Name: Organotypische plakcultuur van het ruggenmerg van muizen als platform voor het valideren van celtransplantatie bij ruggenmergletsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Leer een organotypische ruggenmergcultuur van muizen voor het valideren van celtransplantatie bij ruggenmergletsel. Dit ex vivo model verbetert overleving en integratie van neurale stamcellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De studie werd ondersteund door de Wings for Life Foundation (WFL-IT- 20/21), het European Union Next-Generation EU-National Recovery and Resilience Plan (NRRP)-missie 4 component 2, investering n. 1.4-CUP N. B83C22003930001 (Tuscany Health Ecosystem-THE, Spoke 8) en de Marina Romoli Onlus. Dit manuscript geeft alleen de standpunten en meningen van de auteurs weer, noch de Europese Unie, noch de Europese Commissie kunnen hiervoor verantwoordelijk worden geacht. Gegevens en metadata zijn beschikbaar op Zenodo 10.5281/zenodo.10433147. Afbeeldingen zijn gegenereerd met Biorender https://www.biorender.com/.

Langdurige implantatie van h-SC-NES-cellen in organotypische culturen van het ruggenmerg

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Er is nog steeds geen effectieve behandeling voor patiënten met dwarslaesie. Er zijn verschillende benaderingen getest en een van de meest veelbelovende is gebaseerd op een regeneratieve strategie: celvervanging. Momenteel vraagt de vooruitgang op het gebied van regeneratieve geneeskunde om nieuwe platforms om de werkzaamheid en veiligheid van celtransplantaties te testen, alleen of in combinatie met andere benaderingen. Hun preklinische validatie is essentieel om verdere klinische studies voort te zetten. SC organotypische culturen zijn een nuttig platform voor het bestuderen van verschillende aspecten van neurodegeneratie, neurale regeneratie en neuroontwikkeling, en voor het onderzoeken van de effectiviteit van nieuwe therapeutische benaderingen23. Met name specifieke kenmerken van de organotypische culturen, zoals het behoud van de oorspronkelijke histoarchitectuur en de samenstelling van de cel- en micro-omgeving, zijn nuttig voor het ontrafelen van de transplantatiedynamiek, zoals celimplantatie, integratie, differentiatie en rijping.
In overeenstemming met gepubliceerde protocollen kunnen SC-organotypische plakjes ongeveer 2-3 weken in cultuur worden gehouden onder gezonde omstandigheden, wat het gebruik ervan voor de langetermijnonderzoeken en functionele screening die nodig zijn voor testschema's van celtherapie beperkt. Het onderzoeken van belangrijke processen zoals differentiatie en rijping naar het juiste lot van getransplanteerde cellen in SC-weefsel vereist monitoring op lange termijn. Deze cellulaire processen zijn van cruciaal belang tijdens gewone transplantaties in diermodellen. De beschikbaarheid van een ex vivo-systeem dat veel kenmerken nabootst die in vivo aanwezig zijn, zou nuttig zijn in de preklinische screeningfase.
Om deze reden stellen we in dit werk een optimale SC-organotypische kweekmethode op lange termijn (≥30 dagen) voor die het mogelijk maakt om levensvatbare SC-plakjes tot 90 dagen te behouden, waardoor hun gebruikelijke kweektijdsbestek wordt verdrievoudigd. Bovendien tonen we een stabiele h-SC-NES-celimplantatie in SC-plakjes en het behoud van de transplantatiecultuur tot 30 dagen. We hebben de celimplantatie in de loop van de tijd gevolgd door GFP-expressie te observeren om de celoverleving tot DPT 30 te verifiëren. Na 30 DPT evalueerden we het celapoptosepercentage. In de literatuur is de evaluatie van apoptose van getransplanteerde h-SC-NES-cellen in SC-plakjes bij 7 DPT gerapporteerd40. Hier hebben we de analyse van celapoptose bij DPT 30 uitgebreid om de apoptotische snelheid te vergelijken met het eerdere tijdstip (DPT 7). We ontdekten dat onze gegevens in overeenstemming zijn met de literatuur, wat suggereert dat getransplanteerde h-SC-NES-cellen ook op een later tijdstip overleven als ze in de kweekconditie worden gehouden die in ons werk is geoptimaliseerd. Dit verbeterde ex vivo-platform op lange termijn, alleen en in de transplantatieconfiguratie, zal onderzoekers helpen bij preklinische screening op stamceltransplantaties voor dwarslaesie. Dit zal hen in staat stellen om de beste celkandidaat te identificeren voor verdere in vivo studies die het succes van de transplantaties bevorderen. Bovendien kunnen SC-organotypische plakjes na de eerste screening ook parallel aan de in vivo studies worden gebruikt om de cellulaire dynamiek en het gedrag op lange termijn die in diermodellen zijn waargenomen, te bevestigen en te bevestigen of om mechanistische studies te ondersteunen.
Ons protocol beschrijft in detail hoe dit organotypische model op lange termijn kan worden gegenereerd, maar er moeten ook enkele cruciale stappen worden besproken. Wat betreft het genereren van de SC organotypische culturen, zijn er enkele uitdagingen tijdens de operatie en de eerste stadia van de kweek. Een goed uitgevoerde chirurgische ingreep is essentieel om plakjes te genereren die de oorspronkelijke histoarchitectuur behouden. Als de SC tijdens de isolatie wordt geruïneerd, kunnen plakjes hun typische anatomische structuur verliezen en kan weefselbeschadiging een overmatige pro-inflammatoire belediging veroorzaken, wat leidt tot ongezonde omstandigheden en celdood. De meest uitdagende fase tijdens de operatie is de extractie van de SC uit de ruggengraat en de verwijdering van hersenvliezen uit de geïsoleerde SC. Het succes van deze stappen hangt af van de ervaring van de operator; Daarom is een trainingsperiode aan te raden voordat met de experimenten wordt begonnen.
Coronale doorsnede van de SC door middel van een helikopter is ook een uitdagende fase. De geïsoleerde SC moet op het maaidek worden geplaatst, precies loodrecht op het mes. De bediener moet het mes ook loodrecht op het maaidek plaatsen. Deze voorzorgsmaatregelen zijn nodig om ervoor te zorgen dat er reproduceerbare plakjes worden gegenereerd tussen dezelfde en verschillende experimenten. Een ander belangrijk punt is dat de tijd voor een operatie beperkt is: de hele procedure voor het genereren van plakjes moet ~30 minuten duren. Als de operator meer tijd besteedt aan chirurgie en snijden, zal het SC-weefsel eronder lijden en dit kan het succes van de kweek en de volgende stappen van het experiment schaden.
Zodra de plakjes op het kweekmembraan zijn geplaatst, is het belangrijk om ze op de juiste manier te voeren. GDNF is nodig om weefselherstel en overleving te ondersteunen. Snijden met een hakmolen is traumatisch voor het weefsel en om deze reden worden plakjes kort na de snede in een ijskoud dissectiemedium geplaatst om het teveel aan pro-inflammatoire en doodbevorderende moleculen te verwijderen. Vervolgens worden plakjes op de kweekmembranen (celcultuurinserts) geplaatst met vers medium dat is gemodificeerd met GDNF om een sneller herstel en plakhechting aan het membraan te bevorderen. GDNF moet de eerste week in cultuur elke dag aan het medium worden toegevoegd vanwege de korte halfwaardetijd50,51. We hebben vastgesteld dat plakjes de continue aanwezigheid van GDNF nodig hebben tijdens de eerste dagen in de kweek om weefselherstel en levensvatbaarheid te bevorderen. In ieder geval, aangezien de aanwezigheid van GDNF belangrijk is voor de gehele teeltperiode, wordt het sterk afgeraden om de GDNF-administratie op verdere tijdstippen te onderbreken.
Tijdens de eerste week in de kweek is het ook belangrijk om de plakjes macroscopisch met het oog en met de microscoop te controleren. Doorschijnend weefsel en transparantie van de randen zijn tekenen van een goede hechting van de plakjes aan het membraan en van levensvatbaar weefsel. Het necrotische weefsel zal op het eerste macroscopische zicht extreem wit lijken en de necrotische gebieden zullen er donkergrijs uitzien met de microscoop. Na enkele weken in kweek kan de morfologie van het weefsel veranderen: celbewegingen en weefseladhesie aan het membraan kunnen dit proces beïnvloeden. We zagen bijvoorbeeld het verlies van het centrale lumen in sommige plakjes gevuld met cellen en het verlies van de morfologie van de dorsale en ventrale hoorn. Dit gebeurt voornamelijk met kleinere plakjes, terwijl de meeste van hen een anatomische structuur behouden die dicht bij de originele ligt. Plakjes worden meestal gegenereerd vanuit de lumbale of thoracale regio's, omdat ze op deze manier de juiste grootte kunnen hebben om hun oorspronkelijke histoarchitectuur in de loop van de tijd te behouden: als ze te klein zijn, verliezen ze hun architectuur, terwijl, als ze te groot zijn, het centrale gebied necrose kan ondergaan. Daarom hebben we het lumbale gebied van muizenpups gebruikt om plakjes te genereren met de juiste grootte voor een optimale kweek op lange termijn, maar in principe kunnen ook andere segmenten worden overwogen. Bovendien hebben we ervoor gekozen om de lumbale regio te gebruiken, omdat ventrale en dorsale regio's beter van elkaar te onderscheiden zijn. Bovendien presenteert dit gebied weefselgebieden met een hoger percentage motorneuronen en grijze stof, die van belang zijn voor celvervangende therapieën bij dwarslaesie. Wat betreft het transplanteren van cellen in de plakjes, houdt het belangrijkste probleem verband met het breken van de glazen micronaaldpunt. Als het gat voor de doorgang van cellen te groot is, kan dit tijdens de micro-injectie schade aan SC-weefsel veroorzaken. Als het te klein is, kan celstapeling de naald belemmeren, waardoor het transplantatieproces wordt belemmerd. De transplantatieprocedure moet binnen 1 uur worden voltooid om cellijden en -dood tot een minimum te beperken.
Het voorgestelde protocol biedt een optimaal en veelzijdig hulpmiddel voor verschillende soorten onderzoeken. Hier passen we ons langetermijnplatform toe om de transplantatie van h-SC-NES-cellen in de eerste stadia van differentiatie in SC-weefsel van muizen gedurende 30 dagen te valideren. De belangrijkste nieuwigheid van de voorgestelde aanpak is de optimalisatie van het co-cultuurprotocol. De componenten van GM ondersteunen de neuronale overleving op lange termijn van de SC-plakjes en de getransplanteerde h-SC-NES-cellen. Inderdaad, GM, als een serumvrij medium, ondersteunt de differentiatie van de getransplanteerde cellen naar het neuronale lot ten opzichte van het medium dat eerder werd gebruikt voor organotypische plakcultuur47.
Wat betreft de voorgestelde modellen voor dwarslaesie, worden experimenten meestal uitgevoerd op volwassen muizen. Tot nu toe zijn de belangrijkste verschillen tussen neonatale en volwassen SC gerelateerd aan het hogere regeneratieve potentieel dat wordt gevonden bij neonatale muizen met betrekking tot de volwassen muizen52. Dergelijke verschillen hebben echter geen invloed op het type protocol dat we voorstellen, aangezien we ons hier concentreren op de reactie van getransplanteerde cellen op de omgeving van het hostende weefsel in plaats van op het regeneratievermogen van de residente neuronen. Een ander verschil tussen neonatale en volwassen muizen na een dwarslaesie houdt verband met de vorming van het glialitteken dat optreedt bij volwassenen. Met dit aspect wordt geen rekening gehouden in het voorgestelde model, dat geen rekening houdt met de complexe fysiopathologische processen die het gevolg zijn van primaire en secundaire verwondingen.
Wat de toepassingen betreft, zou het platform ook kunnen worden gebruikt om de integratie te onderzoeken tussen de getransplanteerde cellen en residente circuits die aanwezig zijn in het SC-organotypische model. Genetische manipulatie-instrumenten werden al gebruikt in het CZS om synaptische connectiviteit te evalueren en zouden in dit opzicht kunnen worden geëxploiteerd 53,54,55. In het bijzonder kan de integratie worden onderzocht en gevalideerd door de vorming van synapsen tussen de getransplanteerde cellen en het SC ex vivo weefsel te beoordelen. Deze organotypische culturen op lange termijn kunnen ook worden gebruikt voor het testen van neuroprotectieve en neuroregeneratieve middelen of nieuwe moleculen/materialen of voor het bestuderen van neurodegeneratieve aandoeningen waarbij de SC betrokken is. Om specifieke neurodegeneratieve aandoeningen te bestuderen, moet het protocol worden aangepast voor het kweken van SC-plakjes die zijn gegenereerd uit relevante modellen, zoals transgene muizen met specifieke pathologie-geassocieerde mutaties, in het relevante stadium voor de pathologie (d.w.z. neonataal, juveniel, volwassen). Concluderend kunnen we stellen dat ons protocol en organotypische culturen in het algemeen, als explantaten van een specifiek orgaan, kenmerken vertonen die de kloof overbruggen tussen 2D-celculturen en in vivo modellen, en bevestigen dat ze van onschatbare waarde zijn voor zowel fundamenteel onderzoek als preklinische tests.

Traumatisch ruggenmergletsel (SCI) heeft verwoestende fysieke, psychologische en economische gevolgen voor patiënten en zorgverleners1. Er zijn veel pogingen gedaan om axonale regeneratie bij dwarslaesie te bevorderen met verschillende benaderingen 2,3,4 en enkele gunstige effecten werden aangetoond door de vorming van neuronale relais tussen proximale en distale neuronen op de plaats van de verwonding door middel van celvervangingstherapieën. De belangstelling voor celtherapieën groeit nog steeds5 aangezien getransplanteerde cellen vele rollen kunnen spelen, waaronder het bieden van trofische ondersteuning, immuunmodulatie, het regenereren van verloren neurale circuits door inductie van plasticiteit, celvervanging en axonremyelinisatie6.
Onlangs was de belangrijkste inspanning in het veld gericht op menselijke neurale stam-/voorlopercellen (NSC's/NPC's)7. Verschillende studies suggereren dat NSC's/NPC's de astrocytenrespons moduleren8, de afscheiding van proregeneratieve factoren 9,10 bevorderen en ontbrekende neuronale cellen vervangen in SCI11,12. Studies die de differentiatie van getransplanteerde cellen in functionele neuronen ondersteunen, zijn echter nog steeds slecht. Bovendien zijn de overleving en differentiatie van getransplanteerde cellen in het beschadigde ruggenmerg (SC) laag13, mogelijk omdat getransplanteerde cellen enkele weken, zelfs maanden, nodig hebben om in vivo te differentiëren. Bovendien hebben de huidige studies veel biochemische, moleculaire, cellulaire en functionele aspecten van celvervangende therapieën niet volledig opgehelderd. In deze context zijn eenvoudige, snelle en kosteneffectieve modellen nodig om de mechanismen van celimplantatie te bestuderen, het vermogen van getransplanteerde cellen om zich te vermenigvuldigen, te differentiëren in specifieke typen of subpopulaties van cellen en synapsen te vormen met residente neuronen.
Integratie van histologische studies in elektrofysiologische registratie en transcriptoom- en proteoomprofilering is noodzakelijk voor een volledig begrip van de moleculaire cascade die optreedt na celtransplantatie. Dit zal zeker het ontwerp en de validatie van nieuwe celvervangende therapieën in preklinische modellen en klinische studies versnellen. Tot op heden is het gebruik van knaagdieren, grote dieren en niet-menselijke primaten inderdaad de moeite waard geweest voor het ophelderen van veel cellulaire processen na transplantatie14. Vanwege de hoge kosten, de hoge ethische impact en de complexiteit van het organisme is het gebruik ervan echter vaak niet eenvoudig of niet geschikt om biochemische en moleculaire processen te ontrafelen. Bovendien kunnen ze veel nadelen vertonen die verband houden met biologische verschillen, zowel tussen soorten (metabolisme) als variabiliteit binnen soorten (geslacht, leeftijd).  Deze factoren, samen met externe factoren zoals stressvolle situaties, kunnen de uitkomst van een experiment en hun voorspelbaarheid in termen van therapeutische vertaling naar mensen veranderen 15,16,17.
Daarom maken veel groepen naast diermodellen ook gebruik van 2D in vitro celcultuur en ex vivo organotypische plakjes (ex vivo culturen). 2D-celcultuur is het meest gebruikte systeem voor het bestuderen van specifieke biologische processen op het niveau van een enkele cel en/of celpopulatie. Monolayer celculturen weerspiegelen echter niet de complexiteit die in een heel organisme wordt aangetroffen. Het gebrek aan weefselstructuren en fysiologische omgeving stelt de 2D-kweeksystemen niet in staat om de belangrijkste structurele, morfologische en functionele aspecten van het onderzochte weefsel volledig na te bootsen 18,19,20.Organotypische culturen kunnen een aantal van deze problemen oplossen. Organotypische modellen zijn gebaseerd op het explanten van een fragment van een weefsel of orgaan en het ex vivo bewaren ervan gedurende een beperkte periode21,22. In het bijzonder worden plakjes van het geëxplanteerde weefsel gegenereerd met een precieze dikte waardoor voedingsstoffen gemakkelijk bijna alle cellen in de plakjes kunnen bereiken. Ze kunnen worden gegenereerd vanuit verschillende regio's van het centrale zenuwstelsel, zoals de hippocampus, hypothalamus, cerebellum, thalamus, cerebrale cortex, substantia nigra en striatum, en ruggenmerg23. Organotypische culturen behouden de weefselarchitectuur, de ruimtelijke verdeling van cellen, de cellulaire diversiteit en de omgeving (d.w.z. de samenstelling van de extracellulaire matrix) van het orgaan van oorsprong. Bovendien behouden ze de oorspronkelijke neurale activiteit, verbindingen tussen cellen, en in het bijzonder korteafstandscircuits na de explantatie.
Deze aspecten bieden enkele voordelen voor ex vivo culturen met betrekking tot zowel monolaagculturen als diermodellen. Ze behouden de belangrijkste weefselkenmerken die in vivo worden gevonden, maar met de verlaging van de kosten en de mogelijkheid om verschillende soorten moleculaire, cellulaire en functionele experimenten uit te voeren met een nauwkeurige regeling van de omgevingsparameters van de kweek 24,25,26,27,28,29. Organotypische plakjes kunnen ook worden gebruikt om modellen te ontwikkelen voor verschillende neurologische aandoeningen door te lijken op de belangrijkste histopathologische kenmerken van specifieke aandoeningen30. Bovendien maakt het behoud van de oorspronkelijke meercellige weefselomgeving ze tot geschikte platforms voor het screenen van geneesmiddelen en voor het testen van neuroprotectieve en neuroregeneratieve moleculen en materialen.
In dit werk stellen we het gebruik van SC-organotypische culturen voor als model om NSC-transplantaties te optimaliseren. Dit is niet triviaal, aangezien optimale kweekomstandigheden nodig zijn om de overleving van zowel de gastheer (SC-weefsel) als de transplantatie (NSC's) wekenlang te garanderen. Verschillende onderzoeksgroepen geënt in organotypische culturen, van de hersenen afgeleid en van SC afgeleid, verschillende soorten cellen. De meeste werken toonden de transplantatie van mesenchymale stamcellen 31,32,33, olfactorische omhullende cellen34 of NSC's 35,36,37,38,39,40 en evalueerden de interacties van getransplanteerde cellen met de gastheercellen, de overleving van het hele systeem en of de getransplanteerde cellen differentieerden in neuronen of neuronachtige cellen in de ex vivo weefselomgeving 32,33,41. Sommigen van hen evalueerden het regeneratieve potentieel van cellen na transplantatie, observeerden hun axonale groei in het weefsel 37,40,41, het myeliniserende vermogen van getransplanteerde voorlopers van oligodendrocyten42, de migratie van getransplanteerde cellen in het gastheerweefsel43, en of de getransplanteerde cellen factoren vrijgaven die in de richting van een proregeneratieve omgeving duwden31. Een beperking van de huidige studies is dat ze de implantatie niet voor een lange periode onderzoeken.
Gezien het feit dat NSC's enkele weken nodig lijken te hebben om in vivo44,45 te differentiëren, richt deze studie zich op het genereren en behouden van SC-plakjes van muizen op lange termijn (≥30 dagen) tot 90 dagen. Plakjes bleken hun oorspronkelijke anatomische structuur te behouden en in de loop van de tijd een lage en stabiele apoptotische snelheid en een hoge cellevensvatbaarheid te behouden. We observeerden diffuse expressie van neuronale markers RNA-bindende fox-1 homoloog 3 (RBFOX3) en neurofilament lichte keten (NFL), waarbij de laatste in de loop van de tijd een toenemende trend van axonale ontkieming rond de plakjes vertoonde, wat getuigt van hun gezonde toestand. Bovendien hebben we met succes GFP-expressieve menselijke SC-afgeleide neuro-epitheliale stamcellen (h-SC-NES) in de SC-plakjes getransplanteerd in de eerste stadia van neuronale differentiatie. Het NSC-transplantaat werd gedurende 30 dagen na transplantatie gehandhaafd en de cellen vertoonden GFP-expressie gedurende de hele periode in de kweek. De apoptotische snelheid van cellen op de dag na transplantatie (DPT) 30 bleek ook in overeenstemming te zijn met de apoptotische snelheidswaarde die werd waargenomen bij DPT 7 in dezelfde cellen40. Cellen leken zich te enten in de weefselomgeving en overleefden tot enkele weken.
Samenvattend tonen onze gegevens aan dat het mogelijk is om SC organotypische plakjes gedurende 3 maanden in cultuur te houden zonder hun oorspronkelijke cytoarchitectuur en de weefselomgeving in gevaar te brengen. Het belangrijkste is dat ze kunnen worden gebruikt om celtherapieën te testen voordat wordt doorgegaan met een in vivo experiment, waardoor de kosten en de experimentele tijd worden verminderd. Hier illustreren we in detail alle passages om SC-organotypische plakjes van muizen te genereren en hoe deze gedurende lange perioden (≥30 dagen) kunnen worden bewaard. Bovendien leggen we uitgebreid uit hoe NPC-transplantatie in de plakjes moet worden uitgevoerd en hoe ze moeten worden onderhouden voor stroomafwaartse analyse.

<table><tbody><tr><td>anti-cleaved Caspase-3,&nbsp; (Asp175) (5A1E) (Konijn)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9661S</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-GFP (Muis) - monoklonaal</td><td>Sigma/Merck</td><td>G6539</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-Human Nuclei (Muis) - monoklonaal, clone 235-1&nbsp;</td><td>Sigma/Merck</td><td>MAB1281</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-Human Nuclei (Konijn)</td><td>NeoBiotechnologies</td><td>RBM5-346-P1</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-NeuN (RBFOX3) (Konijn) - polyklonaal</td><td>Sigma/Merck</td><td>ABN78</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-NFL (Muis)</td><td>Sigma/Merck</td><td>MAB1615</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-NFL H-Phospho (Konijn) -polyklonaal</td><td>Biologend</td><td>840801</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Aqua Polymount</td><td>Poly-sciences</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Gibco</td><td>PHC7074</td><td></td></tr><tr><td>Blades</td><td>Leica</td><td>118364227</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture graded water</td><td>Sigma/Merck</td><td>W3500-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Collagen van rattenstaart</td><td>Sigma/Merck</td><td>C7661</td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop - A1 Confocal Microscope (Eclipse Ti)</td><td>Nikon&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Sigma/Merck</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Dissectiepincet</td><td>World Precision Instruments</td><td>15915</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>31330</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma/Merck</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma/Merck</td><td>gf144</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Stemgent</td><td>03-0002</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Sigma/Merck</td><td>SRP3200</td><td></td></tr><tr><td>Glas capillairen, 3.5"&nbsp;</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Goat-anti Muis IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Goat-anti Muis IgG Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21236</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Goat-anti Konijn IgG Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11011</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Goat-anti Konijn IgG Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21244</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Graph Pad-Prism</td><td>Dotmatics</td><td></td><td>Software voor statistische analyse</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-050</td><td>1:500</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Paarden serum</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma/Merck</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>Laminine</td><td>Sigma/Merck</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirale voorbereiding</td><td>Addgene</td><td>17446-LV</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity assay kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L32250</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco</td><td>11090-081</td><td></td></tr><tr><td>Microloader tips</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>om cellen in de naald voor transplantatie te laden</td></tr><tr><td>Microscoopglaasjes</td><td>VWR</td><td>631-0909</td><td></td></tr><tr><td>Millicell cell culture membrane</td><td>Sigma/Merck</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop dekglasjes</td><td>VWR&nbsp;</td><td>ECN 631-1572</td><td></td></tr><tr><td>N-2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal (35mm)</td><td>VWR</td><td>734-2317</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma/Merck</td><td>P6148-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kunststof pasteurpipet</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171.010</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatische PicoPump</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV830</td><td>Microinjector voor transplantatie</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma/Merck</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Scalpelmesje nr. 10 Sterile Roestvrij Staal</td><td>VWR International</td><td>SWAN3001</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel handvat #3</td><td>World Precision Instruments</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>Spring schaar</td><td>World Precision Instruments</td><td>501235</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscoop voor beeldvorming en acquisitie</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>SMZ18</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscoop voor chirurgie</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Pincet-Dumont #5-inox</td><td>World Precision Instruments</td><td>501985</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Schaar, 8.5 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>500086</td><td></td></tr><tr><td>Verticale micropipettrekker</td><td>Shutter Instrument</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>R&amp;D Systems</td><td>1254/50</td><td></td></tr></tbody></table>

organotypische plakcultuur van het ruggenmerg van muizen als platform voor het valideren van celtransplantatie bij ruggenmergletsel

Long-Term Mouse Spinal Cord Organotypic Slice Culture as a Platform for Validating Cell Transplantation in Spinal Cord Injury

Definitieve behandelingen voor ruggenmergletsels (SCI's) ontbreken nog steeds, vanwege de complexe pathofysiologie. Een van de meest veelbelovende regeneratieve benaderingen is gebaseerd op stamceltransplantatie om verloren weefsel te vervangen en functioneel herstel te bevorderen. Deze aanpak moet in vitro en ex vivo verder worden onderzocht op veiligheid en werkzaamheid alvorens over te gaan tot duurdere en tijdrovendere dierproeven. In dit werk tonen we de oprichting van een langetermijnplatform op basis van organotypische plakjes ruggenmerg (SC) van muizen die zijn getransplanteerd met menselijke neurale stamcellen om cellulaire vervangingstherapieën voor dwarslaesies te testen.
Standaard SC organotypische culturen worden in vitro ongeveer 2 of 3 weken bewaard. Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol voor langdurig onderhoud (≥30 dagen) tot 90 dagen. Het medium dat wordt gebruikt voor het langdurig kweken van SC-plakjes werd ook geoptimaliseerd voor het transplanteren van neurale stamcellen in het organotypische model. Menselijke SC-afgeleide neuro-epitheliale stamcellen (h-SC-NES) die een groen fluorescerend eiwit (GFP) -reporter droegen, werden getransplanteerd in SC-plakjes van muizen. Dertig dagen na de transplantatie vertonen cellen nog steeds GFP-expressie en een lage apoptotische snelheid, wat suggereert dat de geoptimaliseerde omgeving hun overleving en integratie in het weefsel ondersteunde. Dit protocol vertegenwoordigt een robuuste referentie voor het efficiënt testen van celvervangende therapieën in het SC-weefsel. Dit platform stelt onderzoekers in staat om een ex vivo pre-screening van verschillende celtransplantatietherapieën uit te voeren, waardoor ze de meest geschikte strategie kunnen kiezen voordat ze doorgaan met in vivo experimenten.

De beschreven methoden maken het mogelijk om SC-organotypische plakjes van muizen in stadium P3 vast te stellen en hun gedurende langere tijd in cultuur te houden onder gezonde omstandigheden. Bovendien laten we een protocol zien voor het transplanteren van cellen in de plakjes en voor het samen kweken ervan gedurende maximaal 30 dagen (Figuur 1). Eerst tonen we de optimalisatie van de kweekomstandigheden en een protocol dat geschikt is voor het langdurig kweken van de SC-plakjes met getransplanteerde cellen (Figuur 2A). Plakjes worden gegenereerd en onderhouden van DEV 0 tot DEV 2 in het OM, dat oorspronkelijk werd voorgesteld als een optimaal medium voor het onderhoud van SC-plakjes47. Door de aanwezigheid van serumeiwitten kan dit medium echter suboptimaal zijn om de neuronale differentiatie en rijping van de getransplanteerde neurale voorlopercellen te ondersteunen. Inderdaad, bij DEV 3 hebben we de overstap van OM naar de GM getest, een formulering met Neurobasal plus B27, die de neurale overleving ondersteunt, en zonder serum, dat de juiste neuronale differentiatie remt en in plaats daarvan een gliaal lot bevordert48,49.
Figuur 2B toont de resultaten die worden bereikt door het medium bij DEV 3 om te schakelen van OM naar GM, vergeleken met de SC-plakjes die de schakelaar niet ontvingen (controleplakjes werden gekweekt in OM). We gebruikten de verdeling van het NFL-signaal in de plakjes als een marker voor neuronale integriteit (Figuur 2B,C). Plakjes bij DEV 7 waren gezond in beide kweekomstandigheden, wat de diffuse verdeling van neurofilament (NFL, in groen) erin vertoonde. Bij DEV 10 leken plakjes gekweekt in GM gezonder te zijn ten opzichte van de controleplakjes gekweekt in OM, zoals gedocumenteerd door NFL-kleuringsverdeling. We hebben ook een schatting gemaakt van het NFL+-gebied (% NFL+-gebied/DAPI+-gebied) van de plakjes die worden weergegeven in de representatieve afbeeldingen van figuur 2B. Het geschatte NFL+-gebied wordt weergegeven in de histogrammen in figuur 2C, wat bevestigt dat het NFL-signaal onder beide omstandigheden diffuus wordt verdeeld in de plakjes bij DEV 7. Bij DEV 10 neemt het geschatte gebied dat door NFL-kleuring wordt bedekt, echter af voor de OM-kweekconditie.
Deze gegevens suggereren dat het overschakelen op de GM bij DEV 3 goed wordt verdragen voor langdurige teelt van SC-plakjes (DEV 10). Als volgende stap hebben we GM getest op langere tijdstippen: DEV 30, DEV 60 en DEV 90. Zoals te zien is in figuur 3A,B, werden plakjes gezond in cultuur gehouden tot DEV 90. NFL-kleuring werd op elk tijdstip op grote schaal aanwezig gevonden in de plakjes, met diffuse ontkieming rond de plakjes neurieten die uit het centrale gebied vertrokken. We hebben inderdaad het NFL+-gebied van de plakjes in figuur 3A geschat en dit is in de loop van de tijd toegenomen, zoals weergegeven in de histogrammen van figuur 3B. We zagen ook positiviteit ten opzichte van de neuronale marker RBFOX3, wat een ander bewijs levert van de neuronale differentiatie van de plakjes. Op elk tijdstip controleerden we ook het apoptosepercentage door in verschillende plakjes het aantal cellen positief voor aCASP3 te evalueren (Figuur 4A,B). De analyse werd uitgevoerd zoals beschreven in protocolparagraaf 10.2. Het apoptotische percentage (% aCASP3+-cellen/totaal aantal DAPI+-cellen) bleek op elk tijdstip zeer laag te zijn (0,85 ± 0,52%, 0,71 ± 0,27%, 0,66 ± 0,45% voor respectievelijk DEV 30, 60 en 90) zonder significante verschillen tussen de drie beschouwde tijdstippen (p-waarde > 0,05, figuur 4B). Deze gegevens suggereren dat de apoptotische snelheid geassocieerd met aCASP3 gedurende de tijd stabiel blijft en, samen met de brede verdeling van NFL in de plakjes (Figuur 4A), de overleving van de plakjes op elk tijdstip bevestigen.
Ter ondersteuning van eerdere gegevens hebben we ook een levend/dood-test uitgevoerd om de levensvatbaarheid van de plakjes op de drie verschillende tijdstippen te evalueren. We gebruikten Calcein (groene kleuring) om de levensvatbare en metabolisch actieve cellen te labelen en Sytox (cyaankleuring) om celdood te beoordelen. Zoals te zien is in de histogrammen in figuur 4C, neemt het percentage metabolisch actieve cellen licht toe van DEV 30 tot DEV 90 (93,17 ± 5,21%, 96,43 ± 3,02%, 96,33 ± 3,10% voor respectievelijk DEV 30, 60 en 90), stabiliserend tussen de laatste twee tijdstippen (DEV 30 versus DEV 60 p-waarde = 0,018; DEV 30 versus DEV 90 p-waarde = 0.027; DEV 60 vs DEV 90 p-waarde = 0.99). We vonden lage niveaus van celdood die in de loop van de tijd afnamen (6,83 ± 5,21%, 3,57 ± 3,02%, 3,66 ± 3,10% voor respectievelijk DEV 30, 60 en 90) en er werd een significant verschil gevonden tussen DEV 30 en latere tijdstippen, DEV 60 en DEV 90 (DEV 30 versus DEV 60 p-waarde = 0,018; DEV 30 versus DEV 90 p-waarde = 0.027; DEV 60 vs DEV 90 p-waarde = 0.99). Deze gegevens, in combinatie met het apoptosepercentage, bevestigen de overleving van plakjes in de loop van de tijd en ondersteunen de effectiviteit van het uitgevoerde kweekprotocol op lange termijn.
Toen de haalbaarheid van langdurige kweek van de SC-plakjes eenmaal was vastgesteld, daagden we het systeem uit door transplantatie van h-SC-NES-cellen in de eerste stadia van neuronale differentiatie. We hebben de h-SC-NES-cellen getest omdat ze veelbelovende resultaten hebben laten zien voor SCI-behandeling12. De transplantatieprocedure van h-SC-NES-cellen in de SC-plakjes van de muis wordt beschreven in protocolsectie 6. De SC-plakjes en getransplanteerde h-SC-NES-cellen werden bewaard tot DPT 30. Cellen werden geënt bij DIV 10 van differentiatie (neurale voorloperfase) in DEV 4 organotypische plakjes, zoals weergegeven in het protocolschema van figuur 5A. Getransplanteerde cellen werden tot 30 dagen gecontroleerd op de expressie van GFP in cultuur. Figuur 5B toont representatieve live-beelden, bij verschillende DPT's, van een SC-plak met getransplanteerde GFP+- cellen. De stabiele expressie van GFP in de loop van de tijd (Figuur 5B en Figuur 6A) suggereert dat cellen in het SC-weefsel overleefden in de eerder geoptimaliseerde kweekomstandigheden. We controleerden ook de apoptotische snelheid van getransplanteerde cellen zoals beschreven in protocolsectie 10.2. De apoptotische snelheid (% aCASP3+- cellen/totaal aantal Hu-Nu+ -cellen) bleek zeer laag te zijn (0,44 ± 0,34%) na 30 DPT (figuur 6B). Bovendien bleek de apoptotische snelheid bij DPT 30 in lijn te zijn met die gevonden voor hetzelfde type cellen bij DPT 7, zoals eerder gerapporteerd40, wat documenteert dat de culturen in de loop van de tijd stabiliseren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig01.jpg"> Figuur 1: Workflow van het protocol. Representatief schema dat de algemene workflow van het uitgevoerde protocol weergeeft. (A) Aan de linkerkant een schema met een samenvatting van het genereren van SC-plakjes van muizen uit geïsoleerde SC van muizenpups op P3 en het langdurig kweken van SC-organotypische plakjes. (B) Aan de rechterkant, een schema dat de transplantatie samenvat van h-SC-NES-cellen die GFP tot expressie brengen in SC-organotypische plakjes van muizen. Getransplanteerde cellen worden gedurende 30 dagen na de transplantatie bewaard. Afkortingen: h-SC-NES = van het menselijk ruggenmerg afgeleide neuro-epitheliale stam; GFP = groen fluorescerend eiwit; DEV = dag ex vivo; DPT = dag na transplantatie; NFL = neurofilament lichte keten; RBFOX3= RNA-bindende fox-1 homoloog 3; aCASP3 = actieve Caspase-3; SC= ruggenmerg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig02v2.jpg"> Figuur 2: Optimalisatie van de teeltomstandigheden op lange termijn. (A) Representatief schema van het protocol voor het testen van OM en GM. OM wordt gehandhaafd tot DEV 7-10 voor de controlegroep. Het medium wordt overgeschakeld naar de GM bij DEV 3 voor de behandelde plakjes; vervolgens worden ze vastgesteld op DEV 7-10 voor vergelijking met controles. (B) Representatieve beelden waarin de organotypische plakjes SC van muizen bij DEV 7 en 10 worden vergeleken die onder verschillende omstandigheden zijn gekweekt. Plakjes worden gekleurd voor de cytoskeletmarker neurofilament (NFL, groen). De brede verdeling van NFL-kleuring in plakjes gekweekt met GM suggereert een algehele overleving en differentiatie. Kernen worden tegengekleurd met DAPI. Schaalbalk = 500 μm. (C) Representatieve histogrammen van de schatting van het door NFL bestreken gebied in de segmenten weergegeven in figuur 1B. Bij DEV 10 neemt het NFL-oppervlak af in de OM-kweekconditie. Afkortingen: DEV = dag ex vivo; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylinde; NFL = neurofilament lichte keten.; OM = organotypisch medium; GM = transplantaatmedium; SC = ruggenmerg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig03v3.jpg"> Figuur 3: Langdurig gekweekte SC van muizen organotypische plakjes. (A) Plakjes worden in cultuur gehouden tot DEV 90. Immunofluorescentietest onthult een brede verdeling van de cytoskeletale marker neurofilament (NFL, groen) en de nucleaire neuronale marker RBFOX3 (rood), wat getuigt van hun gezonde toestand en neuronale identiteit na langdurige kweek. Merk op dat NFL+- axonen na verloop van tijd diffuus rond de plakjes ontkiemen. Kernen worden tegengekleurd met DAPI. Schaalbalk = 500 μm. (B) Representatieve histogrammen van de schatting van het NFL+- gebied en de tijd en, RBFOX3+- gebied van de plakjes weergegeven in paneel A. Het NFL+ neurietgebied neemt in de loop van de tijd toe. Afkortingen: DEV = dag ex vivo; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylinde; NFL = neurofilament lichte keten; SC = ruggenmerg; RBFOX3= RNA-bindende fox-1 homoloog 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig04.jpg"> Figuur 4: Evaluatie van de levensvatbaarheid van cellen in de SC-plakjes in de loop van de tijd. (A) Representatieve afbeeldingen van organotypische plakjes bij DEV 60 gekleurd voor aCASP3 (rood) en NFL (groen). Schaalbalk = 100 μm. NFL vertoont een diffuus patroon. Zeldzame cellen zijn positief voor de apoptotische marker aCASP3 (inzetstukken: 1-2-3). (B) Analyse van het apoptosepercentage in plakjes op verschillende tijdstippen. Gemiddelde ± SD, N (replicaten) = 6 plakjes, n (totaal aantal cellen) > 1.000 voor elke plak, Kruskal-Wallis-test, meervoudige vergelijking, p-waarde > 0,05. De apoptotische snelheid is stabiel in de tijd. In de inzet 1-2-3 van paneel A is het mogelijk om details van cellen die positief zijn voor aCASP3 (rode kleuring, witte pijlen) waar te nemen. Kleine rode stippen labelen celresten en pyknotische kernen. Schaalbalk = 50 μm. (C) Representatieve beelden van levende/dode test uitgevoerd op SC-plakjes bij DEV 90: metabolisch actieve cellen worden groen gelabeld met Calceïne, terwijl dode en beschadigde cellen worden gelabeld in lichtblauw (cyaan) met Sytox. De twee histogrammen tonen het % cellen dat positief is voor Calceïne (links) en Sytox (rechts) op het totale aantal cellen. Voor beide gemiddelde ± SD geldt dat N (replicaten) = 6 plakjes, n (totaal aantal cellen) > 1.000 voor elk plakje, Kruskal-Wallis-test, meervoudige vergelijking, DEV 30 versus DEV 60 p-waarde = 0,018; DEV 30 versus DEV 90 p-waarde = 0.027; DEV 60 vs DEV 90 p-waarde > 0.99. Afkortingen: DEV = dag ex vivo; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylinde; NFL = neurofilament lichte keten; SC = ruggenmerg; aCASP3 = actieve caspase-3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig05.jpg"> Figuur 5: h-SC-NES celtransplantatie in organotypische plakjes van muizen. (A) Representatief schema van het transplantatieprotocol. Cellen worden getransplanteerd als neurale voorlopers bij DIV 10 van differentiatie in DEV 4 organotypische plakjes. (B) Representatieve beelden van organotypische plakjes van muizen die in de loop van de tijd tot DPT 30 zijn getransplanteerd met h-SC-NES-cellen die GFP tot expressie brengen. Cellen worden getransduceerd met een lentivirale vector die het GFP-gen draagt. GFP-expressie in de loop van de tijd bevestigt hun levensvatbaarheid en aanpassing aan de slice-omgeving. Schaal balk = 500 μm. Afkortingen: DIV = eerste dag in pre-differentiatie; h-SC-NES = van het menselijk ruggenmerg afgeleide neuro-epitheliale stam; GFP = groen fluorescerend eiwit; DEV = dag ex vivo; OM = organotypisch medium; GM = transplantaatmedium; DPT = dagen na transplantatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig06.jpg"> Figuur 6: Evaluatie van de apoptosesnelheid van getransplanteerde h-SC-NES-cellen na 30 dagen na transplantatie. (A) Representatief beeld van een organotypische plak van een muis die is getransplanteerd met h-SC-NES-cellen die GFP tot expressie brengen. Cellen worden getransduceerd met een lentivirale vector die het GFP-gen draagt om ze na transplantatie in de plakjes te controleren. GFP-expressie in de loop van de tijd bevestigt hun levensvatbaarheid en aanpassing aan de slice-omgeving. Het getoonde tijdstip is DPT 30; cellen worden gekleurd voor menselijke kernen (cyaan) en aCASP3 (rood). Schaalbalk = 150 μm. (B) Aan de linkerkant, representatief cirkeldiagram van de apoptose-analyse van cellen die in plakjes zijn getransplanteerd bij DPT 30 (N (replicaten) = 5 plakjes, n (cellen) = 5.000), en aan de rechterkant een inzet van Hu-Nu+- cellen en een detail van een cel die positief is voor aCASP3 (witte pijl). Schaal balk = 75 μm. Kleine rode stippen labelen celresten en pyknotische kernen. Afkortingen: h-SC-NES = van het menselijk ruggenmerg afgeleide neuro-epitheliale stam; GFP = groen fluorescerend eiwit; DPT = dag na transplantatie; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylinde; NFL = neurofilament lichte keten; aCASP3 = actieve caspase-3; Hu-Nu = menselijke kernen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Tabel 1: Samenstelling van de in dit protocol gebruikte oplossingen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704_Tables%20of%20Solutions%20rev.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>

In dit artikel bieden we een reproduceerbare methode om organotypische plakjes ruggenmerg te genereren en te onderhouden die zijn getransplanteerd met neurale stamcellen als een ex vivo-model voor het testen van cellulaire vervangingstherapieën.

Organotypische plakcultuur van het ruggenmerg van muizen als platform voor het valideren van celtransplantatie bij ruggenmergletsel

Resolutive cures for spinal cord injuries (SCIs) are still lacking, due to the complex pathophysiology. One of the most promising regenerative approaches ...

We zijn geïnteresseerd in het ontwikkelen van een veelbelovende regeneratieve aanpak om ruggenmergletsels aan te pakken. In dit artikel valideren we het organotypische model van het ruggenmerg voor het testen van cellulaire vervangingstherapieën in ruggenmergonderzoek. Tot nu toe worden organotypische modellen van het ruggenmerg twee of drie weken in vitro in cultuur gehouden.En subcultuurmedia zijn suboptimaal voor neurale stamcelimplantatie, differentiatie en rijping. Celvervangende therapieën vereisen nog steeds de verbetering om het vermogen van de getransplanteerde cellen om de verloren circuits te reconstrueren aan te kondigen. Via dit protocol bieden we een nieuw, langdurig ex vivo platform om celtransplantatiegerelateerde problemen aan te pakken, zoals overleving, integratie en rijpingssnelheid van de getransplanteerde neurale stamcellen.Dit platform zal nuttig zijn voor onderzoekers om de beste strategie voor celtransplantatie te vinden, waardoor het aantal dieren dat nodig is voor in vivo validatie wordt verminderd. Ons protocol is eenvoudig, snel en kosteneffectief om proof-of-concept- en optimalisatiestudies uit te voeren.

long-term-mouse-spinal-cord-organotypic-slice-culture-as-platform-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Neurale voorloper transplantatie is een veelbelovende strategie voor de bescherming en / of vervangen van verloren / disfunctionele cervicale diafragma motorische neuronen in het ruggenmerg letsel (SCI) en de motor neuron ziekte, amyotrofe laterale sclerose (ALS). Wij bieden een protocol voor de cel levering aan cervicale ruggenmerg ventrale hoorn in knaagdiermodellen van ALS en SCI.

Intraspinale Cel Transplantatie voor Targeting Cervicale ventrale hoorn van Amyotrofische Lateraal Sclerose en traumatisch ruggenmergletsel

Source: Palma-Tortosa, S., et.al. Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates the transplantation of stem cell-derived neuronal progenitor cells into human cortical tissue slices. The procedure involves isolating and resuspending progenitor cells in a basement membrane matrix, followed by their injection into a cortical slice placed on a transwell assembly. After incubation to allow...

Transplantation of Stem Cell-Derived Neuronal Progenitors into Human Cortical Slices

Slice culturen vergemakkelijken de manipulatie van embryo-ontwikkeling van gen-en farmacologische verstoringen. Wel moet kweekomstandigheden ervoor te zorgen dat de normale ontwikkeling kan gaan binnen de verminderde omgeving van de plak. We tonen een protocol dat normale ontwikkeling ruggenmerg vergemakkelijkt men gedurende ten minste 24 uur.

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Cultuur Protocol

Fibrine matrices bevattende groeifactoren zijn gebruikt om geënte neurale stamcellen behouden in locaties volledig ruggenmerg doorsnijding. Geënte cellen volledig gevuld de laesie holte en gedifferentieerd in meerdere neurale celtypes, waaronder neuronen die axons verlengd gastheer ruggenmerg over lange afstanden.

Bevordering van Survival en differentiatie van neurale stamcellen met fibrine en groeifactor Cocktails na Ernstige Spinal Cord Injury

Een techniek om NG2-cellen en oligodendrocyten te bestuderen met behulp van een slice-kweeksysteem van de voorhersenen en het cerebellum wordt beschreven. Deze methode maakt onderzoek van de dynamica van proliferatie en differentiatie van cellen binnen de oligodendrocytlijn mogelijk, waarbij de extracellulaire omgeving gemakkelijk kan worden gemanipuleerd terwijl de weefselcytoarchitectuur behouden blijft.

Organotypische Slice culturen om te studeren Oligodendrocyte Dynamics en Myelination

Dwarslaesie is een traumatische aandoening die ernstige morbiditeit en hoge sterfte veroorzaakt. In dit werk beschrijven we in detail een kneuzing model van dwarslaesie bij muizen, gevolgd door een transplantatie van neurale stamcellen.

Neurale stamceltransplantatie bij Experimentele Contusive Model van Spinal Cord Injury

Hier presenteren we een protocol dat is gebaseerd op gekweekt ruggemerg segmenten op multi-elektrode arrays functionele regeneratie van propriospinal verbindingen in vitro bestuderen.

Onderzoek van functionele Regeneratie in Organotypische Spinal Cord Co-culturen Grown on Multi-elektrode arrays

Deze studie presenteert een techniek voor de isolatie van neuronen van WT-neonatale muizen. Het vereist de zorgvuldige dissectie van het ruggenmerg van de neonatale muis, gevolgd door de scheiding van neuronen uit het ruggenmergweefsel door mechanische en enzymatische splitsing.

Spinal Cord Neurons Isolatie en Cultuur van Neonatale Muizen

Dit artikel beschrijft een techniek om het invoegen van een holle buis tussen de stronken van de ruggenmerg na volledige transect en vullen met cellen van Schwann (gcv) en injecteerbare kelder membraan matrix bevorderen van axon regeneratie over de kloof te overbruggen.

Transplantatie van Schwann cellen binnen PVDF-TrFE Conduits verbeelde Rat ruggenmerg stronken ter bevordering van de regeneratie van het Axon over de kloof overbruggen

Dit protocol beschrijft organotypische culturen op lange termijn van de volwassen menselijke cortex in combinatie met ex vivo intracorticale transplantatie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide corticale voorlopers, die een nieuwe methodologie presenteren om op stamcellen gebaseerde therapieën voor menselijke neurodegeneratieve aandoeningen verder te testen.

Organotypische culturen van volwassen menselijke cortex als een ex vivo model voor menselijke stamceltransplantatie en validatie

Leer een organotypische ruggenmergcultuur van muizen voor het valideren van celtransplantatie bij ruggenmergletsel. Dit ex vivo model verbetert overleving en integratie van neurale stamcellen.

Organotypische plakcultuur van het ruggenmerg van muizen als platform voor het valideren van celtransplantatie bij ruggenmergletsel (Video) | JoVE Journal

Organotypische plakcultuur van het ruggenmerg van muizen als platform voor het valideren van celtransplantatie bij ruggenmergletsel

Meer video's verkennen