de aërobe monsters werden deze eiwitten in bijna vergelijkbare hoeveelheden uitgescheiden.