Name: Onthullen van het ferroptomatische fenotype van medulloblastoom (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-15T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 1 s
Description: Ontdek hoe ferroptose-inductie een veelbelovende therapeutische strategie biedt voor medulloblastoom. Deze methode helpt onderzoekers behandelresistente celpopulaties te identificeren en nieuwe therapieën te ontwikkelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de regering van het Prinsdom Monaco, maar ook door 'Le Groupement des Entreprises Monégasques dans la Lutte contre le cancer' (GEMLUC) en de Flavien Foundation, die de middelen ter beschikking stelde voor de aankoop van BD FACS Melody.

De huidige studie werd uitgevoerd met behulp van DAOY wildtype (WT) medulloblastoomcellijnen, die werden gekweekt bij 37 °C met 5% CO2 in DMEM-medium aangevuld met 8% FBS. De xCT-gedeleteerde cellijn werd onder dezelfde omstandigheden gehandhaafd, met experimenten uitgevoerd in media aangevuld met 1 mM N-acetylcysteïne (NAC). De cellen werden regelmatig gescreend op mycoplasma met behulp van een in de handel verkrijgbare Mycoplasma-detectiekit (zie Materiaaltabel) en werden gekweekt tot de 10epassage.
1. Oogsten en zaaien van de cellen
OPMERKING: Alle stappen worden uitgevoerd met behulp van steriele aseptische technieken in een laminaire vloeikap voor weefselkweek. DAOY-medulloblastoomcellen zijn hechtend, wat betekent dat alle niet-gehechte cellen kunnen worden weggegooid door te wassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) zonder Ca2+ en Mg2+.
<ol><li>Neem het bouillonschaaltje (petrischaaltje, 100 mm diameter) met de cellen en verwijder de drijvende cellen en het medium van de plaat met behulp van een aspirator.</li>
	<li>Voeg 5-10 ml PBS toe aan de schaal, was de bodem met ronddraaiende bewegingen van de schaal en verwijder vervolgens de PBS van het bord met een aspirator.</li>
	<li>Voeg 1 ml trypsine (10x verdunning) toe aan het gerecht. Incubeer de plaat totdat zachtjes tikken op de plaat de cellen losmaakt. Neem 10 ml DMEM-kweekmedium aangevuld met 8% FBS en oogst de cellen mechanisch van de schaal.</li>
	<li>Breng de celsuspensie over in een buisje van 15 ml.</li>
	<li>Neem 500 μL van de celsuspensie en doe deze in een cuvet om te tellen. Tel het aantal cellen per ml celsuspensie. Voor dit onderzoek werd een geautomatiseerde cellenteller gebruikt (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Bereken het volume dat nodig is om uit de celsuspensie te halen om 1,00,000 cellen te hebben.</li>
	<li>Neem een plaat met 6 putjes en voeg het berekende volume van de celsuspensie toe aan elk putje, voeg vervolgens DMEM-kweekmedia aangevuld met 8% FBS toe tot 2 ml in elk putje.</li>
</ol>2. Behandeling van de cellen
OPMERKING: De controle en behandelingen worden in drievoud uitgevoerd. De groepen zijn als volgt: Controle (DMSO), 1 μM erastine, 0,3 μM RSL3, 250 μM FAC, 2 μM ferrostatine 1, 1 μM erastine + 2 μM ferrostatine 1, 0,3 μM RSL3 + 2 μM ferrostatine 1, 250 μM FAC + 2 μM ferrostatine 1. Er zijn vier platen met 6 putjes nodig voor het experiment, zoals aangegeven in tabel 1). De commerciële details van alle benodigde reagentia staan vermeld in de materiaaltabel.
<ol><li>Voeg 24 uur na het zaaien de bijbehorende behandeling toe aan het putje met de cellen.</li>
	<li>Laat de vaat op 37 °C en 5% CO2 in de broedmachine staan.</li>
</ol>3. Lipide hydroperoxiden kleuring van de behandelde cellen met BODIPY 581/591 C11 sonde
OPMERKING: De standaardoplossing van de lipidehydroperoxide-specifieke sonde wordt bereid in DMSO met een concentratie van 1 mM. Aliquots van de stockoplossing worden bewaard bij -20 °C in niet-transparante buizen. Bereid voor het kleuren een 2 μM werkoplossing van de sonde in DMEM-media aangevuld met 8% FBS.
<ol><li>Bekijk de cellen 6 uur na de behandeling onder een lichtmicroscoop (de afronding van de cellen moet zichtbaar zijn).</li>
	<li>Haal de schaaltjes uit de couveuse en plaats ze in een weefselkweek laminaire stromingskap. Verwijder met behulp van een aspirator de media en zwevende (dode) cellen.</li>
	<li>Voeg voorzichtig 2 ml PBS toe aan elk putje, was de bodem met cirkelvormige bewegingen van de 6-wells platen en verwijder vervolgens het PBS uit de putjes met een aspirator.</li>
	<li>Voeg 2 ml van de werkoplossing van de sonde toe (eindconcentratie van 2 μM in DMEM aangevuld met FBS).</li>
	<li>Laat de schaal in de broedmachine 30 minuten in het donker op 37 °C en 5% CO2 staan (de borden kunnen in aluminiumfolie worden verpakt).</li>
</ol>4. Flowcytometrie-analyse van het lipidehydroperoxidegehalte in de behandelde cellen
OPMERKING: Alle volgende stappen worden uitgevoerd in het donker (geen lampjes in de laminaire stromingskap).
<ol><li>Haal de schaaltjes uit de couveuse en plaats ze in een weefselkweek laminaire stromingskap. Verwijder de kleuroplossing met behulp van een aspirator.</li>
	<li>Voeg voorzichtig 2 ml PBS toe aan elk putje, was de bodem met cirkelvormige bewegingen van de 6-wells platen en verwijder vervolgens het PBS uit de putjes met een aspirator.</li>
	<li>Herhaal de wasstap nog een keer en zuig eventueel resterende PBS uit de put op met behulp van een aspirator.</li>
	<li>Voeg 150 μl van een in de handel verkrijgbaar celdissociatiereagens (zie Materiaaltabel) toe aan de bodem van elk putje en incubeer de plaat totdat zachtjes tikken op de plaat de cellen losmaakt. Neem 250 μL FACS-buffer (PBS, 2 mM EDTA, 0,5% BSA) en oogst de cellen mechanisch uit de putjes.</li>
	<li>Breng de cellen over in de overeenkomstige (eerder gemarkeerde) FACS-buis met de filterdop. Plaats het buisje met de cellen in het donker op ijs totdat de analyse is uitgevoerd (de analyse moet binnen een uur na de kleuring worden uitgevoerd). OPMERKING: De instelling en kalibratie van de FACS-machine zijn afhankelijk van de gebruikte machine (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Maak een nieuw experiment en geef het een naam (Ferroptose in DAOY - lipidehydroperoxiden).</li>
	<li>Kies in het experimentontwerp de laser (488 nm) en het filter (FITC).</li>
	<li>Selecteer in de weergavegegevens de juiste celgrootte (>12 μm), stel de PMT-spanningen in (de celpopulatie moet in het eerste kwadrant van de SSC-H/FSC-H-puntdiagram verschijnen) en poort de puntplot.</li>
	<li>Voeg een nieuwe plot toe - histogram, met FITC-A op de y-as en logaritmische schaal.</li>
	<li>Draai de monsters in de FACS-buis, plaats ze in de FACS-machine en laad het monster. Noteer 10.000 FSC-singletgebeurtenissen en geef het bestand een naam (bijv. DAOY WT CTL 6h). Exporteer het bestand als .fcs.</li>
</ol>5. Propidiumjodide (PI) kleuring van de dode cellen bij behandeling
OPMERKING: De opzet van het experiment is precies hetzelfde als voor de meting van lipidehydroperoxide (zie stap 1 en stap 2).
<ol><li>24 uur na het zaaien haalt u de schaaltjes uit de broedmachine en plaatst u ze in de laminaire stromingskap.</li>
	<li>Verzamel de media (met dode cellen) in een buisje van 15 ml.</li>
	<li>Voeg 1 ml PBS toe aan elk putje, was de bodem met cirkelvormige bewegingen van de 6-wells platen en verzamel vervolgens het PBS in de buis met de respectievelijke media.</li>
	<li>Voeg 200 μL trypsine (10x verdunning) toe op de bodem van elk putje en incubeer de plaat totdat zachtjes tikken op de plaat de cellen losmaakt. Gebruik de respectievelijke media + PBS om de cellen van de putten te oogsten.</li>
	<li>Centrifugeer de celsuspensie bij 180 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatans met behulp van een aspirator.</li>
	<li>Resuspendeer de celpellet in 300 μL FACS-buffer en plaats deze op ijs tot analyse.</li>
	<li>Voeg vlak voor de analyse PI-oplossing toe (zie Materiaaltabel) tot een eindconcentratie van 2 μg/ml.</li>
</ol>6. Flowcytometrie analyse van dode cellen 24 uur na de behandeling
OPMERKING: FACS-machine-instellingen en kalibratie worden uitgevoerd zoals eerder aangegeven (zie stap 4).
<ol><li>Maak een nieuw experiment en geef het een naam (Ferroptose in DAOY - celdood).</li>
	<li>Kies in het experimentontwerp de laser (488 nm) en het filter (PE).</li>
	<li>Selecteer in de weergavegegevens de juiste celgrootte (>12 μm), stel de PMT-spanningen in (de celpopulatie moet in het eerste kwadrant van de SSC-H/FSC-H-puntdiagram verschijnen) en poort de puntplot.</li>
	<li>Voeg een nieuwe grafiek toe - histogram, met PE-A op de y-as en logaritmische schaal.</li>
	<li>Draai de monsters in de FACS-buis, plaats ze in de FACS-machine en laad het monster.</li>
	<li>Noteer 10.000 FSC-singletgebeurtenissen en geef het bestand een naam (bijv. DAOY WT CTL 6h). Exporteer het bestand als .fcs.</li>
</ol>7. Flowcytometrie analyse van het lipidehydroperoxide gehalte in de DAOY xCT-/- cellen
OPMERKING: xCT-/- cellen zijn gegenereerd zoals eerder beschreven24.
<ol><li>Voor dit experiment zaait u de cellen zoals aangegeven in stap 2, maar in plaats van de behandeling vult u de media 's nachts aan met 1 mM NAC.</li>
	<li>De volgende dag handhaaft u NAC in de ene groep en verwijdert u deze uit de andere.</li>
	<li>Voer de flowcytometrieanalyse van het lipidehydroperoxidegehalte uit op exact dezelfde manier als beschreven in stap 6.</li>
</ol>8. Analyse van de resultaten van de flowcytometer
<ol><li>Open het .fcs-document in de FlowJo-software (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Dubbelklik op het individuele bestand om alle gebeurtenissen (niet alleen FCS-singlets) te openen die in de individuele steekproef zijn opgenomen (SSC-A/FSC-A dot plot). Aangezien de instellingen zodanig zijn dat de gating die op de machine is uitgevoerd niet behouden blijft, is het noodzakelijk om de poort opnieuw te maken en de populatie te benoemen (bijv. DAOY WT).</li>
	<li>Dubbelklik op de gated populatie om een ander venster met het histogram te openen.</li>
	<li>Verander de Y-as naar het gebruikte fluorescentiefilter (Comp-FITC/PE-A).</li>
	<li>Verander de X-as in modaal (normaliseer elke piek naar zijn modus, d.w.z. naar % van het maximale aantal cellen dat in een bepaalde bak wordt gevonden).</li>
	<li>Kopieer het histogram naar de lay-outeditor. Herhaal dit voor alle voorbeelden en elke keer dat een nieuw histogram in de lay-outeditor wordt geplakt, sleept u het over het vorige histogram zodat de histogrammen over elkaar heen worden gelegd (half-offset).</li>
</ol>

FACS-analyse van lipidehydroperoxiden in ferrototische medulloblastoomcellen

<ol><li>Dixon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferroptosis%3A+An+iron-dependent+form+of+nonapoptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ferroptosis: An iron-dependent form of nonapoptotic cell death.</a> Cell. 149, 1060-1072 (2012).</li>
<li>Yang, W. S., Stockwell, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+lethal+screening+identifies+compounds+activating+iron-dependent%2C+nonapoptotic+cell+death+in+oncogenic-ras-harboring+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic lethal screening identifies compounds activating iron-dependent, nonapoptotic cell death in oncogenic-ras-harboring cancer cells.</a> Chem Biol. 15 (30), 234-245 (2008).</li>
<li>Yang, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ferroptotic+cancer+cell+death+by+GPX4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4.</a> Cell. 156, 317-331 (2014).</li>
<li>Meister, A., Anderson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Glutathione.</a> Annu Rev Biochem. 52, 711-760 (1983).</li>
<li>Lewerenzm, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cystine%2Fglutamate+antiporter+system+xc-+in+health+and+disease%3A+From+molecular+mechanisms+to+novel+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">The cystine/glutamate antiporter system xc- in health and disease: From molecular mechanisms to novel therapeutic opportunities.</a> Antioxid Redox Signal. 18 (5), 522-555 (2013).</li>
<li>Yang, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ferroptotic+cancer+cell+death+by+GPX4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4.</a> Cell. 156, 317-331 (2014).</li>
<li>Bersuker, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CoQ+oxidoreductase+FSP1+acts+parallel+to+GPX4+to+inhibit+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CoQ oxidoreductase FSP1 acts parallel to GPX4 to inhibit ferroptosis.</a> Nature. 575, 688-692 (2019).</li>
<li>Doll, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FSP1+is+a+glutathione-independent+ferroptosis+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">FSP1 is a glutathione-independent ferroptosis suppressor.</a> Nature. 575, 693-698 (2019).</li>
<li>Hu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+GCH1%2FBH4+axis+activates+ferritinophagy+to+mitigate+the+resistance+of+colorectal+cancer+to+erastin-induced+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Blockade of GCH1/BH4 axis activates ferritinophagy to mitigate the resistance of colorectal cancer to erastin-induced ferroptosis.</a> Front Cell Dev Biol. 10, (2022).</li>
<li>Lei, G., Zhuang, L., Gan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+ferroptosis+as+a+vulnerability+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting ferroptosis as a vulnerability in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 22, 381-396 (2022).</li>
<li>Viswanathan, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependency+of+a+therapy-resistant+state+of+cancer+cells+on+a+lipid+peroxidase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dependency of a therapy-resistant state of cancer cells on a lipid peroxidase pathway.</a> Nature. 547, 453-457 (2017).</li>
<li>Lee, J., You, J. H., Kim, M. S., Roh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+reprogramming+of+epithelial-mesenchymal+transition+promotes+ferroptosis+of+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Epigenetic reprogramming of epithelial-mesenchymal transition promotes ferroptosis of head and neck cancer.</a> Redox Biol. 37, 101697(2020).</li>
<li>Hangauer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-tolerant+persister+cancer+cells+are+vulnerable+to+GPX4+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drug-tolerant persister cancer cells are vulnerable to GPX4 inhibition.</a> Nature. 551, 247-250 (2017).</li>
<li>Zhang Tuo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombin+induces+ACSL4-dependent+ferroptosis+during+cerebral+ischemia%2Freperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Thrombin induces ACSL4-dependent ferroptosis during cerebral ischemia/reperfusion.</a> Signal Transduct Target Ther. 7, 59(2022).</li>
<li>Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+ferroptosis+and+emerging+links+to+the+pathology+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of ferroptosis and emerging links to the pathology of neurodegenerative diseases.</a> Front Aging Neurosci. 14, (2022).</li>
<li>Zhuo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+ferroptosis+in+glioblastoma%3A+Therapeutic+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Emerging role of ferroptosis in glioblastoma: Therapeutic opportunities and challenges.</a> Front Mol Biosci. 9, (2022).</li>
<li>Bisaro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+extracellular+vesicles+from+medullospheres+reveals+a+role+for+iron+in+the+cancer+progression+of+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Ther%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of extracellular vesicles from medullospheres reveals a role for iron in the cancer progression of medulloblastoma.</a> Mol Cell Ther. 3, 8(2015).</li>
<li>Schonberg, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+iron+trafficking+characterizes+glioblastoma+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Preferential iron trafficking characterizes glioblastoma stem-like cells.</a> Cancer Cell. 28 (4), 441-455 (2015).</li>
<li>Werbowetski-Ogilvie, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+sorting+to+sequencing+in+the+molecular+era%3A+the+evolution+of+the+cancer+stem+cell+model+in+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">From sorting to sequencing in the molecular era: the evolution of the cancer stem cell model in medulloblastoma.</a> FEBS J. 289 (7), 1765-1778 (2022).</li>
<li>Dixon, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+inhibition+of+cystine-glutamate+exchange+induces+endoplasmic+reticulum+stress+and+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Pharmacological inhibition of cystine-glutamate exchange induces endoplasmic reticulum stress and ferroptosis.</a> Elife. 3, e02523(2014).</li>
<li>Bauckman, K. A., Haller, E., Flores, I., Nanjundan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+modulates+cell+survival+in+a+Ras-+and+MAPK-dependent+manner+in+ovarian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Iron modulates cell survival in a Ras- and MAPK-dependent manner in ovarian cells.</a> Cell Death Dis. 4, e592(2013).</li>
<li>Drummen, G. P. C., Van Liebergen, L. C., Op den Kamp, J. A. F., Post, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C11-BODIPY581%2F591%2C+an+oxidation-sensitive+fluorescent+lipid+peroxidation+probe%3A+%28Micro%29spectroscopic+characterization+and+validation+of+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">C11-BODIPY581/591, an oxidation-sensitive fluorescent lipid peroxidation probe: (Micro)spectroscopic characterization and validation of methodology.</a> Free Radic Biol Med. 33 (4), 473-490 (2002).</li>
<li>Miotto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+mechanism+of+ferroptosis+inhibition+by+ferrostatin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Insight into the mechanism of ferroptosis inhibition by ferrostatin-1.</a> Redox Biol. 28, 101328(2020).</li>
<li>Daher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+ablation+of+the+cystine+transporter+xCT+in+PDAC+cells+inhibits+mTORC1%2C+growth%2C+survival%2C+and+tumor+formation+via+nutrient+and+oxidative+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic ablation of the cystine transporter xCT in PDAC cells inhibits mTORC1, growth, survival, and tumor formation via nutrient and oxidative stresses.</a> Cancer Res. 79 (15), 3877-3890 (2019).</li>
<li>Shimada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+survey+of+cell+death+mechanisms+reveals+metabolic+regulation+of+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Global survey of cell death mechanisms reveals metabolic regulation of ferroptosis.</a> Nat Chem Biol. 12, 497-503 (2016).</li>
<li>Yang, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxidation+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+lipoxygenases+drives+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Peroxidation of polyunsaturated fatty acids by lipoxygenases drives ferroptosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), E4966-E4975 (2016).</li>
<li>Gaschler, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FINO2+initiates+ferroptosis+through+GPX4+inactivation+and+iron+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">FINO2 initiates ferroptosis through GPX4 inactivation and iron oxidation.</a> Nat Chem Biol. 14, 507-515 (2018).</li>
<li>Bogacz, M., Krauth-Siegel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tryparedoxin+peroxidase-deficiency+commits+trypanosomes+to+ferroptosis-type+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Tryparedoxin peroxidase-deficiency commits trypanosomes to ferroptosis-type cell death.</a> Elife. 7, e37503(2018).</li>
<li>Cheloni, G., Slaveykova, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+C11-BODIPY581%2F591+dye+for+the+determination+of+lipid+oxidation+in+Chlamydomonas+reinhardtii+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytom+Part+A%22%5BJournal%5D)">Optimization of the C11-BODIPY581/591 dye for the determination of lipid oxidation in Chlamydomonas reinhardtii by flow cytometry.</a> Cytom Part A. 83 (10), 952-961 (2013).</li>
<li>Itoh, N., Cao, J., Chen, Z. H., Yoshida, Y., Niki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+limitation+of+BODIPY+as+a+probe+for+the+evaluation+of+lipid+peroxidation+and+its+inhibition+by+antioxidants+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Advantages and limitation of BODIPY as a probe for the evaluation of lipid peroxidation and its inhibition by antioxidants in plasma.</a> Bioorganic Med Chem Lett. 17 (7), 2059-2063 (2007).</li>
<li>Sato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ferroptosis+inducer+erastin+irreversibly+inhibits+system+xc%E2%88%92+and+synergizes+with+cisplatin+to+increase+cisplatin%27s+cytotoxicity+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The ferroptosis inducer erastin irreversibly inhibits system xc− and synergizes with cisplatin to increase cisplatin's cytotoxicity in cancer cells.</a> Sci Rep. 8, 968(2018).</li>
<li>Cheff, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ferroptosis+inducing+compounds+RSL3+and+ML162+are+not+direct+inhibitors+of+GPX4+but+of+TXNRD1%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">The ferroptosis inducing compounds RSL3 and ML162 are not direct inhibitors of GPX4 but of TXNRD1.</a> Redox Biol. 62, 102703(2023).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+degradation+mechanism+of+GPX4+degrader+in+induction+of+ferroptosis+exerting+anti-resistant+tumor+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Dual degradation mechanism of GPX4 degrader in induction of ferroptosis exerting anti-resistant tumor effect.</a> Eur J Med Chem. 247, 115072(2023).</li>
<li>Vucetic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Together+we+stand%2C+apart+we+fall%3A+how+cell-to-cell+contact%2Finterplay+provides+resistance+to+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Together we stand, apart we fall: how cell-to-cell contact/interplay provides resistance to ferroptosis.</a> Cell Death Dis. 11, 789(2020).</li>
<li>Meira, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cystine-cysteine+intercellular+shuttle+prevents+ferroptosis+in+xctko+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A cystine-cysteine intercellular shuttle prevents ferroptosis in xctko pancreatic ductal adenocarcinoma cells.</a> Cancers (Basel). 13 (6), 1434(2021).</li>
</ol>

Wij verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling voor de hierbij gepresenteerde studie.

Het primaire kenmerk van ferroptotische celdood is de ongecontroleerde ophoping van lipidehydroperoxiden in het plasmamembraan. Deze oxidatieve schade kan op een enzymatische of niet-enzymatische manier optreden, maar in beide gevallen is de reactie ijzerafhankelijk/gekatalyseerd, wat de naam van dit type celdood verklaart. Lipidehydroperoxidatie wordt vaak indirect geschat door de afbraakproducten van lipidehydroperoxidatie te meten, zoals 4-hydroxy-2,3-trans-nonenal (4-HNE) of malonaldehyde (MDA). Deze producten, gegenereerd door de peroxidatieve afbraak van meervoudig onverzadigde vetzuren, kunnen reageren met verschillende macromoleculen, wat leidt tot een breed scala aan pathologieën, zoals neurodegeneratieve aandoeningen, diabetes en chronisch hartfalen. Dit zijn echter de gevolgen van de peroxidatie-gebeurtenis en er is veel moeite gedaan om goede lipidehydroperoxide-specifieke sondes te ontwikkelen.
Een veelgebruikte sonde is BODIPY 581/591 C11, die ook zijn nadelen heeft waarmee rekening moet worden gehouden. In het bijzonder vertoont BODIPY 591/581 fluorescentiekleur twee emissiepieken, één in verminderde toestand (590 nm) en één in geoxideerde toestand (510 nm). De verhouding tussen fluorescentie op deze twee golflengten is van bijzonder belang als nauwkeurige kwantificering het doel is. De intensiteit van enkelvoudige emissiefluorescentie van BODIPY 591/581 nm is echter op grote schaal gebruikt in de literatuur 1,25,26,27,28, vooral omdat de verminderde intensiteit van de rode emissie bij 510 nm vaak wordt gemaskeerd door de overloop van de fluorescentie van het geoxideerde molecuul 22,29. Dit is een van de belangrijkste redenen waarom de fluorescentie van BODIPY 591/581 meestal op een kwalitatieve manier wordt weergegeven als een functie van de enkelvoudige (groene) fluorescentie-intensiteit.
Een andere belangrijke beperking van deze sonde is de onderdrukking van de fluorescentie-emissie door antioxidanten op een concentratie-afhankelijke manier30. Daarom moet kleuring worden uitgevoerd in media zonder suppletie met antioxidanten. In het huidige protocol werd ferrostatine 1 gebruikt, een krachtige aaseter van lipidehydroperoxiden; niettemin, voordat de sonde werd toegevoegd, werd ferrostatine 1 verwijderd en werden de cellen gewassen met PBS, zodat de sonde niet werd blootgesteld aan zijn antioxiderende activiteit.
Met betrekking tot ferroptose-inductie kunnen veel in de handel verkrijgbare geneesmiddelen worden gebruikt. Hier werd erastine, een onomkeerbare remmer van de xCT-transporter31, gebruikt. Aangezien het covalent bindt aan de transporter, kunnen nog hogere concentraties worden gebruikt (tot 100 μM) voor een kortere periode (5 min), gevolgd door een wasstap31. Om de exacte kinetiek van ferroptose te evalueren na volledige remming van xCT, werden xCT-/- cellen gebruikt in afwezigheid van NAC. Een enorme ophoping van lipidehydroperoxiden was detecteerbaar na 6 uur en vrijwel geen levensvatbare cellen waren detecteerbaar 24 uur na het zaaien. Wat betreft RSL3, een zeer krachtige inductor van ferroptose in het nanomolaire bereik, het vertoonde een kinetiek die vergelijkbaar is met die waargenomen bij xCT-/-cellen. Het werkingsmechanisme is nog steeds nogal controversieel, maar het lijkt erop dat het de activiteit niet beïnvloedt, maar in plaats daarvan de afbraak van het GPx4-enzym induceert32,33.
Een belangrijk aspect van ferroptose-inductie in vitro is celconfluentie. Het is al lang bekend dat een confluente cellaag veel resistenter is tegen cysteïne-uithongering, xCT- of GPx4-remming, GSH-uitputting, enz.34. De belangrijkste reden die wordt gegeven is dat fysiek contact, d.w.z. samenvloeiing, leidt tot de activering van de Hippo-route, die op zijn beurt het metabolisme en de interne productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) neerwaarts reguleert. Bovendien zou de shuttle van gereduceerd cysteïne ook kunnen bijdragen aan resistentie tegen onvolledige xCT-remming35. In de huidige studie werd een concentratie van 1.00.000 cellen per put (plaat met 6 putjes) gebruikt om een lage samenvloeiing te behouden met cellen die vrij groot en plat zijn. Met kleinere en ronde cellen, zoals HD-MB03, kan dit aantal echter worden verhoogd tot 1,50,000-2,00,000 cellen per put (plaat met 6 putjes).
De laatste beperking van de huidige studie is de detectie van celdood door middel van de propidiumjodide (PI) methode. Deze methode is gebruiksvriendelijk voor het detecteren van elk type celdood, en ferroptose kan worden onderscheiden van andere soorten celdood door ferroptose-specifieke remmers te gebruiken, zoals ferrostatine-1. PI-kleuring is gebaseerd op het feit dat stervende cellen de membraanintegriteit verliezen, waardoor PI de cellen kan binnendringen, tussen de DNA-basen kan intercaleren en een fluorescerend signaal kan uitzenden. Het is echter vermeldenswaard dat lipidehydroperoxidatie membraanlekkage induceert, waardoor penetratie van PI mogelijk is, zelfs voordat celdood optreedt. Het is dus een uitdaging om de kinetiek van ferroptose alleen op basis van deze methode te schatten.

Ferroptose is een nieuw gecontextualiseerde, reactieve zuurstofspecies (ROS)-afhankelijke vorm van celdood1. Naast ROS speelt ijzer een cruciale rol(len) bij deze vorm van celdood, vandaar de naam2. De laatste en uitvoerende stap van ferroptose is de door ijzer gekatalyseerde accumulatie van oxidatieve schade van lipiden in het plasmamembraan die uiteindelijk leidt tot aangetaste membraanintegriteit en selectieve permeabiliteit, en ten slotte tot celdood door borrelen. Lipide hydroperoxidatie is een natuurlijk voorkomend fenomeen; De voortplanting ervan door het celmembraan wordt echter voorkomen door de antioxidantverdediging van de cel. De belangrijkste speler in deze context is Se-eiwit glutathionperoxidase 4 (GPx4), dat het membraan kan benaderen en lipidehydroperoxiden kan omzetten in hun minder giftige alcoholderivaten3. Het reducerend vermogen voor GPx4 wordt voornamelijk, maar niet uitsluitend, geleverd door glutathion (GSH), een tripeptide dat is samengesteld uit de niet-essentiële aminozuren: glycine, glutamaat en cysteïne. Het snelheidsbeperkende aminozuur voor de biosynthese van GSH is cysteïne4. Hoewel cysteïne is geclassificeerd als een niet-essentieel aminozuur, kunnen de behoeften ervan gemakkelijk groter zijn dan de interne productie in zeer proliferatieve cellen (zoals kankercellen). Het is dus opnieuw geclassificeerd in de groep van semi-essentiële aminozuren. De noodzakelijke import van cysteïne gebeurt voornamelijk via het Xc-systeem, dat de import van de geoxideerde (dominante) vorm van cysteïne (ook wel cystine genoemd) mogelijk maakt ten koste van de glutamaatexport5. Het Xc-systeem bestaat uit een Na+-onafhankelijke, Cl-afhankelijke transportsubeenheid, bekend als xCT, en een chaperon-subeenheid, bekend als CD98. Tot voor kort werden de anti-ferroptotische eigenschappen van de xCT-GSH-GPx4-as als uniek en onnavolgbaar beschouwd6. In 2019 is echter een alternatieve anti-ferroptotische route, bestaande uit ubiquinol (co-enzym Q10) en zijn regeneratieve enzym - ferroptose-suppressoreiwit 1 (FSP1), beschreven 7,8. Kort daarna is nog een ander lipidehydroperoxide-ontgiftingssysteem met GTP-cyclohydrolase-1/tetrahydrobiopterine (GCH1/BH4) gemeld9. Desalniettemin lijkt de centrale rol van de xCT-GSH-GPx4-as bij de preventie van ferroptose niet te worden betwist.
In het afgelopen decennium is ferroptose uitgebreid bestudeerd in een verscheidenheid aan tumortypes, wat een groot potentieel heeft aangetoond als een antikankerstrategie (beoordeeld door Lei et al.10). Bovendien is gemeld dat kankercellen die een hoge resistentie vertonen tegen conventionele chemotherapeutica en/of een neiging hebben om uit te zaaien, verrassend gevoelig zijn voor ferroptose-inductoren, zoals remmers van GPx4 11,12,13. In de context van hersentumoren blijft het potentieel van ferroptotische inductoren echter grotendeels onderbelicht. Hoewel dit type celdood nauw in verband is gebracht met cerebrale ischemie-reperfusieletsel14en neurodegeneratieve ziekten15, is het potentieel ervan in de context van hersentumoren voornamelijk beperkt tot glioblastoom, de meest voorkomende kwaadaardige craniocerebrale tumor (beoordeeld door Zhuo et al.16). Aan de andere kant blijft de gevoeligheid van medulloblastoom, de meest voorkomende kwaadaardige hersentumor bij kinderen en een belangrijke oorzaak van kindersterfte, voor ferroptose-inductoren grotendeels onontgonnen. Voor zover wij weten, is er schaarse peer-reviewed literatuur die ferroptose en medulloblastoom met elkaar in verband brengt. Desalniettemin hebben sommige onderzoeken aangetoond dat ijzer een cruciale rol speelt bij de overleving, proliferatie en tumorigene potentie van zowel medulloblastoom als glioblastoom kankerstamcellen (CSC's)17,18, waardoor ze mogelijk kwetsbaarder worden voor ferroptose-inductie. Dit is vooral belangrijk omdat medulloblastoom berucht is om zijn subpopulatie van CSC's, of tumor-initiërende/zich voortplantende cellen, die grotendeels verantwoordelijk lijken te zijn voor tumorchemoresistentie, verspreiding en terugval19.
Gevoeligheid voor ferroptose-inductie wordt meestal onderzocht door het gehalte/de accumulatie van lipidehydroperoxide te meten, wat al dan niet tot celdood kan leiden. De meest gebruikte feroptose-inductoren zijn (1) erastine, een remmer van de xCT-transporter20, (2) RSL3, een remmer van het GPx4-enzym2, en/of (3) ijzerdonoren, zoals ferro-ammoniumcitraat (FAC)21. Het lipidehydroperoxidegehalte wordt beoordeeld met behulp van de selectieve sonde BODIPY 581/591 C1122, die in gereduceerde toestand excitatie- en emissiemaxima heeft bij 581/591 nm. Bij interactie met en oxidatie door lipidehydroperoxiden verschuift de sonde zijn excitatie- en emissiemaxima naar 488/510 nm. Doorgaans gaat een significante toename van het lipidehydroperoxidegehalte vooraf aan ferroptotische celdood. Aangezien ferroptose geen geprogrammeerde celdood is, is er geen moleculaire signaalcascade die leidt tot de uitvoering ervan. Daarom is de enige manier om dit te bevestigen, het lipidehydroperoxidegehalte te controleren en specifieke remmers te gebruiken voor dit type celdood, zoals ferrostatine 123. Ferrostatine 1 is een lipofiele antioxidant die het lipidencompartiment van de cel kan binnendringen en lipidehydroperoxiden kan ontgiften, waardoor ferroptotische gebeurtenissen worden voorkomen.

<table><tbody><tr><td>BODIPY 581/591 C11</td><td>Thermo Fisher</td><td>D3861</td><td></td></tr><tr><td>Cell counter</td><td>Beckman</td><td>Coulter Z1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10569010</td><td></td></tr><tr><td>Erastin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7781-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Ferroamminium citrate</td><td>Acros Organics</td><td>211842500</td><td></td></tr><tr><td>Ferrostatin-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0583-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovin serum (FBS)</td><td>Dominique Dutcher</td><td>500105N1N</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Melody</td><td></td></tr><tr><td>Gibco StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td><td>Thermo Fisher</td><td>11599686</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylcysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7250</td><td></td></tr><tr><td>PlasmoTest Mycoplasma Detection Kit</td><td>InvivoGen</td><td>rep-pt1</td><td></td></tr><tr><td>propidium iodide</td><td>Invitrogen</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>RSL3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML2234-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin - EDTA 10X - 100 mL</td><td>Dominique Dutcher</td><td>X0930-100</td><td></td></tr></tbody></table>

onthullen van het ferroptomatische fenotype van medulloblastoom

Revealing the Ferroptotic Phenotype of Medulloblastoma

De interactie van ijzer en zuurstof is een integraal onderdeel van de ontwikkeling van het leven op aarde. Desalniettemin blijft deze unieke chemie fascineren en puzzelen, wat leidt tot nieuwe biologische ondernemingen. In 2012 erkende een groep van de Columbia University deze interactie als een centrale gebeurtenis die leidde tot een nieuw type gereguleerde celdood genaamd 'ferroptose'. Het belangrijkste kenmerk van ferroptose is de ophoping van lipidehydroperoxiden als gevolg van (1) disfunctionele antioxidantafweer en/of (2) overweldigende oxidatieve stress, die meestal samenvalt met een verhoogd gehalte aan vrij labiel ijzer in de cel. Dit wordt normaal gesproken voorkomen door de canonieke anti-ferroptotische as bestaande uit de cystinetransporter xCT, glutathion (GSH) en GSH-peroxidase 4 (GPx4). Aangezien ferroptose geen geprogrammeerd type celdood is, zijn er geen signaalroutes betrokken die kenmerkend zijn voor apoptose. De meest gebruikelijke manier om dit type celdood te bewijzen, is door lipofiele antioxidanten (vitamine E, ferrostatine-1, enz.) te gebruiken om dit te voorkomen. Deze moleculen kunnen oxidatieve schade in het plasmamembraan benaderen en ontgiften. Een ander belangrijk aspect bij het onthullen van het ferroptotische fenotype is het detecteren van de voorafgaande accumulatie van lipidehydroperoxiden, waarvoor de specifieke kleurstof BODIPY C11 wordt gebruikt. Het huidige manuscript zal laten zien hoe ferroptose kan worden geïnduceerd in wild-type medulloblastoomcellen door verschillende inductoren te gebruiken: erastine, RSL3 en ijzerdonor. Evenzo zullen de xCT-KO-cellen worden gebruikt die groeien in aanwezigheid van NAC en die ferroptose ondergaan nadat NAC is verwijderd. Het kenmerkende "borrelende" fenotype is zichtbaar onder de lichtmicroscoop binnen 12-16 uur vanaf het moment van ferroptose triggering. Verder zal BODIPY C11-kleuring gevolgd door FACS-analyse worden gebruikt om de accumulatie van lipidehydroperoxiden en de daaruit voortvloeiende celdood aan te tonen met behulp van de PI-kleuringsmethode. Om de ferroptotische aard van celdood aan te tonen, zal ferrostatine-1 worden gebruikt als een specifiek middel om ferroptose te voorkomen.

De medulloblastoomcellijn DAOY werd gekweekt in een standaard DMEM-medium aangevuld met 8% FBS totdat het ongeveer 60% confluentie bereikte. Op de dag van het experiment werden cellen geoogst en werden 1,00,000 cellen per put geplateerd in platen met 6 putjes, volgens tabel 1. De volgende dag werden cellen (in drievoud) behandeld met 1 μM erastine, 0,3 μM RSL3 of 250 μM FAC. De platen werden vervolgens in de incubator geplaatst bij 37 °C en 5% CO2 . Na 6 uur werden cellen onder de microscoop geobserveerd om borrelende cellen te detecteren, zoals aangegeven door de pijlen in figuur 1. Dit diende als een indicator dat het medicijn effectief was in het induceren van ferroptose voordat de cellen werden voorbereid op lipidehydroperoxidekleuring en de daaropvolgende FACS-analyse.
Voor de detectie van het gehalte aan lipidehydroperoxide werd de specifieke kleurstof BODIPY 581/591 C11 gebruikt in een eindconcentratie van 2 μM gedurende 30 minuten. Omdat deze kleurstof redoxgevoelig is, was het nodig om elke behandeling van de cellen te verwijderen en ze te wassen met voorverwarmd PBS. Na een half uur kleuring werden de cellen twee keer gewassen met PBS, losgemaakt met behulp van de oplossing voor celloslating en voorbereid op FACS-analyse. Gegevens die in deze stap werden verkregen, toonden een verhoogde groene fluorescentie van de kleurstof in de monsters die met alle drie de geneesmiddelen werden behandeld (Figuur 2). Het krachtigste effect werd echter waargenomen bij 0,3 μM RSL3 (Figuur 2B), terwijl 1 μM erastin (Figuur 2A) en 250 μM FAC (Figuur 2C) een iets minder effect vertoonden na 6 uur behandeling.
Om vast te stellen dat de gedetecteerde ophoping van lipidehydroperoxide leidt tot celdood, met name ferroptose, werden gedurende 24 uur dezelfde behandelingen toegepast die in tabel 1 worden beschreven. Voor de analyse van dode cellen door middel van flowcytometrie werden zowel de cellen als het supernatans geoogst. De levende en dode cellen werden gepelleteerd door centrifugatie en vervolgens geresuspendeerd in FACS-buffer voor daaropvolgende flowcytometrie-analyse. De gegevens in figuur 3 toonden aan dat alle drie de behandelingen massale celdood induceerden, wat volledig werd voorkomen door het gebruik van de ferroptose-specifieke remmer ferrostatine-1. Dit ondersteunt duidelijk het optreden van ferroptotische celdood bij xCT-remming, GPx4-remming of ijzerstapeling in medulloblastoomcellen.
Gezien het feit dat de drie geneesmiddelen enigszins verschillende effecten vertoonden op de accumulatie van lipidehydroperoxide, waarschijnlijk als gevolg van verschillen in potentie, werd een genetische benadering gebruikt om de volledige potentie van de ferroptotische inductoren te onderzoeken. Eerder verkregen DAOY xCT-/- cellen (aanvullende figuur 1A) werden gekweekt in dezelfde media als hun WT-tegenhangers, maar met NAC-suppletie. Deze positieve selectie zorgde ervoor dat de xCT-/- cellen in cultuur konden groeien. Echter, 6 uur nadat NAC uit de kweekmedia was verwijderd, begonnen cellen lipidehydroperoxiden op te hopen tot hetzelfde niveau als WT-cellen die met RSL3 werden behandeld (Figuur 4). Net als bij farmacologische remming induceerde de verwijdering van NAC uit de media het karakteristieke opborrelen van xCT-/- cellen na 6 uur (aanvullende figuur 1B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66645/66645fig01.jpg"> Figuur 1: Ferroptotisch fenotype van medulloblastoomcellen. Representatieve microfoto's van DAOY WT-cellen die gedurende 6 uur zijn behandeld (of niet) met 1 μM erastine (ERA), 0,3 μM RSL3 of 250 μM ferroammoniumcitraat (FAC) in aanwezigheid van 2 μM ferroptoseremmer Ferrostatine-1 (Ferro-1). Witte pijlen geven ronde, "borrelende" cellen aan, wat wijst op een ferroptotisch fenotype dat zichtbaar is onder een lichtmicroscoop. Vergroting: 20x, inzetstukken: 40x. Schaalbalken: 50 μm, inzet: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/66645fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66645/66645fig02.jpg"> Figuur 2: Lipidehydroperoxide als de belangrijkste marker van ferroptose in medulloblastoomcellen. Representatieve gegevens van de lipidehydroperoxidekleuring door middel van flowcytometrie in de cellen die gedurende 6 uur zijn behandeld met (A,B) 1 μM erastine (ERA), (C,D) 0,3 μM RSL3, of (E,F) 250 μM ferroammoniumcitraat (FAC), al dan niet in aanwezigheid van 2 μM ferroptoseremmer Ferrostatine-1 (Ferro-1). (A,C,E) Dot plots van de opgenomen gebeurtenissen; (B,D,F) Histogramweergave van het lipidehydroperoxidegehalte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/66645fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66645/66645fig03.jpg"> Figuur 3: Inductie van ferrototische celdood volgens farmacologische benadering. Representatieve flowcytometrie dot plots van propidiumjodide-gekleurde cellen na 6 uur behandeling met 1 μM erastine (ERA), 0,3 μM RSL3 of 250 μM ferroammoniumcitraat (FAC), al dan niet in aanwezigheid van 2 μM ferroptoseremmer Ferrostatine-1 (Ferro-1). Gating scheidt levende (Q4) en dode (Q3) populaties van de cellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/66645fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66645/66645fig04.jpg"> Figuur 4: Inductie van ferrotroptose door genetische benadering. Representatieve gegevens van de lipidehydroperoxidekleuring door flowcytometrie in de DAOY WT- en xCT-/- cellen na 6 uur in aanwezigheid of niet van 2 μM ferroptoseremmer Ferrostatine-1 (Ferro-1). Aan de linkerkant is de histogramweergave van het gehalte aan lipidehydroperoxide. Aan de rechterkant staan de dot plots van de opgenomen gebeurtenissen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/66645fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Plaat I</td>
			<td>CTL I</td>
			<td>CTL II</td>
			<td>CTL III</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>1 μM erastin I</td>
			<td>1 μM erastin II</td>
			<td>1 μM erastine III</td>
		</tr><tr><td>Plaat II</td>
			<td>0,3 μM RSL3 I</td>
			<td>0,3 μM RSL3 II</td>
			<td>0,3 μM RSL3 III</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>250 μM FAC I</td>
			<td>250 μM FAC II</td>
			<td>250 μM FAC III</td>
		</tr><tr><td>Plaat III</td>
			<td>2 μM Ferro-1 I</td>
			<td>2 μM Ferro-1 II</td>
			<td>2 μM Ferro-1 III</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>1 M erastin + 2 M Ferro-1 I</td>
			<td>1 M erastin + 2 M Ferro-1 II</td>
			<td>1 M erastin + 2 M Ferro-1 III</td>
		</tr><tr><td>Plaat IV</td>
			<td>0,3 m RSL3 + 2 m Ferro-1 I</td>
			<td>0,3 m RSL3 + 2 m Ferro-1 II</td>
			<td>0,3 M RSL3 + 2 M Ferro-1 III</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>250 m FAC + 2 m Ferro-1 I</td>
			<td>250 m FAC + 2 m Ferro-1 II</td>
			<td>250 m FAC + 2 m Ferro-1 III</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Behandelingsdetails van de controle- en experimentele cellen.
Aanvullende figuur 1: Ferroptotische celdood van de DAOY xCT-/- cellen. (A) Western blot-analyse van het xCT-niveau in DAOY WT- en xCT-/-cellen in DMEM-media al dan niet aangevuld met 2 μM ferrostatine-1. (B) Representatieve microfoto's van de DAOY xCT-/- cellen in aanwezigheid (links) en afwezigheid (rechts) van 1mM N-acetylcysteïne gedurende 6 uur. Witte pijlen geven ronde, "borrelende" cellen aan, wat wijst op een ferroptotisch fenotype dat zichtbaar is onder een lichtmicroscoop. Vergroting: 40x. Schaalbalken: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Het gehalte aan lipidehydroperoxide is de meest gebruikte indicator van ferroptotische celdood. Dit artikel demonstreert de stapsgewijze flowcytometrieanalyse van het lipidehydroperoxidegehalte in cellen bij ferroptose-inductie.

Onthullen van het ferroptomatische fenotype van medulloblastoom

The interaction of iron and oxygen is an integral part of the development of life on Earth. Nonetheless, this unique chemistry continues to fascinate and ...

Het uiteindelijke doel van ons onderzoek is het ontwikkelen van nieuwe therapieën voor kinderkankers zoals myoblastoom. Voor dit doel ontwikkelt ons team nieuwe modelsystemen die de genetische achtergrond van de ziekte benadrukken en nieuwe therapeutische wegen exploiteren. In de afgelopen jaren heeft single-cell genomica onthuld hoe verminderde afstammingsbinding de klinische uitkomst van pediatrische kankers beïnvloedt, evenals de respons op de behandelingen en uiteindelijk de ontwikkeling van behandelingsresistente celpopulaties in de tumor.Het spectrum van neurale voorloper gedifferentieerde toestand lijkt ten grondslag te liggen aan de klinische uitkomst van kinderkanker. De belangrijkste uitdagingen zijn het begrijpen van deze zeer plastisch bekende of onvoldoende voorlopercellen in de tumoren, evenals het ontwikkelen van nieuwe therapieën die efficiënter en minder schadelijk zijn voor deze ziekten. Vanuit dit oogpunt lijkt ons onderzoek naar ferroptose veelbelovend.IJzerafhankelijkheid is een van de belangrijkste kwetsbaarheden van kankercellen, ook wel kankerstamcellen genoemd, alle essentiële elementen. IJzer is een tweesnijdend zwaard omdat de reactie met reactieve zuurstofsoorten kan leiden tot het specifieke type celdood, dat ferroptose wordt genoemd. Onze gegevens toonden duidelijk aan dat ferroptose een groot potentieel is tegen dit type kankercellen.

revealing-the-ferroptotic-phenotype-of-medulloblastoma

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Dit protocol beschrijft de isolatie, verrijking en het onderhoud van medulloblastoom tumor stamcellen uit mutante muizen met ectopische Sonic Hedgehog pathway activiteit.

Isolatie, Verrijking, en onderhoud van Medulloblastoom Stem Cells

Dit protocol beschrijft de isolatie en dissociatie van de muis medulloblastoom weefsel, en de daaropvolgende allografting van de tumorcellen in immuungecompromitteerde ontvangende muizen in om secundaire medulloblastoom te starten.

Intracraniële orthotope Allografting van Medulloblastoom cellen in Immunogecompromitteerde Muizen

Hier beschrijven we een efficiënt en veelzijdig protocol om nieuwe glioblastoma (GBM) te induceren, monitoren en analyseren met behulp van transposon DNA dat in de ventrikels van neonatale muizen wordt geïnjecteerd. Cellen van de subventriculaire zone, die het plasmide opnemen, transformeren, prolifereren en genereren tumoren met histo-pathologische kenmerken van menselijk GBM.

Transposon Mediated Integratie van plasmide DNA in de subventriculaire zone van pasgeboren muizen om Novel Modellen van glioblastoma Genereer

Hier gepresenteerd is een protocol om genetische manipulatie uit te voeren in de embryonale fret hersenen met behulp van in utero elektroporatie. Deze methode maakt het mogelijk om neurale voorlopercellen in de neocortex in vivo te targeten.

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex door In Utero Electroporation

Met  behulp van ovo-elektroporatie hebben we een methode ontwikkeld om selectief het auditieve binnenoor en de cochleaire kern in kippenembryo's te transfecteren om een celgroepspecifieke knockdown van fragiele X mentale retardatie-eiwit te bereiken tijdens discrete perioden van circuitassemblage.

Ontleedende cel-autonome functie van fragiele X mentale retardatie-eiwit in een auditief circuit door In Ovo-elektroporatie

Methoden die de karakterisering en isolatie van stamcellenpopulaties van biologische monsters mogelijk maken, zijn cruciaal voor het voorschot van stamcelgerichte behandelingen in kanker en daarbuiten. Hier geven we een gedetailleerd protocol voor kanker stamcellenisolatie met behulp van het kleurstof geactiveerde zijpopulatie fenotype.

De DNA-kleurstof geactiveerde zijbevolkingsfenotype gebruiken om de kankerstamcellen van biologische monsters te detecteren en te zuiveren

Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van echografie-geleide injectie van neuroblastoom (NB) en de Ewing sarcoom (ES) cellen (gevestigde cellijnen en patiënt afkomstige tumorcellen) op biologisch relevante sites maken van betrouwbare preklinische modellen voor kanker onderzoek.

Gebruik van echografie begeleide weefsel geleide cellulaire implantatie voor de oprichting van biologisch relevante uitgezaaide Tumor Xenografts

Hier presenteren we een protocol om te isoleren van apoptotic borstkankercellen door fluorescentie-geactiveerde cel Sorteren en de overgang van niet-stam borstkankercellen aan stamcel-achtige borstkankercellen na apoptosis omkering verder kan worden opgespoord door stroom cytometry.

Stroom cytometrische detectie van nieuwgevormde stamcel-achtige borstkankercellen na Apoptosis omkering

Dit protocol schetst een snelle methode voor het gelijktijdig genereren van melanocyt en fibroblast culturen uit de huid van 0-4 dag oude muizen. Deze primaire culturen kunnen in vitro worden gehandhaafd en gemanipuleerd om een verscheidenheid aan fysiologisch relevante processen te bestuderen, waaronder huidcelbiologie, pigmentatie, wondgenezing en melanoom.

Snelle aanmaak van primaire Murine melanocyten en fibroblast-culturen

In dit artikel presenteerden we een reeks praktische en haalbare methoden voor het karakteriseren van ziekte-gerelateerde mutanten van RAF familie kinasen, waaronder in vitro kinase Assay, RAF co-Activation Assay, en complementaire Split plaats assay.

Karakteriseren ziekte-gerelateerde mutanten van RAF familie kinasen met behulp van een set van praktische en haalbare methoden

Ontdek hoe ferroptose-inductie een veelbelovende therapeutische strategie biedt voor medulloblastoom. Deze methode helpt onderzoekers behandelresistente celpopulaties te identificeren en nieuwe therapieën te ontwikkelen.

Onthullen van het ferroptomatische fenotype van medulloblastoom

Meer video's verkennen