Name: Kwantificering van cytokine-geïnduceerde celdood in menselijke colonorganoïden met behulp van live fluorescentiemicroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T13:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Leer hoe je cytokine-geïnduceerde celdood kwantificeert in menselijke colonorganoïden met live fluorescentiemicroscopie. Deze methode ondersteunt onderzoek naar epitheelcelsterfte en mucosale immunologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de patiënten bedanken voor hun geïnformeerde toestemming en deelname aan het onderzoek, en het klinisch personeel voor hun uitstekende hulp. Figuur 1A is gemaakt met BioRender.com. Dit werk werd ondersteund door subsidies van Science Foundation Ireland, namelijk een prijs voor loopbaanontwikkeling (CDA) aan K.N. (SFI-13/CDA/2171), een subsidie voor een onderzoekscentrum (SFI-12/RC/2273) en een prijs voor een onderzoekscentrum (SFI-14/SP/2710) aan APC Microbiome Ireland. P.F. ontving ook financiering van SFI/20/RP/9007.

Kwantificering van celdood in menselijke colonoïden als reactie op cytotoxische perturbagens

<ol><li>Patankar, J. V., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+in+the+gut+epithelium+and+implications+for+chronic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Cell death in the gut epithelium and implications for chronic inflammation.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 17 (9), 543-556 (2020).</li>
<li>Zeissig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+epithelial+apoptosis+and+barrier+repair+in+active+Crohn%27s+disease+by+tumour+necrosis+factor+alpha+antibody+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Downregulation of epithelial apoptosis and barrier repair in active Crohn's disease by tumour necrosis factor alpha antibody treatment.</a> Gut. 53 (9), 1295-1302 (2004).</li>
<li>Bartee, E., Mcfadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+synergy%3A+An+underappreciated+contributor+to+innate+anti-viral+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Cytokine synergy: An underappreciated contributor to innate anti-viral immunity.</a> Cytokine. 63 (3), 237-240 (2013).</li>
<li>Fish, S. M., Proujansky, R., Reenstra, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+effects+of+interferon+%CE%B3+and+tumour+necrosis+factor+%CE%B1+on+T84+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Synergistic effects of interferon γ and tumour necrosis factor α on T84 cell function.</a> Gut. 45 (2), 191-198 (1999).</li>
<li>Wakisaka, Y., Sugimoto, S., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+medicine+for+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Organoid medicine for Inflammatory Bowel Disease.</a> Stem Cells. 40 (2), 123-132 (2022).</li>
<li>Flood, P., Hanrahan, N., Nally, K., Melgar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intestinal+organoids%3A+Modeling+gastrointestinal+physiology+and+immunopathology+-+current+applications+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human intestinal organoids: Modeling gastrointestinal physiology and immunopathology - current applications and limitations.</a> Eur J Immunol. 54 (2), e2250248(2024).</li>
<li>Matsuzawa-Ishimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intestinal+organoid-based+platform+that+recreates+susceptibility+to+t-cell-mediated+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An intestinal organoid-based platform that recreates susceptibility to t-cell-mediated tissue injury.</a> Blood. 135 (26), 2388-2401 (2020).</li>
<li>Lee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+responses+to+IL-17+in+adult+stem+cell-derived+human+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Crohns+Colitis%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial responses to IL-17 in adult stem cell-derived human intestinal organoids.</a> J Crohns Colitis. 16 (12), 1911-1923 (2022).</li>
<li>Woznicki, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-%CE%B1+synergises+with+IFN-%CE%B3+to+induce+caspase-8-JAK1%2F2-STAT1-dependent+death+of+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">TNF-α synergises with IFN-γ to induce caspase-8-JAK1/2-STAT1-dependent death of intestinal epithelial cells.</a> Cell Death Dis. 12 (10), 864(2021).</li>
<li>Flood, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sensor-associated+type+I+interferon+signaling+is+increased+in+ulcerative+colitis+and+induces+jak-dependent+inflammatory+cell+death+in+colonic+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">DNA sensor-associated type I interferon signaling is increased in ulcerative colitis and induces jak-dependent inflammatory cell death in colonic organoids.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 323 (5), G439-G460 (2022).</li>
<li>Grabinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+intestinal+crypt+organoids+as+a+model+system+for+assessing+cell+death+induction+in+intestinal+epithelial+cells+and+enteropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of intestinal crypt organoids as a model system for assessing cell death induction in intestinal epithelial cells and enteropathy.</a> Cell Death Dis. 5 (5), e1228(2014).</li>
<li>Bode, K. J., Mueller, S., Schweinlin, M., Metzger, M., Brunner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+and+simple+fluorometric+method+to+detect+cell+death+in+3D+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A fast and simple fluorometric method to detect cell death in 3D intestinal organoids.</a> Biotechniques. 67 (1), 23-28 (2019).</li>
<li>Mertens, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-repurposing+screen+on+patient-derived+organoids+identifies+therapy-induced+vulnerability+in+KRAS-mutant+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Drug-repurposing screen on patient-derived organoids identifies therapy-induced vulnerability in KRAS-mutant colon cancer.</a> Cell Rep. 42 (4), 112324(2023).</li>
<li>Vandussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. 64 (6), 911-920 (2015).</li>
<li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Woznicki, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+BCL-G+regulates+secretion+of+inflammatory+chemokines+but+is+dispensable+for+induction+of+apoptosis+by+IFN-%CE%B3+and+TNF-%CE%B1+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Human BCL-G regulates secretion of inflammatory chemokines but is dispensable for induction of apoptosis by IFN-γ and TNF-α in intestinal epithelial cells.</a> Cell Death Dis. 11 (1), 68(2020).</li>
<li>Edgar, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture-associated+DNA+methylation+changes+impact+on+cellular+function+of+human+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Culture-associated DNA methylation changes impact on cellular function of human intestinal organoids.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 14 (6), 1295-1310 (2022).</li>
<li>Mubaid, F., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Less+is+more%3A+Longer+exposure+times+with+low+light+intensity+is+less+photo-toxic%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Today%22%5BJournal%5D)">Less is more: Longer exposure times with low light intensity is less photo-toxic.</a> Microscopy Today. 25 (6), 26-35 (2017).</li>
<li>Ziegler, U., Groscurth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+features+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22News+Physiol+Sci%22%5BJournal%5D)">Morphological features of cell death.</a> News Physiol Sci. 19 (3), 124-128 (2004).</li>
<li>Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+changes+during+programmed+cell+deaths%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane changes during programmed cell deaths.</a> Cell Res. 28 (1), 9-21 (2018).</li>
<li>Tamura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+anticancer+agents+using+patient-derived+tumor+organoids+characteristically+similar+to+source+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues.</a> Oncol Rep. 40 (2), 635-646 (2018).</li>
<li>Karki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergism+of+TNF-%CE%B1+IFN-%CE%B3+triggers+inflammatory+cell+death%2C+tissue+damage%2C+and+mortality+in+SARS-CoV-2+infection+and+cytokine+shock+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Synergism of TNF-α IFN-γ triggers inflammatory cell death, tissue damage, and mortality in SARS-CoV-2 infection and cytokine shock syndromes.</a> Cell. 184 (1), 149-168 (2021).</li>
<li>Geary, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+synergy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Understanding synergy.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 304 (3), E237-E253 (2013).</li>
<li>Duarte, D., Vale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+synergism+in+drug+combinations+and+reference+models+for+future+orientations+in+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Res+Pharmacol+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Evaluation of synergism in drug combinations and reference models for future orientations in oncology.</a> Curr Res Pharmacol Drug Discov. 3, 100110(2022).</li>
<li>Wong, F. C., Woo, C. C., Hsu, A., Tan, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-cancer+activities+of+Vernonia+amygdalina+extract+in+human+breast+cancer+cell+lines+are+mediated+through+caspase-dependent+and+p53-independent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The anti-cancer activities of Vernonia amygdalina extract in human breast cancer cell lines are mediated through caspase-dependent and p53-independent pathways.</a> PLoS One. 8 (10), e78021(2013).</li>
<li>Ryall, K. A., Tan, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+approaches+for+advancing+the+discovery+of+effective+drug+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cheminform%22%5BJournal%5D)">Systems biology approaches for advancing the discovery of effective drug combinations.</a> J Cheminform. 7, 7(2015).</li>
<li>Sukho, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cell+seeding+density+and+inflammatory+cytokines+on+adipose+tissue-derived+stem+cells%3A+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev+Rep%22%5BJournal%5D)">Effect of cell seeding density and inflammatory cytokines on adipose tissue-derived stem cells: An in vitro study.</a> Stem Cell Rev Rep. 13 (2), 267-277 (2017).</li>
<li>Vaughan-Jackson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Density+dependent+regulation+of+inflammatory+responses+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Density dependent regulation of inflammatory responses in macrophages.</a> Front Immunol. 13, 895488(2022).</li>
<li>Lumibao, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+extracellular+matrix+on+the+precision+medicine+utility+of+pancreatic+cancer+patient-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The impact of extracellular matrix on the precision medicine utility of pancreatic cancer patient-derived organoids.</a> bioRxiv. , 10.1101/2023.01.26.525757 (2023).</li>
<li>Lee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-%CE%B1+induces+LGR5%2B+stem+cell+dysfunction+in+patients+with+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">TNF-α induces LGR5+ stem cell dysfunction in patients with Crohn's disease.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (3), 789-808 (2022).</li>
</ol>

K.N. ontving onderzoeksfinanciering van AbbVie Inc. gedurende de tijd dat het werk werd voltooid. Deze financiering was in het kader van een prijs van een onderzoekscentrum (SFI-14/SP/2710) aan APC Microbiome Ireland.

Er zijn verschillende methoden ontwikkeld voor kwantitatieve analyses van celdood in darmorganoïden. Het onderzoeken van de verstoring van de morfologie van intestinale organoïden door lichtmicroscopie is een eenvoudige benadering om de effecten van cytotoxische stoffen te kwantificeren11. Morfologische veranderingen zijn echter geen directe meting van celdood en de methode is slechts semi-kwantitatief. Een andere methode is het evalueren van de metabolische activiteit van organoïden met behulp van een MTT- of ATP-test10,11. Het is belangrijk op te merken dat deze tests alleen veranderingen in de levensvatbaarheid van cellen kunnen bepalen en moeten worden gevalideerd met een celdoodtest. Andere fluorometrische celdoodtesten met behulp van DNA-bindende kleurstoffen zijn gerapporteerd12,13. Een niet-beeldvormende benadering met behulp van een fluorescerende microplaatlezer is mogelijk en maakt een hoge doorvoer mogelijk12. Deze methode meet echter het gemiddelde signaal van een hele put, waardoor deze ongeschikt is voor heterogene populaties. Het vereist ook het gebruik van een microplaatlezer met Z-hoogteverstelling. Op fluorescerende beeldvorming gebaseerde technieken kunnen worden gebruikt voor analyse van één organoïde en het vastleggen van cellulaire/subcellulaire en morfologische gegevens. Geautomatiseerde confocale high-content imaging (HCI)-systemen kunnen grote hoeveelheden gegevens genereren met een hoge doorvoer13. Helaas heeft confocale HCI gespecialiseerde apparatuur nodig, maakt het gebruik van complexe protocollen, vereist het doorgaans commerciële beeldanalysesoftware en is het duur.
Ons protocol voor kwantitatieve analyse van colonoïde celdood op meerdere tijdstippen is rechttoe rechtaan, eenvoudig en goedkoop. In vergelijking met geautomatiseerde HCI- en plaatlezersystemen is het echter tijdrovend en heeft het een verminderde doorvoer. Een andere beperking van onze methode is het gebruik van breedveldmicroscopie in tegenstelling tot confocale microscopie. Confocale microscopie is meer geschikt voor het afbeelden van dikke 3D-monsters zoals organoïden, omdat het een onscherp signaal vermindert en seriële optische secties (Z-stacks) kan verkrijgen. Confocale beeldvorming vereist echter doorgaans langere acquisitietijden en lasers met hoge intensiteit die de fototoxiciteit/fotobleking verhogen. Het is van cruciaal belang op te merken dat fluorescerende celdoodkleurstoffen zoals SYTOX Green alleen geschikt zijn voor het meten van vormen van celdood waarbij de integriteit van het celmembraan verloren gaat, zoals necrose, late apoptose-geassocieerde secundaire necrose, necroptose en pyroptose21. Er zijn enkele vormen van gereguleerde celdood waarbij het celmembraan ondoordringbaar blijft, in ieder geval tijdens de vroege fasen van celdood, zoals caspase-afhankelijke apoptose. Dit protocol kan echter gemakkelijk worden gewijzigd om ook beeldvorming van een caspase 3/7 activiteit fluorescerende reporter22 op te nemen. Dit zou aanvullende gegevens opleveren om de specifieke celdoodmodaliteit te helpen karakteriseren.
We gebruikten ons protocol om de cytotoxische synergetische interactie tussen de cytokines IFN-γ en TNF-α aan te tonen (Figuur 2C), die we eerder hebben gerapporteerd in van CD-patiënten afgeleide organoïden 9,10. De fysiologische relevantie van deze vorm van synergisme is ook aangetoond in muizenmodellen van hemofagocytaire lymfohistiocytose en sepsis23. Er zijn verschillende wiskundige referentiemodellen en benaderingen geïmplementeerd voor het kwantificeren van synergie tussen combinaties van biologische agentia24,25. Ze verschillen in termen van hun complexiteit, het aantal factoren waarmee ze rekening houden en de drempel om een interactie als synergetisch te beschouwen24,25. Sommige modellen vereisen voorkennis van de geteste biologische agentia, maken bepaalde aannames over de activiteit van agentia en kunnen uitgebreide dosis-responscurves vereisen voor elke afzonderlijke en combinatiebehandeling25. De methode die we hebben gekozen om synergie te meten, is een wijziging van het CDI-model (Coëfficiënt van geneesmiddelinteractie), dat eerder is gebruikt om de remmende effecten van combinaties van chemotherapie op de proliferatie van kankercellijnen te meten26. Het CDI is een Bliss-onafhankelijkheidsmodel; bij het berekenen van het voorspelde gecombineerde effect van twee perturbagens gaat Bliss independence ervan uit dat ze zich richten op afzonderlijke paden en onafhankelijke werkingsmechanismen hebben27. Om een interactie tussen perturbagens synergetisch te laten zijn, moet het werkelijke gecombineerde effect groter zijn dan het voorspelde effect. Dit model is geschikt voor onze experimentele opzet, aangezien bekend is dat IFN-γ en TNF-α verschillende receptoren en stroomafwaartse signaalcomponenten hebben. Verder maakt Bliss-onafhankelijkheid het mogelijk om een interactiecoëfficiënt te berekenen om synergisme te kwantificeren en vereist het geen dosis-responsdatasets.
Er zijn een paar belangrijke factoren waarmee rekening moet worden gehouden om optimale resultaten voor dit protocol te garanderen. Het is belangrijk dat colonoïden worden vermeerderd tot een hoge dichtheid (Figuur 1Bi), dat ze een diameter van ongeveer 25-50 μm hebben en actief prolifereren voordat ze proberen cellen te zaaien. Het gebruik van suboptimale culturen van colonoïden voor tests kan resulteren in onvoldoende celaantallen, laag colonoïdherstel en inconsistente experimenten. Voor reproduceerbare resultaten is het ook belangrijk om de dichtheid van colonoïden consistent te zaaien tussen experimenten. Het is eerder aangetoond dat de in vitro respons op inflammatoire cytokines kan worden beïnvloed door de dichtheid van celzaaien28,29. Een ander veelvoorkomend probleem is de vorming van luchtbellen in de BME-koepel, die de beeldvorming kunnen beïnvloeden. Dit kan worden voorkomen door gebruik te maken van de omgekeerde pipetteertechniek. Deze techniek resulteert ook in een consistenter zaaien.
Verder, als u meerdere tijdstippen in beeld brengt, bereidt u voor elk tijdstip een maximale toxiciteitsvoorwaarde voor. Triton-X 100, een niet-ionogene oppervlakteactieve stof, wordt vaak gebruikt als positieve controle (Max Toxiciteitsvoorwaarde) voor cytotoxiciteitstests. De toevoeging van Triton-X 100 lyseert en doodt de colonoïden, waardoor de fluorescerende celdoodkleurstof de cellen kan binnendringen. Het gebruik van een maximale toxiciteitsvoorwaarde van een eerder tijdstip zal resulteren in een onnauwkeurige en inconsistente normalisatie van gegevens omdat het fluorescerende signaal in de loop van de tijd vervalt.
Een laatste punt om te overwegen is de keuze van BME die wordt gebruikt voor colonoïde cultuur. Er zijn verschillende commerciële producenten van BME; voor ons protocol hebben we echter alleen het merk getest dat is opgenomen in de materiaaltabel. Een recente studie met behulp van van patiënten afkomstige organoïden van alvleesklierkanker wees uit dat de commerciële bron van BME de celproliferatiesnelheden veranderde, maar geen significant effect had op de respons op chemotherapiemedicijnen of genexpressie30. Met dit in gedachten verwachten we dat de trend van resultaten vergelijkbaar zal zijn tussen BME-merken voor ons protocol, maar we raden aan om consequent hetzelfde merk te gebruiken.
We hebben aangetoond hoe dit protocol kan worden gebruikt voor de analyse van IFN-γ en TNF-α geïnduceerde celdood met behulp van van CD-patiënt afgeleide colonoïden. Van patiënten afgeleide darmorganoïden zijn een krachtig hulpmiddel om CD te bestuderen, omdat ze veel kenmerken van de ziekte behouden, waaronder een verhoogde gevoeligheid voor de cytotoxische effecten van TNF-α31. Het protocol kan echter gemakkelijk worden gewijzigd om cytotoxische effecten van andere perturbagens dan cytokines of andere ziektetoestanden dan IBD te onderzoeken, zoals colorectale kanker (we hebben het protocol met succes getest met behulp van niet-IBD-colonoïden). Wij zijn van mening dat deze methode nuttig is voor elk onderzoeksgebied dat zich bezighoudt met celdoodmechanismen, epitheliale barrièrefunctie of intestinale mucosale immunologie.

Het darmepitheel vormt een fysieke semipermeabele barrière tussen de inhoud van het darmlumen en de onderliggende weefsels. Om deze barrière effectief te behouden, ondergaan darmepitheelcellen (IEC's) een extreem hoge celvernieuwing, met een continue cyclus van celdood en regeneratie. Tijdens inflammatoire aandoeningen, zoals inflammatoire darmaandoeningen (IBD), treden echter hogere niveaus van afwijkende celdoodop1. Dit kan een afbraak van de barrièrefunctie en activering van het immuunsysteem bevorderen, waardoor verdere ontstekingen worden veroorzaakt. Bij de ziekte van Crohn (CD), een vorm van IBD, is aangetoond dat cytokinesignalering bijdraagt aan de verhoogde niveaus van IEC-sterfte2. Door te bestuderen hoe cytokinesignalering celdood van IEC's induceert, wordt gehoopt dat verbeterde behandelingen kunnen worden ontwikkeld voor patiënten met IBD en andere intestinaleontstekingsaandoeningen.
In onderzoek naar biologie en de ontdekking van medicijndoelen wordt over het algemeen aangenomen dat synergie optreedt wanneer een biologisch systeem dat wordt behandeld met combinaties van individuele stimuli een respons op de combinatie vertoont die groter is dan de gecombineerde additieve effecten van de enkele stimuli alleen. Synergetische interacties tussen cytokinen zijn goed gedocumenteerd bij het aansturen van aangeboren antivirale responsen3. Van cytokinen is ook bekend dat ze synergetisch celdood induceren, ook in IEC's4. De rol die synergetische cytotoxische cytokinesignalering speelt bij intestinale ontstekingsaandoeningen zoals IBD is echter onderbelicht.
Menselijke darmorganoïden zijn 3D-microweefsels die in vitro worden geproduceerd en die worden gegenereerd uit intestinale epitheelstamcellen. Intestinale organoïden kunnen worden gekweekt uit darmslijmvliesbiopten die zijn verkregen van patiënten met IBD en behouden veel kenmerken van de ziekte 5,6. Organoïden hebben bewezen een ideaal modelsysteem te zijn voor het bestuderen van cytokinecytotoxiciteit in de context van darmontsteking 7,8. Eerder heeft onze groep de synergetische dodende effecten van de IBD-relevante cytokines IFN-γ en TNF-α in van CD-patiënten afgeleide colonorganoïden (colonoïden) gekarakteriseerd9,10. De exacte mechanismen die betrokken zijn bij het mediëren van deze vorm van synergetische celdood blijven echter ongrijpbaar. Er zijn mogelijk ook veel meer niet-gekarakteriseerde cytotoxische cytokine-interacties die relevant zijn voor intestinale ontstekingsaandoeningen.
Er zijn verschillende protocollen beschikbaar om celdood in darmorganoïden te bestuderen 10,11,12,13; Ze hebben echter elk nadelen. Sommige van deze technieken meten alleen de levensvatbaarheid van cellen en meten de celdood niet rechtstreeks, zijn niet in staat om reacties van één organoïde te evalueren, of vereisen dure apparatuur en complexe protocollen. Er zijn robuuste en eenvoudige methodologieën nodig om organoïde celdood en verstoorde interacties in darmorganoïden te kwantificeren. Het protocol dat we presenteren is een eenvoudige en goedkope benadering om enkelvoudige organoïde reacties op cytotoxische cytokines te meten, maar kan worden gebruikt voor elk type stimulus of perturbagen. We laten ook zien hoe we het Bliss-onafhankelijkheidssynergiemodel kunnen gebruiken om een coëfficiënt van perturbagen-interactie (CPI) te berekenen die cytotoxische cytokine-interacties beschrijft.

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B Solution</td><td>Sigma-Merck</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Sigma-Merck</td><td>SML0788</td><td></td></tr><tr><td>BioRender</td><td>Science Suite Inc.</td><td>N/A</td><td>Scientific illustration software</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Merck</td><td>A2058</td><td>Essentially IgG-free, low endotoxin</td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Sigma-Merck</td><td>SML1046</td><td></td></tr><tr><td>Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile</td><td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear</td><td>R&amp;D Systems</td><td>3532-010-02</td><td>Basement membrane extract</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Merck</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Merck</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL Digital Inverted Fluorescence Microscope</td><td>Invitrogen</td><td>AMF4300</td><td>Digital inverted epifluorescence microscope</td></tr><tr><td>EVOS 40x Objective, fluorite, LWD, phase-contrast</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMEP4683</td><td>Long working distance 40x fluorescence objective</td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ (Windows version)</td><td>Open-source software</td><td>N/A</td><td>Image analysis software</td></tr><tr><td>Foetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Merck</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin Solution</td><td>Sigma-Merck</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0485</td><td>Enzyme-free cell dissociation reagent</td></tr><tr><td>GlutaMAX-1</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5 (Windows version)</td><td>Dotmatics</td><td>N/A</td><td>Data graphics and statistics software</td></tr><tr><td>Greiner 15 mL Polypropylene Centrifuge Tube, Sterile with conical bottom &amp; Screw Cap</td><td>Cruinn</td><td>188261CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Human recombinant EGF (animal free)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcysteine</td><td>Sigma-Merck</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma-Merck</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-nr-05</td><td>Broad range antimicrobial reagent</td></tr><tr><td>Nunc Edge 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15543115</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IFN-gamma Protein</td><td>R&amp;D Systems</td><td>285-IF</td><td>Resuspend in sterile filtered 0.1% PBS/BSA</td></tr><tr><td>Recombinant Human TNF-alpha Protein</td><td>R&amp;D Systems</td><td>210-TA</td><td>Resuspend in sterile filtered 0.1% PBS/BSA</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Merck</td><td>S7067</td><td></td></tr><tr><td>Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>3451</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green Nucleic Acid Stain - 5 mM Solution in DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>S7020</td><td>Fluorescent cell death dye, protect from light</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Merck</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue solution</td><td>Sigma-Merck</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Tryple Express</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td>Enzymatic dissociation reagent</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-10071</td><td>Inhibitor of ROCK-I and ROCK-II</td></tr></tbody></table>

kwantificering van cytokine-geïnduceerde celdood in menselijke colonorganoïden met behulp van live fluorescentiemicroscopie

Quantification of Cytokine-Induced Cell Death in Human Colonic Organoids Using Live Fluorescence Microscopy

De dood van intestinale epitheelcellen (IEC) is verhoogd bij patiënten met inflammatoire darmziekten (IBD) zoals colitis ulcerosa (UC) en de ziekte van Crohn (CD). Dit kan bijdragen aan defecten in de darmbarrièrefunctie, verergering van ontstekingen en immunopathogenese van de ziekte. Cytokinen en doodreceptorliganden zijn gedeeltelijk verantwoordelijk voor deze toename van IEC-sterfte. IBD-relevante cytokines, zoals TNF-α en IFN-γ, zijn cytotoxisch voor IEC's, zowel onafhankelijk als in combinatie. Dit protocol beschrijft een eenvoudige en praktische test om cytokine-geïnduceerde cytotoxiciteit te kwantificeren in van CD-patiënten afgeleide colonorganoïden met behulp van een fluorescerende celdoodkleurstof (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), live fluorescentiemicroscopie en open-source beeldanalysesoftware. We laten ook zien hoe we het wiskundige model van Bliss-onafhankelijkheid kunnen gebruiken om een coëfficiënt van perturbagen-interactie (CPI) te berekenen op basis van organoïde cytotoxiciteit. De CPI kan worden gebruikt om te bepalen of interacties tussen cytokinecombinaties of andere soorten perturbagens antagonistisch, additief of synergetisch zijn. Dit protocol kan worden geïmplementeerd om de cytotoxische activiteit van cytokinen en andere verstoringen te onderzoeken met behulp van van patiënten afgeleide colonorganoïden.

Met behulp van dit protocol hebben we aangetoond hoe colonoïden van CD-patiënten kunnen worden gebruikt om de cytotoxische effecten van de IBD-relevante cytokines IFN-γ en TNF-α op het primaire epitheel te bestuderen. We gebruikten een in de handel verkrijgbare fluorescerende celdoodkleurstof (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), die alleen cellen kan binnendringen die een gecompromitteerd celmembraan hebben, waar het vervolgens wordt geactiveerd door binding aan nucleïnezuren. We behandelden colonoïden samen met cytokines en de fluorescerende celdoodkleurstof en voerden live celbeeldvorming uit op 8 uur en 24 uur met een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop. Representatieve transmissie-/fluorescerende overlay-beelden na 8 uur geven aan dat alleen de met IFN-γ + TNF-α behandelde colonoïden positief zijn voor fluorescerend signaal; er is echter slechts een klein aantal fluorescerende cellen (Figuur 2A). Celblebbing, een morfologische indicator van celdood20, kan ook worden waargenomen bij de toestand IFN-γ + TNF-α. Na 24 uur vertonen colonoïden die zijn behandeld met IFN-γ + TNF-α grote gebieden die positief zijn voor een fluorescerend signaal (Figuur 2A). Er is ook een duidelijke breuk in de morfologie van de colonoïde - het centrale lumen is niet langer zichtbaar en de epitheelbarrière is volledig verstoord.
Om het kleurstofsignaal van de celdood te kwantificeren, gebruikten we open-source beeldanalysesoftware om de fluorescerende intensiteit van elke colonoïde te berekenen. Vervolgens hebben we de gegevens genormaliseerd door het gemiddelde van elke aandoening uit te drukken als een percentage van de Max Toxiciteit-behandeling. Na 8 uur was de homeostatische of achtergrondceldood in de BSA-controlecolonoïden relatief laag (7,7% van de maximale toxiciteit) (Figuur 2B). Er waren op dit moment geen statistisch significante veranderingen in celdoodniveaus; aandoeningen die met TNF-α werden behandeld, vertoonden echter een kleine toename van de cytotoxiciteit (Figuur 2B). Na 24 uur waren de celdoodniveaus verhoogd voor alle met cytokines behandelde aandoeningen. Er was echter een minimale verandering in celdood voor de BSA-controleconditie tussen tijdstippen (7,5% van de maximale toxiciteit na 24 uur). De colonoïden behandeld met IFN-γ + TNF-α hadden de grootste toename van celdoodniveaus in vergelijking met BSA-controle (29,4% van de maximale toxiciteit). Het verschil in celdoodniveaus tussen de gecombineerde behandeling en de enkelvoudige cytokinebehandelingen (IFN-γ, TNF-α) was zeer significant. Deze resultaten suggereren de mogelijkheid van een cytotoxische synergetische interactie tussen IFN-γ en TNF-α na 24 uur.
We gebruikten de CPI om de cytotoxische interacties tussen cytokinebehandelingen te kwantificeren en om te bepalen of ze synergetisch waren. Interacties tussen cytokinen worden als synergetisch beschouwd wanneer de CPI-waarde <1 is, additief wanneer =1 of antagonistisch wanneer >1. We berekenden CPI-waarden per tijdstip (Figuur 2C). Na 8 uur vertoonde de CPI-waarde een lichte synergie (0,99), terwijl de CPI-waarde na 24 uur aanzienlijk daalde (0,83). Deze analyse bevestigde dat de interactie tussen IFN-γ en TNF-α na 24 uur synergetisch was. Verder illustreert het hoe synergisme tussen IFN-γ en TNF-α in deze context tijdsafhankelijk is.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66759/66759fig01v2.jpg"> Figuur 1: Schema van de experimentele workflow en probleemoplossing. (A) Schematisch overzicht van het protocol. (B) Representatieve afbeeldingen. (BI) Lichtmicroscopiebeeld dat de optimale dichtheid van de cultuur en de optimale grootte van colonoïden illustreert voordat ze worden gepasseerd voor een test. Schaalbalk = 500 μm. (Bii) Lichtmicroscopiebeeld dat de optimale grootte van colonoïde fragmenten na dissociatie illustreert; Fragmenten rood gemarkeerd. Schaalbalk = 100 μm. (Biii) Lichtmicroscopiebeeld van necrotische colonoïde morfologie na MT-behandeling (met Triton X-100). Schaalbalk = 25 μm. (Biv) Lichtmicroscopiebeeld van twee colonoïden die elkaar overlappen in hetzelfde brandpuntsvlak. Schaalbalk = 25 μm. (Bv) Lichtmicroscopiebeeld van colonoïde celresten aanwezig na passaging; puin rood gemarkeerd. Schaal balk = 25 μm. Afkortingen: ROI = regio van belang; MFI = gemiddelde fluorescentie-intensiteit; MT = Maximale toxiciteit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66759/66759fig01largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66759/66759fig02v2.jpg"> Figuur 2: Kwantitatieve analyse van cytokine-geïnduceerde celdood in menselijke CD-colonoïden. (A) Representatieve live microscopiebeelden van CD-colonoïden behandeld met SYTOX Groene Nucleïnezuurkleuring (fluorescerende celdoodkleurstof) en cytokinen na 8 uur en 24 uur; transmissie- en GFP-kanalen (groene kleur) over elkaar heen gelegd. Colonoïden werden als volgt behandeld: 1) PBS/BSA, 2) 10 ng/ml IFN-γ, 3) 10 ng/ml TNF-α, 4) 10 ng/ml IFN-γ + 10 ng/ml TNF-α. Schaalbalken = 25 μm. (B) Kwantitatieve analyse van CD-colonoïden behandeld met de fluorescerende celdoodkleurstof en cytokines na 8 en 24 uur; de gegevens worden uitgedrukt als een % van de MT-toestand. N = 2 CD-colonoïde lijnen, 11-16 colonoïden afgebeeld per aandoening. (C) CPI berekend per tijdstip met behulp van de dataset van B, N = 2 CD-colonoïde lijnen. Gegevens worden uitgedrukt als middelen ± SE. In B werd een tweezijdige ANOVA-analyse uitgevoerd, gevolgd door Bonferroni-posttests, *P < 0,05, ***P < 0,001 zoals aangegeven. Afkortingen: CD = ziekte van Crohn; GFP = groen fluorescerend eiwit; CPI = coëfficiënt van perturbagen interactie; PBS = fosfaatgebufferde zoutoplossing; BSA = runderserumalbumine; TNF-α = tumornecrosefactor-alfa; IFN-γ = interferon-gamma; MT = Maximale toxiciteit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66759/66759fig02largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Tabel 1: Samenstelling van de cultuurmedia voor het protocol. Om Organoid Proliferation Media te bereiden, combineert u L-WRN geconditioneerde media en Serumvrije Media 1:1 en voegt u vervolgens supplementen toe. Organoïde proliferatiemedia moeten binnen 2 weken na bereiding worden gebruikt. Houd er rekening mee dat alle volledige media moeten worden bewaard bij 4 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66759/66759_Table%201%20(1).xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 2: Experimentele plaatlay-out met 96 putjes en cytokinebehandelingen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66759/66759_Table%202%20(1).xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en kosteneffectieve methode om celdood in menselijke colonorganoïden te onderzoeken en te kwantificeren als reactie op cytotoxische perturbagens zoals cytokines. De aanpak maakt gebruik van een fluorescerende celdoodkleurstof (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), live fluorescentiemicroscopie en open-source beeldanalysesoftware om enkelvoudige organoïde reacties op cytotoxische stimuli te kwantificeren.

Kwantificering van cytokine-geïnduceerde celdood in menselijke colonorganoïden met behulp van live fluorescentiemicroscopie

Intestinal epithelial cell (IEC) death is increased in patients with inflammatory bowel diseases (IBD) such as ulcerative colitis (UC) and Crohn's disease ...

quantification-cytokine-induced-cell-death-human-colonic-organoids

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates a flow cytometry assay to quantify the ROS levels in 3D intestinal organoids obtained from GFP-expressing transgenic mice. This method provides an in vitro experimental model to investigate the efficacy of test compounds on ROS production.

Flow Cytometry Assay to Quantify Oxidative Stress: An Assay to Quantify Reactive Oxygen Species in Intestinal Organoids Using Fluorogenic Probes

Hier wordt een protocol te oogsten, te onderhouden en te behandelen muis dunne darm organoids met pathogeen geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) en Listeria monocytogenes beschreven, alsmede nadruk op genexpressie en correcte normalisatie technieken voor eiwit.

De<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultuur en Pattern Recognition Receptor Stimulatie van de Muis Intestinal Organoids

Dit protocol beschrijft een assay voor de karakterisering van lipide druppel (LD) vorming in humane intestinale organoïden bij stimulatie met vetzuren. We bespreken hoe deze assay wordt gebruikt voor de kwantificering van LD-vorming, en hoe het kan worden gebruikt voor screening met hoge doorvoer voor geneesmiddelen die de LD-vorming beïnvloeden.

Een op fluorescentie gebaseerde assay voor de karakterisering en kwantificering van de vorming van lipiden druppeltjes in humane intestinale Organoïden

Het gepresenteerde protocol maakt gebruik van flow cytometrie om het aantal vermenigvuldigende en dode cellen in gekweekte muisenteroïden te kwantificeren. Deze methode is nuttig om de effecten van medicamenteuze behandeling op organoïde proliferatie en overleving te evalueren.

Kwantificering van proliferative en dode cellen in Enteroïden

Hier beschrijven we een techniek om de barrière-integriteit van kleine darmorganoïden te kwantificeren. Het feit dat de methode is gebaseerd op levende organoïden maakt het sequentiële onderzoek van verschillende barrière-integriteit modulerende stoffen of combinaties daarvan op een tijdopgeloste manier mogelijk.

Onderzoek naar darmbarrière afbraak in levende organoïden

Hier presenteren we een stapsgewijs protocol om volwassen menselijke retinale organoïden te genereren en deze te gebruiken in een fotoreceptortoxiciteitstest om farmaceutische kandidaten te identificeren voor de leeftijdsgebonden retinale degeneratieve ziekte maculaire teleangiëctasieën type 2 (MacTel).

Toxiciteitsscreenings in humane retinale organoïden voor farmaceutische ontdekking

Biopsie-afgeleide intestinale organoïden en organ-on-a-chips technologieën worden gecombineerd in een microfysiologisch platform om regiospecifieke darmfunctionaliteit te recapituleren.

Het combineren van menselijke organoïden en organ-on-a-chip-technologie om intestinale regiospecifieke functionaliteit te modelleren

Hier presenteren we een methode om verbindingen te identificeren die het ADCC-mechanisme moduleren, een belangrijk kankerceldodend mechanisme van antitumorantilichamen. Het cytotoxische effect van NK-cellen wordt gemeten in sferoïden van borstkankercellen in aanwezigheid van Trastuzumab. Beeldanalyse identificeert levende en dode killer- en doelcellen in sferoïden.

Kwantificering van antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit in een tumorsferoïde model: aanvraag voor ontdekking van geneesmiddelen

Tumororganoïden van patiënten zijn een geavanceerd modelsysteem voor fundamenteel en translationeel onderzoek. Dit methodeartikel beschrijft het gebruik van gemultiplexte fluorescerende beeldvorming van levende cellen voor gelijktijdige kinetische beoordeling van verschillende organoïde fenotypes.

Meervoudige beeldvorming met levende cellen voor geneesmiddelresponsen in van patiënten afgeleide organoïdemodellen van kanker

Deze studie maakt gebruik van multi-kleuring fluorescentie-gebaseerde markers van celdood en apoptose in combinatie met confocale microscopie om cytokine-geïnduceerde apoptose en β-celspecifieke dood in pancreaseilandjes te beoordelen. Het onthult ruimtelijke en temporele veranderingen in celdood en apoptose als reactie op extracellulaire stimuli.

Geïsoleerde behandeling van pancreaseilandjes en meting van apoptose

Leer hoe je cytokine-geïnduceerde celdood kwantificeert in menselijke colonorganoïden met live fluorescentiemicroscopie. Deze methode ondersteunt onderzoek naar epitheelcelsterfte en mucosale immunologie.

Kwantificering van cytokine-geïnduceerde celdood in menselijke colonorganoïden met behulp van live fluorescentiemicroscopie

Meer video's verkennen