Een in vitro test om de migratie van bloedplaatjes te bestuderen met behulp van RGD-gefunctionaliseerde avidine-biotine-tethers

Bloedplaatjes zijn cruciaal bij het voorkomen van bloedverlies na vaatletsel, het bestrijden van infecties en het behouden van de vasculaire integriteit tijdens ontstekingen. Hoewel hemostatische pluggen de collectieve activering en aggregatie van bloedplaatjes vereisen, wordt hun rol bij het beschermen van de ontstoken bloedvaten uitgevoerd op het niveau van één cel. In deze context hebben recente studies aangetoond dat bloedplaatjes autonoom kunnen migreren, een proces dat afhankelijk is van mechanosensing van hun adhesieve micro-omgeving.

Deze benadering maakt een nauwkeurige controle van de adhesieve eigenschappen van het substraat mogelijk en dient als een eenvoudige in vitro test om de mechanismen te bestuderen die ten grondslag liggen aan de migratie van bloedplaatjes. De resultaten geven aan dat migrerende bloedplaatjes die binden aan integrine-liganden kracht kunnen uitoefenen die de avidine-biotinebinding kan verstoren. Deze test biedt een eenvoudige en betrouwbare methode om de migratie van bloedplaatjes te visualiseren.

In combinatie met beeldvorming van levende cellen zal het ons helpen het samenspel en de regulatie van verschillende cytoskeletcomponenten in deze belangrijke bloedplaatjesfunctie beter te begrijpen. Om te beginnen glijdt het sonicaatglazen deksel gedurende één minuut in 20% salpeterzuur, gevolgd door sonicatie in isopropanol, ethanol en water gedurende elk één minuut. Behandel de vooraf gereinigde dekglaasjes gedurende twee minuten met zuurstofplasma in een plasmareiniger en zet ze vervolgens in elkaar met plakglaasjes.

Vul nu het kanaal met 2,5 microliter PLL-PEG-biotine verdund in 97,5 microliter PLL-PEG en incubeer gedurende 30 minuten op kamertemperatuur, daarna drie keer wassen met PBS. Voeg vervolgens 100 microliter neutravidine-FITC toe en incubeer gedurende 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur en was vervolgens drie keer met PBS. Voeg ten slotte 100 microliter cyclo-RGD-biotine toe, incubeer gedurende 30 minuten op kamertemperatuur en was drie keer met PBS.

Nadat u de muis hebt verdoofd en de thoracale huid hebt verwijderd, steekt u de naald tussen de tweede en derde rib aan de linkerkant van het borstbeen om bloed uit het hart te halen. Meng het bloed met een milliliter buffer van Tyrode en centrifugeer gedurende 20 minuten bij 70 g bij kamertemperatuur met uitgeschakelde rem, en neem vervolgens het bovenste deel met bloedplaatjesrijk plasma. Meng met drie milliliter Tyrode's buffer en voeg 100 nanogram per milliliter prostacycline toe om activering van bloedplaatjes te voorkomen.

Centrifugeer daarna vijf minuten bij 1200 g bij kamertemperatuur. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de pellet in 500 microliter buffer van Tyrode. Meet vervolgens met behulp van een hemocytometer het aantal bloedplaatjes.

Neem om te beginnen bloedplaatjes van muizen in biotine-neutravidine-biotine cRGD-coatingkanalen en registreer live bloedplaatjesmigratie met behulp van een omgekeerde microscoop die is uitgerust met een stage-incubator. Om de adhesie- of migratienummers van bloedplaatjes te tellen, klikt u met de rechtermuisknop op het vervolgkeuzemenu van het puntgereedschap in de werkbalk en selecteert u het meerpuntsgereedschap. Extraheer de migratieafstand uit vaste monsters door de lengte van het migratiepad te meten dat in de neutravidine-FITC-coating is gedrukt.

Klik met de rechtermuisknop op het vervolgkeuzemenu van het gereedschap Rechte lijn in de werkbalk en selecteer het vrije handlijngereedschap. Als u de vorm van de bloedplaatjes wilt kwantificeren, selecteert u Afbeelding, Aanpassen en Drempelwaarde in de werkbalk om binaire maskers te genereren door fluorescerende bloedplaatjes te segmenteren. Selecteer vormdescriptoren in Metingen analyseren en instellen en selecteer vervolgens Resultaten weergeven met Deeltjes analyseren en analyseren.

Bloedplaatjes vertoonden een optimale migratie bij een PLL-PEG-biotineconcentratie van 2,5%. De migratie was verminderd bij zowel lagere als hogere liganddichtheden. Bloedplaatjes verspreiden zich onvoldoende bij een liganddichtheid van 1%, aangegeven door een lage oppervlakte en omtrek, wat wijst op onvoldoende activering van integrine.

Bij een liganddichtheid van 2,5% verspreiden bloedplaatjes zich effectief, waardoor de cRGD-liganden worden verstoord en migreren. Hoge liganddichtheid zorgde ervoor dat bloedplaatjes zich zonder polarisatie verspreidden, waardoor de migratie als gevolg van het niet breken van cRGD-liganden werd verminderd.