Name: Co-cultuur in vitro-systemen om de kanker-immuniteitscyclus te reproduceren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Leer co-cultuur in vitro-systemen om de kanker-immuniteitscyclus te reproduceren met multiparametrische flowcytometrie. Deze methode biedt een eenvoudige, snelle en betrouwbare aanpak voor het monitoren van kanker-immuuninteracties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A.S. wordt ondersteund door AIRC (IG #28807) en door PRIN (#P2022YE2MX). M.M. wordt ondersteund door de AIRC-FIRC fellowship (#25558). A.D.N. wordt ondersteund door het Innovation Ecosystem Rome Technopole ECS00000024 gefinancierd door de EU - Next Generation EU, PNRR Mission 4 Component 2 Investment 1.5.

Op flowcytometrie gebaseerde monitoring van de kankerimmuniteitscyclus 

<ol><li>Chen, D. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncology+meets+immunology%3A+the+cancer-immunity+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle.</a> Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).</li>
<li>Mellman, I., Chen, D. S., Powles, T., Turley, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cancer-immunity+cycle%3A+Indication%2C+genotype%2C+and+immunotype%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The cancer-immunity cycle: Indication, genotype, and immunotype.</a> Immunity. 56 (10), 2188-2205 (2023).</li>
<li>Galassi, C., Musella, M., Manduca, N., Maccafeo, E., Sistigu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+privilege+of+cancer+stem+cells%3A+A+key+to+understanding+tumor+immune+escape+and+therapy+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The immune privilege of cancer stem cells: A key to understanding tumor immune escape and therapy failure.</a> Cells. 10 (9), 2361(2021).</li>
<li>Dunn, G. P., Old, L. J., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three+Es+of+cancer+immunoediting%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The three Es of cancer immunoediting.</a> Annu Rev Immunol. 22, 329-360 (2004).</li>
<li>Musella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+IFNs+promote+cancer+cell+stemness+by+triggering+the+epigenetic+regulator+KDM1B%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immun%22%5BJournal%5D)">Type I IFNs promote cancer cell stemness by triggering the epigenetic regulator KDM1B.</a> Nat Immun. 23 (9), 1379-1392 (2022).</li>
<li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+immune+resistance+archetypes+in+solid+cancer+to+inform+next-generation+anticancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Leveraging immune resistance archetypes in solid cancer to inform next-generation anticancer therapies.</a> J Immunother Cancer. 11 (6), e006533(2023).</li>
<li>Sharma, P., Hu-Lieskovan, S., Wargo, J. A., Ribas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary%2C+adaptive%2C+and+acquired+resistance+to+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Primary, adaptive, and acquired resistance to cancer immunotherapy.</a> Cell. 168 (4), 707-723 (2017).</li>
<li>Musella, M., Manduca, N., Maccafeo, E., Ruggiero, E., Sistigu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+evaluation+of+cancer+cell+immunogenicity+and+antigen-specific+T-cell+cytotoxicity+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro evaluation of cancer cell immunogenicity and antigen-specific T-cell cytotoxicity by flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 2748, 13-28 (2024).</li>
<li>Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+spectrum+flow+cytometry+as+a+powerful+technology+for+cancer+immunotherapy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research.</a> Front Mol Biosci. 7, 612801(2020).</li>
<li>Danova, M., Torchio, M., Comolli, G., Sbrana, A., Antonuzzo, A., Mazzini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+automated+cytometry+in+the+new+era+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">The role of automated cytometry in the new era of cancer immunotherapy.</a> Mol Clin Oncol. 9 (4), 355-361 (2018).</li>
<li>Laskowski, T. J., Hazen, A. L., Collazo, R. S., Haviland, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rigor+and+reproducibility+of+cytometry+practices+for+immuno-oncology%3A+A+multifaceted+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Rigor and reproducibility of cytometry practices for immuno-oncology: A multifaceted challenge.</a> Cytometry A. 97 (2), 116-125 (2020).</li>
<li>Manduca, N., Maccafeo, E., De Maria, R., Sistigu, A., Musella, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cancer+models%3A+One+step+closer+to+in+vitro+human+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">3D cancer models: One step closer to in vitro human studies.</a> Front Immunol. 14, 1175503(2023).</li>
<li>De Ninno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+co-culture+models+for+dissecting+the+immune+response+in+in+vitro+tumor+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Microfluidic co-culture models for dissecting the immune response in in vitro tumor microenvironments.</a> JoVE. (170), e61895(2021).</li>
<li>Mattei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncoimmunology+meets+organs-on-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Oncoimmunology meets organs-on-chip.</a> Front Mol Biosci. 8, 627454(2021).</li>
<li>Businaro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross+talk+between+cancer+and+immune+cells%3A+exploring+complex+dynamics+in+a+microfluidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Cross talk between cancer and immune cells: exploring complex dynamics in a microfluidic environment.</a> Lab Chip. 13 (2), 229-239 (2013).</li>
<li>Vacchelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy-induced+antitumor+immunity+requires+formyl+peptide+receptor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy-induced antitumor immunity requires formyl peptide receptor 1.</a> Science. 350 (6263), 972-978 (2015).</li>
<li>Maulana, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocompetent+cancer-on-chip+models+to+assess+immuno-oncology+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Immunocompetent cancer-on-chip models to assess immuno-oncology therapy.</a> Adv Drug Deliv Rev. 173, 281-305 (2021).</li>
<li>Lorenzi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+IFNs+control+antigen+retention+and+survival+of+CD8%CE%B1%28%2B%29+dendritic+cells+after+uptake+of+tumor+apoptotic+cells+leading+to+cross-priming%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immun%22%5BJournal%5D)">Type I IFNs control antigen retention and survival of CD8α(+) dendritic cells after uptake of tumor apoptotic cells leading to cross-priming.</a> J Immun. 186 (9), 5142-5150 (2011).</li>
<li>Musella, M., Manic, G., Galassi, C., Vitale, I., Sistigu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytofluorometric+assessment+of+dendritic+cell-mediated+uptake+of+cancer+cell+apoptotic+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Cytofluorometric assessment of dendritic cell-mediated uptake of cancer cell apoptotic bodies.</a> Methods Enzymol. 632, 39-54 (2020).</li>
<li>Lucarini, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+Type+I+Interferons+and+5-Aza-2%27-Deoxycitidine+to+improve+antitumor+response+against+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Combining Type I Interferons and 5-Aza-2'-Deoxycitidine to improve antitumor response against melanoma.</a> J Invest Dermatol. 137 (1), 159-169 (2017).</li>
<li>Gutiérrez-Martínez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+of+cell-associated+antigens+by+MHC+Class+I+in+dendritic+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation of cell-associated antigens by MHC Class I in dendritic cell subsets.</a> Front Immunol. 6, 363(2015).</li>
<li>Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation by dendritic cells.</a> Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).</li>
<li>Hegde, P. S., Karanikas, V., Evers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+where%2C+the+when%2C+and+the+how+of+immune+monitoring+for+cancer+immunotherapies+in+the+era+of+checkpoint+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The where, the when, and the how of immune monitoring for cancer immunotherapies in the era of checkpoint inhibition.</a> Clin Cancer Res. 22 (8), 1865-1874 (2016).</li>
<li>Lee, R. Y., Ng, C. W., Rajapakse, M. P., Ang, N., Yeong, J. P. S., Lau, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+and+challenge+of+spatial+omics+in+dissecting+tumour+microenvironment+and+the+role+of+AI%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">The promise and challenge of spatial omics in dissecting tumour microenvironment and the role of AI.</a> Front Oncol. 13, 1172314(2023).</li>
<li>Lewis, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+omics+and+multiplexed+imaging+to+explore+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology.</a> Nat Methods. 18 (9), 997-1012 (2021).</li>
<li>Wu, Y., Cheng, Y., Wang, X., Fan, J., Gao, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+omics%3A+Navigating+to+the+golden+era+of+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Spatial omics: Navigating to the golden era of cancer research.</a> Clin Transl Med. 12 (1), 696(2022).</li>
<li>Vandereyken, K., Sifrim, A., Thienpont, B., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+applications+for+single-cell+and+spatial+multi-omics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Methods and applications for single-cell and spatial multi-omics.</a> Nat Rev Genet. 24 (8), 494-515 (2023).</li>
<li>Cheung, M., Campbell, J. J., Whitby, L., Thomas, R. J., Braybrook, J., Petzing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+trends+in+flow+cytometry+automated+data+analysis+software%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Current trends in flow cytometry automated data analysis software.</a> Cytometry A. 99 (10), 1007-1021 (2021).</li>
<li>Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillère, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+in+oncoimmunology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mouse models in oncoimmunology.</a> Nat Rev Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Het monitoren van de immuunrespons tegen kanker is van het grootste belang om de ingewikkelde moleculaire en cellulaire wisselwerkingen die in de TME werken en een constante strijd om de suprematie ondersteunen, op te helderen en te begrijpen. Hier beschrijven we een eenvoudig mFC- en ToC-ondersteund protocol voor de monitoring en karakterisering van de stappen die de kankerimmuniteitscyclus vormen. Met kleine variaties kan dit protocol, gebaseerd op muizencellijnen en van muizen afgeleide immuuncellen, worden aangepast aan zowel menselijke onsterfelijke als zelfs primaire kankerlijnen en menselijke perifere bloed-afgeleide immuuncellen. Bovendien maakt dit protocol, door de combinatie van genetische of farmacologische remming van specifieke routes en hun verwante controles, de identificatie mogelijk van biomarkers die immunosurveillance reguleren en dus de respons op immunogene- en immuuntherapieën.
mFC maakt high-throughput analyse van diverse immuunparameters mogelijk en combineert het vermogen om miljoenen cellen in korte tijd te analyseren met de mogelijkheid om zeldzame gebeurtenissen te identificeren, celproliferatie en celdood te evalueren, meerdere parameters tegelijk te detecteren in een klein aantal monsters en maakt het mogelijk om stroomafwaartse moleculaire en functionele analyses uit te voeren post-fluorescentie-gebaseerde celsortering9. Deze functies, samen met de lage kosten, hebben de toegankelijkheid van mFC en breed gebruik in onderzoeks- en klinische laboratoria bevorderd. Toch blijven er enkele belangrijke beperkingen over. Ten eerste vereist mFC-analyse weefseldissociatie om eencellige suspensies te verkrijgen tijdens de monstervoorbereiding, waardoor de ruimtelijke informatie van het tumorweefsel wordt vernietigd. De komst van ruimtelijke technologieën in het afgelopen decennium, waaronder high-plex spatial transcriptomic, proteomic en epigenomic, heeft ons vermogen om de TME te profileren uitgebreid door de positie van kanker-, immuun- en stromale cellen en hun onderlinge interacties te analyseren24. Ten tweede maakt mFC de detectie van maximaal zestien (of zo) parameters tegelijk mogelijk en dekt het dus niet alle celidentificatie-, rijpings- en activeringsstatusmarkers in een enkel monster. Nogmaals, de geavanceerde technologieën hierboven maken de detectie van maximaal honderd parameters tegelijkertijd mogelijk bij een resolutie van één cel en zelfs een subcellulaire resolutie, zoals zelfs vóór 25,26,27. Ten derde vereist immuunmonitoring van longitudinale en vergelijkende studies reproduceerbare protocollen en de standaardisatie van elke stap van de workflow, inclusief gegevensverzameling en -analyse. Conventionele handmatige poorten kunnen subjectief zijn en het onderhoud en de kwaliteitscontroles van instrumenten kunnen variëren, wat van invloed is op datamining en interpretatie. Geautomatiseerde acquisitie en plug-ins die gegevensanalyse implementeren, helpen de gegevensvariabiliteit te minimaliseren28.
ToC's krijgen enorm veel aandacht in kankeronderzoek vanwege hun vermogen om verschillende kenmerken van de TME nauwkeurig te repliceren en, althans in sommige experimentele omgevingen, in vivo tumoren tevervangen. Hoewel ze een vrij realistisch model bieden van de tumorweefselarchitectuur, de meercellige complexiteit en de dynamische wisselwerking tussen de cellulaire componenten van de TME, zijn de ToC's nog steeds niet in staat om dierstudies volledig te vervangen in termen van het weerspiegelen van de complexiteit van systemische immuunresponsen, met name de reeks mechanismen die verantwoordelijk zijn voor het ontstaan van snelheidsbeperkende stappen voor elk van de stappen van de kankerimmuniteitscyclus12, 29. okt. Afgezien van dit aspect zal het gebied van de onco-immunologie blijven profiteren en profiteren van het gebruik van ToC's, aangezien ze door de rondes en de snelheid van wetenschappelijke innovatie steeds dichter bij in vivo modellen komen te staan12.
Concluderend kan worden gesteld dat het hier beschreven protocol dient als een krachtig en eenvoudig analyse- en ontdekkingsinstrument om de dynamische complexiteit van de TME te ontrafelen. Ook maken de tijd- en kostengerelateerde kenmerken van dit protocol de haalbaarheid op grote schaal mogelijk. De uitdaging die voor ons ligt, is om het te standaardiseren voor klinisch gebruik om therapiebeslissingen voor kankerpatiënten beter te informeren en te begeleiden.

In de afgelopen decennia heeft immunotherapie een voortrekkersrol gespeeld bij geavanceerde opties voor de behandeling van kanker. Het benutten van het immuunsysteem met antitumordoeleinden heeft een krachtig proof-of-concept opgeleverd voor het voordeel van de patiënt bij diverse hematologische en solide maligniteiten met historisch slechte prognoses. Omdat immunotherapie een kans biedt voor anders moeilijk te behandelen kankers, ervaart het een verbazingwekkend snelle vooruitgang. Een dergelijke vooruitgang kan, althans gedeeltelijk, worden toegeschreven aan het verfijnde begrip van de wisselwerking tussen kankercellen en immuuncellen. Dit samenspel lijkt op een feed-forward "motor" die het immuunsysteem ontsteekt om kankercellen te vernietigen, de zogenaamde kanker-immuniteitscyclus. Deze immuunrespons tegen kanker verloopt op drie hoofdniveaus: herkenning, verwerking en reactie. Ten eerste worden in de fase van herkenning tumorantigenen (Ags) die tijdens tumorvorming worden geproduceerd, vrijgegeven door stervende kankercellen in de tumormicro-omgeving (TME, stap 1) en opgeslokt door tumor-infiltrerende dendritische cellen (DC's, stap 2). Vervolgens, in de fase van verwerking, presenteren DC's de epitopen van de gevangen tumor Ags via de belangrijkste histocompatibiliteitscomplex (MHC) moleculen, brengen ze op hun oppervlak hogere niveaus van costimulatoire moleculen tot expressie (stap 3) en verplaatsen ze zich naar tumordrainerende lymfeklieren (dLN's) om hun lading te presenteren aan naïeve CD8 T-cellen (CD8N, stap 4). Al deze stappen komen samen in het uiteindelijke reactieproces waarbij tumor Ag-specifieke cross-primed CD8 T-cellen (CD8C-P) worden geactiveerd, rijpen tot effector CD8 T (CD8E) cellen en een klonale expansie ondergaan (stap 5). CD8E-cellen verlaten vervolgens de dLN's en gaan via het bloed naar huis naar de TME (stap 6) waar ze specifiek kankercellen herkennen en eraan binden door de interactie tussen hun T-celreceptor (TCR) en hun verwante tumor Ags, cytotoxische moleculen afgeven [d.w.z. interferon (IFN)-γ, perforinen en granzymen (Grzs)] en kankercellen doden (stap 7)1, 2. okt. Het doden van kankercellen leidt tot het vrijkomen van verdere tumor-Ags om de kanker-immuniteitscyclus aan te wakkeren. In feite vernietigt en stoot het immuunsysteem door al deze stappen kankercellen veel vaker af dan wordt verondersteld. Bij kankerpatiënten werkt echter ten minste één van deze stappen niet goed. Wij en anderen toonden aan dat kankercellen de immuunrespons proberen te vertragen door ofwel te evolueren naar agressievere en immuunbevoorrechte varianten 3,4,5 of de effectiviteit van T-cellen te belemmeren 6,7.
Kankeronderzoek en de ontwikkeling van kankergeneesmiddelen zijn beide gebaseerd op experimentele modellen die het mogelijk maken om de relatie tussen kanker en immuuncellen te bestuderen, de zogenaamde onco-immunologie. Hier worden snelle, betrouwbare, reproduceerbare en goedkope in-vitromodellen beschreven die elke stap van de onco-immunologiecyclus uitgebreid reproduceren en een snel en duidelijk beeld krijgen van de fenotypische en functionele functiesets van immunosurveillance en uiteindelijk immunobewerking.
Multiparametrische flowcytometrie (mFC) is een van de meest succesvolle analyse-instrumenten voor eencellige cellen in fundamenteel kankeronderzoek, diagnose en translationeel onderzoek in klinische onderzoeken naar kanker. Omdat het mogelijk is om tegelijkertijd meer kenmerken in elke cel vast te leggen, heeft mFC zijn plaats verdiend als een gouden standaard analyseplatform in de onco-immunologie. Het koppelt hoge sensitiviteit en specificiteit aan de mogelijkheid om snel en reproduceerbaar meerdere eiwitexpressiepatronen en functionele eigenschappen op enkelvoudig celniveau te meten uit heterogene en zelfs heterotypische celsuspensiesies, zoals die van de TME 8,9,10. Aangezien zowel fenotypische als functionele expressiepatronen tijdgevoelig zijn, is zorgvuldige aandacht voor het ontwerp van het experiment, de selectie van geschikte panels, controles en titred antilichamen, en voor het juiste gebruik van monsters en instrumentatie van cruciaal belang voor de betrouwbaarheid, vergelijkbaarheid en reproduceerbaarheid van de resultaten en om de uitkomst van het experiment met vertrouwen te interpreteren11.
Tumor-on-a-chip microfluïdische apparaten (ToC's) modelleren de TME door in vitro biomimetica op microschaal van de dynamiek en interactie tussen kanker en immuuncellen mogelijk te maken 12,13,14,15. In het bijzonder zijn ToC's meerkanaals microfluïdische celcultuurapparaten die in staat zijn om verschillende celtypen te hosten die zijn georganiseerd in tweedimensionale (2D) of driedimensionale (3D) kweekinstellingen en die in staat zijn om met hoge getrouwheid te modelleren en met hoge precisie belangrijke structurele en functionele eenheden te controleren, zoals heterotypische cellulaire interacties en stromen van chemische gradiënten die fysiologisch voorkomen in de TME12, 13,14,15. Met name immuunchemo-aantrekkingskracht en -trajecten, evenals de interactie van immuuncellen met kankercellen, kunnen in realtime worden gecontroleerd en gekwantificeerd door time-lapse-microscopie en geautomatiseerde trackinganalyse 5,12,13,14,15,16. Bovendien bieden ToC's de mogelijkheid om cruciale processen die het ontstaan en de progressie van kanker en de respons op therapie reguleren, zowel te analyseren als te manipuleren17.
In dit artikel worden mFC met ToC's gecombineerd om alle niveaus van de antikanker-immuunrespons te bestuderen die door DC-gemedieerde fagocytose van kanker-Ags gaat (stappen 1-3), T-cel cross-priming (stap 4), activering en klonale expansie (de laatste door middel van 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) en Cu(I)-gekatalyseerde cycloadditie [klik] technologie, een zeer gevoelige en nauwkeurige methodologie, stap 5), CD8E-cel homing naar de TME (stap 6) en ten slotte CD8 E-cel-gemedieerde kankerceldoding (stap 7, figuur 1).
Dit werk draagt bij aan de inspanningen om eenvoudige, snelle en betrouwbare standaardprotocollen op te stellen om de kankerimmuniteitscyclus te bestuderen. De verbetering en integratie van mFC- en ToC-modellen in kankeronderzoek, TME-dynamiek en respons op therapie hebben een groot potentieel, aangezien deze modellen biologische getrouwheid bieden samen met experimentele controle. Daarom helpt dit protocol om de kanker-immuniteitscyclus stapsgewijs na te bootsen door het mogelijk te maken om de rollen van individuele celspelers en hun wederzijdse interacties bij natuurlijke en verworven immunosurveillance te karakteriseren, te monitoren en tijdig te manoeuvreren. Dit zal uiteindelijk helpen bij het verfijnen, verminderen en vervangen van dierstudies, terwijl het cruciale inzichten biedt om tumoren te slim af te zijn en de klinische zorg te sturen. Ten slotte worden de voordelen en beperkingen van mFC en ToC kritisch besproken en vergeleken met state-of-the-art technologieën (bijv. High Plex ruimtelijke analyses met enkelvoudige cel en zelfs subcellulaire resolutie) om onco-immunologisch onderzoek en therapie vooruit te helpen.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL microtubes&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>100 kV e-beam litography</td><td>Vistec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petri dishes&nbsp;</td><td>Greiner Bio One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>12-well plates</td><td>Euroclone</td><td>&nbsp;ET3012</td><td></td></tr><tr><td>15 and 50 mL tubes</td><td>Corning&nbsp;</td><td>352096; 352070</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu;m cell strainer&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>CLS431750</td><td></td></tr><tr><td>5 mL polystyrene tubes&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>120180</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu;m cell strainer&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>CLS431751</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 cell culture treated flask</td><td>Euroclone</td><td>&nbsp;ET7076</td><td></td></tr><tr><td>Adsorbent wipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allumin foil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse CD107a (LAMP-1) Antibody</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-111-319</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse CD25 (7D4) Antibody&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-118-678</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse CD3 (17A2) Antibody</td><td>BioLegend</td><td>100206</td><td></td></tr><tr><td>Aptes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555028</td><td></td></tr><tr><td>BD GolgiPlug Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A)</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>BD GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)</td><td>BD Biosciences</td><td>554724</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>US Biological, Salem</td><td>A1312</td><td></td></tr><tr><td>CD11c Monoclonal Antibody (N418)</td><td>eBioscience</td><td>12-0114-81</td><td></td></tr><tr><td>CD137 (4-1BB) Monoclonal Antibody (17B5)</td><td>eBioscience</td><td>17-1371-82</td><td></td></tr><tr><td>CD3 Monoclonal Antibody (17A2)</td><td>eBioscience</td><td>25-0032-82</td><td></td></tr><tr><td>CD44 Monoclonal Antibody (IM7)</td><td>eBioscience</td><td>11-0441-82</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)</td><td>Invitrogen</td><td>MCD4528</td><td></td></tr><tr><td>CD69 Monoclonal Antibody (H1.2F3)</td><td>eBioscience</td><td>48-0691-82</td><td></td></tr><tr><td>CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7)</td><td>eBioscience</td><td>11-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7)</td><td>eBioscience</td><td>17-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>CD95 (APO-1/Fas) Monoclonal Antibody (15A7)</td><td>eBioscience</td><td>53-0951-82</td><td></td></tr><tr><td>Cell counting slides</td><td>Kova International</td><td>87144E</td><td></td></tr><tr><td>Chromium quartz masks</td><td>MB W&amp;A, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>C10635</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX Flow Cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dead Cell Removal Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS)</td><td>EuroClone</td><td>ECB4053L</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>EuroClone</td><td>ECS0180L</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo v10.0.7</td><td>Flowjo, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Granzyme B Monoclonal Antibody (NGZB)</td><td>eBioscience</td><td>12-8898-82</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hotplate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humified cell culture incubator (37&deg;, 5% CO2)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ice machine</td><td>Brema Ice Makers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IFN gamma Monoclonal Antibody (XMG1.2)</td><td>eBioscience</td><td>11-7311-82</td><td></td></tr><tr><td>Illustrator CC 2015</td><td>Adobe Systems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incucyte 2022A Software</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incucyte Cytotox Dye for Counting Dead Cells</td><td>Sartorius</td><td>4632</td><td></td></tr><tr><td>Incucyte SX5 Live-Cell Analysis System&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JuLi Smart Fluorescent Live Cell Imaging Microscope</td><td>Bulldog Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laboratory bench</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laboratory refrigerator (4&deg;C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laboratory Safety Cabinet (Class II)</td><td>Angelantoni</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine 200 mM</td><td>EuroClone</td><td>ECB3004D</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>MACS columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201; 130-042-401&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MACS separators</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-10; 130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MCA205 mouse fibrosarcoma cell line</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCC173</td><td></td></tr><tr><td>Microbiologically controlled animal facility equipped with Class II safety cabine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroCL 21R Microcentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002552</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel&nbsp;</td><td>Microsoft, Redmond&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse: C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Naive CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-543</td><td></td></tr><tr><td>Nikon ECLIPSE Ts2</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements BR 5.30.0064-BIT</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optical litography</td><td>EVG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G sodium salt and streptomycin sulfate</td><td>EuroClone</td><td>ECB3001D/1</td><td></td></tr><tr><td>Pipet aid</td><td>Drummond Scientific Co., Broomall, PA</td><td>&nbsp;4-000-2

co-cultuur in vitro-systemen om de kanker-immuniteitscyclus te reproduceren

Co-Culture In Vitro Systems to Reproduce the Cancer-Immunity Cycle

Fundamenteel kankeronderzoek en de ontwikkeling van effectieve tegenaanvaltherapieën zijn beide gebaseerd op experimentele studies die de interacties tussen kanker en immuuncellen beschrijven, de zogenaamde kanker-immuniteitscyclus. In vitro co-cultuursystemen in combinatie met multiparametrische flowcytometrie (mFC) en tumor-on-a-chip microfluïdische apparaten (ToC's) maken eenvoudige, snelle en betrouwbare monitoring en karakterisering van elke stap van de kankerimmuniteitscyclus mogelijk en leiden tot de identificatie van de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor het doorslaan van de balans tussen immunosurveillance van kanker en immunoontwijking. Een grondig begrip van de dynamische wisselwerking tussen kanker en immuuncellen biedt cruciale inzichten om tumoren te slim af te zijn en zal het tempo van therapeutische personalisatie en optimalisatie bij patiënten versnellen. In het bijzonder beschrijven we hier een eenvoudig mFC- en ToC-ondersteund protocol voor het ontrafelen van de dynamische complexiteit van elke stap van de kankerimmuniteitscyclus in muizenkankercellijnen en van muizen afgeleide immuuncellen en richten we ons op immunosurveillance. Gezien de tijd- en kostengerelateerde kenmerken van dit protocol is het zeker op grote schaal haalbaar. Bovendien kan dit protocol, met kleine variaties, zowel worden aangepast aan menselijke kankercellijnen als aan menselijke perifere bloed-afgeleide immuuncellen en worden gecombineerd met genetische en/of farmacologische remming van specifieke routes om biomarkers van immuunrespons te identificeren.

Het vermogen van CD11c+ DC's, de algemeen bekende fagocytensubgroep gespecialiseerd voor kruispresentatie21,22 en omheind zoals weergegeven in figuur 2A, om apoptotische lichamen van met UV bestraalde MCA205-kankercellen te overspoelen die eerder waren gelabeld met de PKH67-fluorescerende cellinker, werd geëvalueerd door mFC. Zoals verwacht vingen CD11c+ DC's efficiënt apoptotische MCA205-cellen in vitro bij 37 °C, maar niet bij 4 °C (Figuur 2B, stappen 1-3 van de kanker-immuniteitscyclus). Om DC-rijping na opname van tumor Ag verder te karakteriseren, werd de oppervlakte-expressie van costimulatoire en immuuncheckpoint-ligandmoleculen gecontroleerd en vergeleken in DC's pre- en post-fagocytose (respectievelijk DCN en DCPHAGO). DCPHAGO-cellen vertoonden significant verhoogde niveaus van CD86 en MHC-II, samen met verlaagde niveaus van PDL1 (Figuur 2C, stap 4 van de kanker-immuniteitscyclus). Bovendien werd de klonale expansie van CD8T-cellen na kruising door DCPHAGO (CD8 CP) beoordeeld door de opname van het EdU-thymidine-analoog te evalueren (stap 5 van de kanker-immuniteitscyclus). Door levende CD3+CD8+ T-cellen op de juiste manier te gating (Figuur 3A), werd vastgesteld dat ~20% van de CD8 C-P, die de klonen vertegenwoordigt die het CD95-molecuul tot expressie brengen en tumor Ag-specifieke TCR's dragen (aanvullende figuur 1), proliferatie onderging in vergelijking met naïeve CD8T-cellen (CD8N, figuur 3B). Door gebruik te maken van ToC-modellen (Figuur 3C), werd het vermogen van CD8C-P geëvalueerd om chemo-aantrekkingskracht te detecteren en erop te reageren door alarminen die door kankercellen worden vrijgegeven, waardoor tumorspecifieke CD8 T-celhoming naar de TME wordt gespiegeld (stap 6 van de kanker-immuniteitscyclus). In het bijzonder werden ToC's gebruikt om de chemische en fysieke aantrekkingskracht en interactie tussen niet-aanhangende immuuncellen mogelijk te maken en te volgen, die van de immuunkamer naar de tumorkamer gaan en aanhangende kankercellen die in de tumorkamer rusten. Microfoto's genomen op verschillende tijdstippen na de co-cultuur toonden een progressieve migratie van CD8C-P naar kankercellen door microkanalen te kruisen (Figuur 3C). Van belang was dat naderende immuuncellen stabiel en efficiënt konden interageren met kankercellen na 24 uur, 48 uur en 72 uur (Figuur 3D). Ten slotte werd de respons van CD8C-P op de TME geanalyseerd en opnieuw gestimuleerd door door kanker gepresenteerde Ags (CD8E) door, via mFC, de oppervlakte-expressieniveaus van de vroege CD69 (aanvullende figuur 2A) en late CD44, CD25 (figuur 4A) activeringsmarkers te beoordelen, evenals de membraanexpressie van CD137 (figuur 4B) en CD107a (aanvullende figuur 2B) tumorreactiviteitsmarkers in vergelijking met CD8N en CD8C-P (stap 7 van de kanker-immuniteitscyclus). We evalueerden ook de intracellulaire productie van de cytotoxische moleculen Grz-B (Figuur 5A) en IFN-γ (Figuur 5B). Interessant is dat al deze markerniveaus geleidelijk en significant toenamen en een keuzepunt van expressie bereikten na 72 uur co-cultuur, waardoor een late en effectieve activering werd weerspiegeld. Dienovereenkomstig ondergingen verwante co-gekweekte MCA205-cellen significante niveaus van CD8 E-gemedieerde dood, zoals onthuld door een levend celanalysesysteem en mFC-analyses (Figuur 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig01.jpg"> Figuur 1: Overzicht van het experimentele protocol voor het bestuderen van de kanker-immuniteitscyclus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig02.jpg"> Figuur 2: DC-gemedieerde opname en presentatie van kankercellen. (A) Gatingstrategie voor DC mFC-analyse. Tijdens mFC-acquisitie en gegevensanalyse werden monsters achtereenvolgens omheind (1) voor morfologie door FSC-A en SSC-A uit te zetten; (2) voor enkelingen door FSC-A en FSC-H uit te zetten; en (3) voor levensvatbaarheid door Near-IR en SSC-A uit te zetten. Levensvatbare cellen werden uiteindelijk geanalyseerd op de specifieke oppervlaktemarker CD11c. (B) mFC-analyse van het vermogen van CD11c+ DC's om apoptotische lichamen van PKH67-gelabelde, UV-bestraalde MCA205-kankercellen te overspoelen bij 37 °C en 4 °C (stappen 1-3 van de kanker-immuniteitscyclus). Representatieve biparametrische grafieken en een histogram met CD11c+PKH67+ celpercentage (gemiddelde ± s.e.m. met een individueel datapunt, één representatief experiment op de drie wordt getoond). (C) mFC-analyse van costimulatoire en immuun checkpoint ligandoppervlaktemoleculen op DC's pre- en postfagocytose (respectievelijk DCN en DCPHAGO; stap 4 van de kanker-immuniteitscyclus). De histogrammen vertegenwoordigen het percentage (gemiddelde ± s.e.m. en individuele datapunten, n = 3 onafhankelijke experimenten) van CD11c+CD86+, CD11c+MHC-II+ en CD11c+PDL1+ cellen. (B) Ongepaarde tweezijdige leerling-t-toets met Welch-correctie vergeleken met 4 °C. (C) Ongepaarde tweezijdige leerling-t-toets vergeleken met DCN.Klik <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig02large.jpg" target="_blank">hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig03.jpg"> Figuur 3: Proliferatie van CD8 T-cellen en transport naar kankercellen na cross-priming. (A) Gating-strategie voor CD3+CD8+ T-celanalyse. Tijdens mFC-acquisitie en gegevensanalyse werden monsters achtereenvolgens omheind (1) voor morfologie door FSC-A en SSC-A uit te zetten; (2) voor enkelingen door FSC-A en FSC-H uit te zetten; en (3) voor levensvatbaarheid door Aqua en SSC-A uit te zetten. Levensvatbare cellen werden uiteindelijk geanalyseerd op de specifieke proliferatie Edu-kleuring. (B) mFC-analyse van de klonale expansie van CD8 T-cellen door middel van EdU-technologie (stap 5 van de kanker-immuniteitscyclus). De monoparametrische histogrammen vertegenwoordigen het percentage (gemiddelde ± s.e.m. met individueel datapunt, één representatief experiment op de drie wordt getoond) van prolifererende EdU+ naïeve en cross-primed CD8 T-cellen (respectievelijk CD8N en CD8C-P). (C,D) ToC microfluïdisch model van CD8 T-cel homing naar de TME (stap 6 van de kanker-immuniteitscyclus). (C) Schematische planimetrie van een inhoudsopgave. De twee laterale kweekkamers, waarin immuun- en kankercellen zijn ondergebracht, zijn verbonden door kanalen ter grootte van micron (breedte = 12 μm, lengte = 10 μm, hoogte = 10 μm). Celcultuurcompartimenten zijn 1 mm breed, 8 mm lang en 100 μm hoog. De microfoto's die tijdens time-lapse-opnames worden gegenereerd, vertegenwoordigen de migratie van CD8C-P naar kankercellen op verschillende tijdstippen (van 0-72 uur; schaalbalk, 100 μm). (D) Grafieken die de trajecten van individuele CD8C-P (n = 100 cellen per aandoening) naar doelkankercellen (zwarte vlekken) binnen 24-72 uur vertegenwoordigen, worden weergegeven (schaalbalk, 10 μm). (A) Ongepaarde tweezijdige t-toets van de student met de correctie van Welch vergeleken met CD8N. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig04.jpg"> Figuur 4: Reactiviteit van CD8 T-celtumoren na herstimulatie met levende kankercellen. (A) mFC-analyse van de oppervlakte-expressieniveaus van CD44, CD25-activeringsmarkers op CD8 T-cellen die worden gerestimuleerd door door kanker gepresenteerde Ags (CD8E) (stap 7 van de kankerimmuniteitscyclus) tot 72 uur. Representatieve biparametrische grafieken en een histogram met CD44+CD25+ CD8 T-celpercentage in CD8N, CD8C-P, CD8E na 48 uur en 72 uur (gemiddelde ± s.e.m. en individuele datapunten, n = 3 onafhankelijke experimenten). (B) mFC-analyse van de membraanexpressie van de tumorreactiviteitsmarker CD137 op CD8E. Representatieve biparametrische grafieken en een histogram met CD137+ CD8 T-celpercentage in CD8N, CD8C-P, CD8E na 48 uur en 72 uur (gemiddelde ± s.e.m. en individuele datapunten, één representatief experiment op drie wordt getoond). (A,B) Gewone eenrichtings-ANOVA-test gevolgd door Bonferroni's correctie in vergelijking met CD8N. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig05.jpg"> Figuur 5: CD8 T-celproductie van Grz-B en IFN-γ. (A) mFC-analyse van de intracellulaire expressieniveaus van Grz-B op CD8E (stap 7 van de kanker-immuniteitscyclus). Representatieve histogramgrafieken met Grz-B+ CD8 T-cel MFI in CD8N, CD8C-P, CD8E na 48 uur en 72 uur (gemiddelde ± s.e.m. en individuele datapunten, n = 3 onafhankelijke experimenten). (B) mFC-analyse van intracellulaire IFN-γ op CD8E. Representatieve histogramdiagrammen met IFN-γ+ CD8 T-celpercentage in CD8N, CD8C-P, CD8E na 48 uur en 72 uur (gemiddelde ± s.e.m. en individuele datapunten, n = 3 onafhankelijke experimenten). (A,B). Gewone eenrichtings-ANOVA-test gevolgd door Bonferroni's correctie in vergelijking met CD8N. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig06.jpg"> Figuur 6: CD8 T-cel-gemedieerde tumordoding. (A) mFC-analyse van CD45-celdood aangedreven door CD8E na 72 uur co-cultuur (stap 7 van de kanker-immuniteitscyclus). De histogrammen vertegenwoordigen het percentage (gemiddelde ± s.e.m. en individuele datapunten, n = 3 onafhankelijke experimenten) van stervende PI+CD45− cellen. (B) Analyse van levende cellen van CD8 E-gemedieerde kankerceldood. Representatieve foto's en een grafiek die de opname van Cytotox Red door stervende en dode kankercellen laat zien (één representatief experiment op de drie wordt getoond). (A) Ongepaarde tweezijdige student's t-test vergeleken met alleen kankercellen (CTR). (B) Tweezijdige Mann-Whitney-test vergeleken met CTR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullende figuur 1: Histogramdiagrammen vertegenwoordigen de MFI van CD95+TCR-β+ CD8N en CD8C-P. Ongepaarde tweezijdige T-toets van de student vergeleken met CD8N. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/Suppl.%20Figure%201_revised.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende figuur 2: CD8 T-cel activering. (A) mFC-analyse van de oppervlakte-expressieniveaus van vroege CD69-activeringsmarker op CD8E (stap 7 van de kanker-immuniteitscyclus). Representatieve biparametrische grafieken en een histogram met CD69+ CD8 T-celpercentage in CD8N, CD8C-P, CD8E na 48 uur en 72 uur (gemiddelde ± s.e.m. en individuele datapunten, één experiment op drie). (B) mFC-analyse van de membraanexpressie van het CD107a lysosomaal geassocieerd eiwit op CD8E. Representatieve biparametrische grafieken en een histogram met CD107a+ CD8 T-celpercentage in CD8N, CD8C-P, CD8E na 48 uur en 72 uur (gemiddelde ± s.e.m. en individuele datapunten, één representatief experiment op drie wordt getoond). (A,B). Gewone eenrichtings-ANOVA-test gevolgd door Bonferroni's correctie in vergelijking met CD8N. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/Suppl.%20Figure%202_revised%20.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 1: Mengsels van antilichamen stap 3.3.2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Hier beschrijven we een eenvoudig, snel en betrouwbaar multiparametrisch flowcytometrie- en tumor-op-een-chip-ondersteund protocol om de stappen die de kankerimmuniteitscyclus vormen, te bewaken en te karakteriseren. Een grondig begrip van de wisselwerking tussen kanker en immuuncellen biedt inderdaad cruciale inzichten om tumoren te slim af te zijn en de klinische zorg te sturen.

Co-cultuur in vitro-systemen om de kanker-immuniteitscyclus te reproduceren

Fundamental cancer research and the development of effective counterattack therapies both rely on experimental studies detailing the interactions between ...

co-culture-in-vitro-systems-to-reproduce-the-cancer-immunity-cycle

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Ex vivo Uitbreiding van Tumor-reactieve T-cellen door middel van Bryostatin 1/Ionomycin en de Gemeenschappelijke Gamma Chain Cytokines Formulering

In this video, we demonstrate the repetitive tumor challenge assay to evaluate the CAR T cells’ repetitive tumor killing potential during high tumor cell loads. Further, the CAR T cells can be analyzed using flow cytometry to determine the different subpopulations of CAR T cells in the sample.

Repetitive Tumor Challenge Assay: An In Vitro Culture Assay to Evaluate Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Repetitive Tumor Killing Potential

Tumor-initiërende cellen (TIC's) kunnen een haalbaar therapeutisch doelwit zijn voor de behandeling van eierstokkanker, een zeer terugkerende en dodelijke ziekte. We presenteren een protocol voor kweekcondities die deze zeer tumorigene populatie cellen verrijken.

In vitro Verrijking van eierstokkanker tumor-initiërende cellen

We hebben een permeabele microporeuze membraaninzet aangepast om het tumormicro-omgeving (TME) te imiteren. Het model bestaat uit een gemengde celcultuur, maakt een vereenvoudigde generatie van sterk verrijkte individuele celpopulaties mogelijk zonder het gebruik van fluorescente markering of celsortering, en maakt het mogelijk om intercellulaire communicatie binnen het TME te bestuderen onder normale of stressomstandigheden.

Een Mimic van de tumor micro: Een eenvoudige methode voor het genereren van verrijkte celpopulaties en Onderzoeken intercellulaire communicatie

Hier beschrijven we een in vitro co cultuur methode recursief uitdaging tumor-gerichte T-cellen, die het mogelijk voor fenotypische en functionele analyse van antitumorale T cel activiteit maakt.

In Vitro Tumor cel Rechallenge voor voorspellende evaluatie van chimeer antigeen Receptor T cel antitumorale functie

De gepresenteerde aanpak evalueert tegelijkertijd kankercelinvasie in 3D-sferoïde testen en T-celcytotoxiciteit. Sferoïden worden gegenereerd in een steiger-vrije agarose multi-microwell gegoten. Co-cultuur en inbedding in type I collageen matrix worden uitgevoerd in hetzelfde apparaat dat het mogelijk maakt om kankercel invasie en T-cel gemedited cytotoxiciteit te controleren.

Monitoring Cancer Cell Invasion en T-Cell Cytotoxicity in 3D Cultuur

In het tijdperk van immunotherapie en eencellige genomische profilering vereist kankerbiologie nieuwe in vitro en computationele hulpmiddelen voor het onderzoeken van de tumor-immuuninterface in een juiste spatiotemporale context. We beschrijven protocollen om tumor-immuun microfluïdische co-culturen te exploiteren in 2D- en 3D-instellingen, compatibel met dynamische, multiparametrische monitoring van cellulaire functies.

Microfluïdische co-cultuurmodellen voor het ontleden van de immuunrespons in in vitro tumormicro-omgevingen

Het huidige protocol beschrijft een experimentele workflow die de ex vivo analyse van menselijke T-celstimulatie mogelijk maakt in een allogene...

Analyse van menselijke T-celactiviteit in een allogene co-cultuursetting van voorbehandelde tumorcellen

Het protocol beschrijft een methode voor het creëren van een van patiënten afgeleid organoïdemodel voor colorectale kanker (CRC), gekweekt in co-cultuur met tumor-infiltrerende lymfocyten (TIL's) om hun interacties en therapeutisch potentieel te bestuderen. Dit model biedt een preklinisch platform om immuunresponsen in de micro-omgeving van de tumor te onderzoeken en om de werkzaamheid van op TIL gebaseerde therapie voor gepersonaliseerde CRC-behandeling te voorspellen.

Oprichting van een co-cultuursysteem van patiënt-afgeleide colorectale tumororganoïden en tumor-infiltrerende lymfocyten (TIL's)

Dit protocol beschrijft de in vivo herprogrammering van muizenkankercellen tot type 1 dendritische-achtige cellen binnen de tumormicro-omgeving door middel van geforceerde expressie van de transcriptiefactoren PU.1, IRF8 en BATF3.

Kanteerbare in vivo herprogrammering van tumorcellen tot type 1 conventionele dendritische celachtige cellen

Leer co-cultuur in vitro-systemen om de kanker-immuniteitscyclus te reproduceren met multiparametrische flowcytometrie. Deze methode biedt een eenvoudige, snelle en betrouwbare aanpak voor het monitoren van kanker-immuuninteracties.

Co-cultuur in vitro-systemen om de kanker-immuniteitscyclus te reproduceren

Meer video's verkennen